Name: fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy
Uploaded: 2014-09-11T13:00:00
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This presentation was supported by a Clinical Innovator Award to JLC from the Flight Attendant Medical Research Institute and by the United States Environmental Protection Agency. Although the research described in this article has been funded wholly or in part by the United States Environmental Protection Agency through Cooperative Agreement CR83346301 with the Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology at The University of North Carolina at Chapel Hill, it has not been subjected to the Agency&#8217;s required peer and policy review, and therefore does not necessarily reflect the views of the Agency and no official endorsement should be inferred. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.

1. Herstellung von biologischen Proben für Gefrierbruch-/ Gefrier Etch <ol><li> Verwenden eines herkömmlichen EM Fixiermittelformulierung wie 2% Glutaraldehyd und 2% Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer für 1 Stunde. Primär Fixierung von biologischen Geweben durchzuführen. HINWEIS: Während es wünschenswert, einige Arten von Proben ohne vorherige Fixierung einzufrieren, Universal Blut übertragene Krankheitserreger Vorsichtsmaßnahmen Mandat entsprechende Fixierung, wo die Probe aus menschlichem Gewebe. </li>...

<ol>
	<li>Steere, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+structural+detail+in+frozen+biological+specimens.">Electron microscopy of structural detail in frozen biological specimens.</a> J Biophysic and BiochemCytol. 3, 45-60 (1957).</li><li>Pinto da Silva, P., Branton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+splitting+in+freeze-etching.+Covalently+bound+ferritin+as+a+membrane+marker.">Membrane splitting in freeze-etching. Covalently bound ferritin as a membrane marker.</a> J Cell Biol. 45, 598-605 (1970).</li><li>Friend, D. S., Gilula, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+in+tight+and+gap+junctions+in+mammalian+tissues.">Variations in tight and gap junctions in mammalian tissues.</a> J Cell Biol. 53, 758-776 (1972).</li><li>Branton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fracture+faces+of+frozen+membranes.">Fracture faces of frozen membranes.</a> ProcNatlAcadSci USA. 55, 1048-1056 (1966).</li><li>Heuser, J. E., Reese, T. S., Dennis, M. J., Jan, Y., Jan, L., Evans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicleexocytosiscaptured+by+quick+freezing+and+correlated+with+quantal+transmitter+release.">Synaptic vesicleexocytosiscaptured by quick freezing and correlated with quantal transmitter release.</a> J Cell Biol. 81, 275-300 (1979).</li><li>Goodenough, U. W., Heuser, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substructure+of+inner+dynein+arms,+radial+spokes,+and+the+central+pair/projection+complex+of+cilia+and+flagella.">Substructure of inner dynein arms, radial spokes, and the central pair/projection complex of cilia and flagella.</a> J Cell Biol. 100, 2008-2018 (1985).</li><li>Goodenough, U. W., Heuser, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substructure+of+the+outer+dynein+arm.">Substructure of the outer dynein arm.</a> J Cell Biol. 95, 798-815 (1982).</li><li>Hirokawa, N., Heuser, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quick-freeze,+deep-etch+visualization+of+the+cytoskeleton+beneath+surface+differentiations+of+intestinal+epithelial+cells.">Quick-freeze, deep-etch visualization of the cytoskeleton beneath surface differentiations of intestinal epithelial cells.</a> J Cell Biol. 91, 399-409 (1981).</li><li>Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quick+freeze,+deep+etch+of+the+cytoskeleton.">Quick freeze, deep etch of the cytoskeleton.</a> Methods Enzymol. 134, 598-612 (1986).</li><li>Chandler, D. E., Sharp, W. P., Kuo, J. o. h. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze+fracture+and+freeze+etching.+Electron+Microscopy:+Methods+and+Protocols.">Freeze fracture and freeze etching. Electron Microscopy: Methods and Protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 1117, 95-132 (2014).</li><li>Severs, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze-fracture+electron+microscopy.">Freeze-fracture electron microscopy.</a> Nature Protocols. 2, 547-576 (2007).</li><li>Gilula, N. B., Satir, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ciliary+necklace.+A+ciliary+membrane+specialization.">The ciliary necklace. A ciliary membrane specialization.</a> J Cell Biol. 53, 494-509 (1972).</li><li>Rohatgi, R., Snell, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ciliary+membrane.">The ciliary membrane.</a> CurrOpin Cell Biol. 22, 541-546 (2010).</li><li>Fisch, C. F., Dupuis-Williams, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+cilia+and+flagella-back+to+the+future.">Ultrastructure of cilia and flagella-back to the future.</a> Biol Cell. 103, 249-270 (2011).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C., Rose, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+aspects+of+ciliary+distribution+and+ciliogenesis+in+human+nasal+epithelium.">Morphometric aspects of ciliary distribution and ciliogenesis in human nasal epithelium.</a> Proc Nat Acad Sci. 78, 6996-6999 (1981).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Smith, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+observations+on+the+ultrastructure+of+mammalian+conducting+airway+epithelium:+Application+of+liquid+propane+freezing+and+rotary+shadowing+techniques+to+freeze-fracture.">New observations on the ultrastructure of mammalian conducting airway epithelium: Application of liquid propane freezing and rotary shadowing techniques to freeze-fracture.</a> J Ultrastr Res. 89, 23-33 (1984).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Leigh, M. W., Hu, S. S., Boat, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+organization,+and+function+of+tight+junctional+complexes+in+the+tracheal+epithelium+of+infant+ferrets.">Development organization, and function of tight junctional complexes in the tracheal epithelium of infant ferrets.</a> Am Rev Respir Dis. 138, 666-674 (1988).</li><li>Coyne, C. B., Gambling, T. M., Boucher, R. C., Carson, J. L., Johnson, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+claudin+interactions+in+airway+tight+junctional+permeability.">Role of claudin interactions in airway tight junctional permeability.</a> Am J Physiol. 285, 1166-1178 (2003).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+studies+of+hamster+tracheal+epithelium+in+vivo+and+in+vitro.">Ultrastructural studies of hamster tracheal epithelium in vivo and in vitro.</a> J Ultrastr Res. 70, 70-81 (1979).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+characterization+of+epithelial+cell+membranes+in+normal+human+conducting+airway+epithelium:+A+freeze-fracture+study.">Ultrastructural characterization of epithelial cell membranes in normal human conducting airway epithelium: A freeze-fracture study.</a> Am J Anat. 173, 257-268 (1985).</li><li>Charles, A. C., Naus, C. C. G., Zhu, D., Kidder, G. M., Dirksen, E. R., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+calcium+signaling+via+gap+junctions+in+glioma+cells.">Intercellular calcium signaling via gap junctions in glioma cells.</a> J Cell Biol. 118, 195-201 (1992).</li><li>Sanderson, M. J., Charles, A. C., Dirksen, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stimulation+and+intercellular+communication+increases+intercellular+CA2++in+epithelial+cells.">Mechanical stimulation and intercellular communication increases intercellular CA2+ in epithelial cells.</a> Cell Regul. 1, 585-596 (1990).</li><li>Welsch, F., Stedman, D., Carson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+teratogen+on+[3H]uridine+nucleotide+transfer+between+human+embryonal+cells+and+on+gap+junctions.">Effects of a teratogen on [3H]uridine nucleotide transfer between human embryonal cells and on gap junctions.</a> Exp Cell Res. 159, 91-102 (1985).</li><li>Carson, J. L., Willumsen, N. J., Gambling, T. M., Hu, S. S., Collier, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+intercellular+communication+and+differentiation+in+a+rapidly+developing+mammalian+airway+epithelium.">Dynamics of intercellular communication and differentiation in a rapidly developing mammalian airway epithelium.</a> Am J Respir Cell &amp; Molec Biol. 1, 385-390 (1989).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Clyde, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+membrane+alterations+occurring+in+experimental+Mycoplasma+pneumoniae+infection.">Ciliary membrane alterations occurring in experimental Mycoplasma pneumoniae infection.</a> Science. 206, 349-351 (1979).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+observations+on+cellular+and+subcellular+aspects+of+experimental+Mycoplasma+pneumoniae+disease.">Ultrastructural observations on cellular and subcellular aspects of experimental Mycoplasma pneumoniae disease.</a> Infect &amp; Immun. 29, 1117-1124 (1980).</li><li>Henshaw, N. G., Carson, J. L., Collier, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+observations+of+Pneumocystis+carinii+attachment+to+rat+lung.">Ultrastructural observations of Pneumocystis carinii attachment to rat lung.</a> J Infect Dis. 151, 181-186 (1985).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+appearance+of+compound+cilia+in+the+nasal+mucosa+of+normal+human+subjects+in+response+to+acute,+low+level+sulfur+dioxide+exposure.">The appearance of compound cilia in the nasal mucosa of normal human subjects in response to acute, low level sulfur dioxide exposure.</a> Environ Res. 42, 155-165 (1987).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+airway+epithelial+cell+membranes+among+patients+with+cystic+fibrosis.">Ultrastructure of airway epithelial cell membranes among patients with cystic fibrosis.</a> Hum Pathol. 21, 640-647 (1990).</li><li>Carson, J. L., Brighton, L. E., Collier, A. M., Bromberg, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+ultrastructural+investigations+of+airway+epithelium+following+experimental+exposure+to+defined+air+pollutants+and+lifestyle+exposure+to+tobacco+smoke.">Correlative ultrastructural investigations of airway epithelium following experimental exposure to defined air pollutants and lifestyle exposure to tobacco smoke.</a> InhalToxicol. 25, 134-140 (2013).</li><li>Boonstra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemical+demonstrations+of+cytoplasmic+and+cell-surface+EGF+receptors+in+A431+cells+using+cryo-ultramicrotomy,+surface+replication,+freeze-etching+and+label+fracture.">Immunocytochemical demonstrations of cytoplasmic and cell-surface EGF receptors in A431 cells using cryo-ultramicrotomy, surface replication, freeze-etching and label fracture.</a> J Microscopy. 140, 119-129 (1985).</li><li>Fujimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze-fracture+replica+electron+microscopy+combined+with+SDS+digestion+for+cytochemical+labeling+of+integral+membrane+proteins.+Application+to+the+immunogold+labeling+of+intercellular+junctional+complexes.">Freeze-fracture replica electron microscopy combined with SDS digestion for cytochemical labeling of integral membrane proteins. Application to the immunogold labeling of intercellular junctional complexes.</a> J. Cell Sci. 108, 3443-3449 (1995).</li><li>Quinn, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+tocopherol+on+the+structure+and+permeability+of+phosphatidylcholine+liposomes.">The effect of tocopherol on the structure and permeability of phosphatidylcholine liposomes.</a> J Control Release. 160, 158-163 (2012).</li></ol>

In den Jahren nach seiner Einführung und kommerzielle Verfügbarkeit, Gefrierbruch / Etch Verfahren wurden häufig für Untersuchungen der biologischen Membran-Struktur genutzt. In der Tat haben die besten Perspektiven der einige der strukturellen Spezialisierungen von Membranen in der Gefrierbruch / Etch Präparate erhalten. Diese Studien nicht nur dazu beigetragen, das Verständnis der strukturellen Organisation der Membranen, sondern auch Einblicke in Struktur und Funktion bezogen sind. ...

Das Konzept und die praktische Anwendung der Gefrierbruch-Verarbeitung von biologischen Proben wurde von Steere 1 mehr als die Hälfte vor einem Jahrhundert eingeführt. Die frühe Gerät angeeignet unterschiedlichen Komponenten in einem Arbeits geschlossene Einheit 1. Die ursprüngliche Vorrichtung wurde modifiziert, und um die kritische Notwendigkeit für die Fernmanipulation, Wartung von Hochvakuum aufzunehmen in handelsübliche Instrumente raffiniert, und die Verdampfung von Kohlenstoff und Metallen, um eine geeignete Prüfungs durch Transmissionselektronenmikroskopie (Abbildung 1 und Abbildung Replik zu erzeugen 2). Das typische Instrument besteht aus einer Hochvakuumkammer mit Probentisch und Mikrotom Arm mit regelbaren flüssigem Stickstoff Durch (Abbildung 1). Die Kammer beinhaltet auch zwei Elektronenkanonen, einer zum Stabilisieren Kohlenstoffverdampfung bei 90 ° Winkel zu dem Objekttisch und der andere für plati positioniertnum / Kohlenstoff-Shadowing in einem einstellbaren Winkel, in der Regel 15 ° - 45 ° (Abbildung 2). Stromversorgung des Gerätes wird angewendet, um die Vakuumpumpe zu betreiben und elektronische Tafeln regeln Temperatureinstellung und Elektronenkanone Kontrolle. Ursprünglich als Mittel gedacht, um eine verbesserte Abbildung von Viren zu erreichen, Gefrierbruch als eine Technik für die Untersuchung und Analyse von Zellmembranen und ihre Spezialisierungen 2, 3 gewonnen noch mehr Popularität. In der Tat hat dieses Verfahren schon fester Bestandteil der Aufklärung Struktur / Funktions-Beziehungen in Zellen und Geweben, und viele dieser Studien stehen als klassische Beiträge zur Zell-und Molekularbiologie 4-9. Das Hauptziel und Gründe für die Entwicklung der Gefrierbruchtechnik war Artefakte beobachtbar elektronenmikroskopischen Auflösung, die sich aus chemischen Fixierung und Verarbeitung in herkömmlichen biologischen Elektronenmikroskopie begrenzen. Hier ist das Ziel, chemisch zu begrenzenFixierung und die Probe mit ausreichender Geschwindigkeit und häufig in Gegenwart eines Kälteschutzmittels, um die Bildung von Eiskristallen und andere Einfrieren Artefakte begrenzen einzufrieren. In jüngerer Zeit hat diese Technik ein Wiederaufleben des Interesses von Molekularbiologen und Materialwissenschaften Ermittler zur Untersuchung von Nanopartikeln und Nanomaterialien gefunden. Gefrierbruch-und gefrier Etch Bilder zeigen einen dreidimensionalen Charakter und manchmal irren für rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen. Jedoch sind Gefrierbruch-Zubereitungen durch Transmissionselektronenmikroskopie untersucht und ihre wichtigen Beitrag zur Hochauflösung morphologische Studien ist ihre eindeutige Darstellung der Struktur / Funktionselemente der Zellmembranen. Gefrierbruch-Verarbeitung wird durch Einfrieren von Zellen und Geweben mit ausreichender Geschwindigkeit, um Eis Kristallisation und / oder mit der Verwendung von Tieftemperaturschutzmittel, wie Glycerin begrenzen eingeleitet. Die Proben werden anschließend unter Vakuum und einem Vertreter gebrochenLICA durch Verdampfung von Kohlenstoff und Platin auf der Bruchfläche erzeugt. Die ursprüngliche Probe wird von der Replik, die auf einem Standard-EM Objektgitter abgerufen wird verdaut. Ein weiterer häufiger Fehlinterpretation der Gefrierbruch-Bilder ist, dass sie den Zelloberflächen darzustellen. Jedoch ist die Grundprämisse der Gefrierbruch ist, dass biologische Membranen durch die Lipiddoppelschicht durch die Bruchverfahren (3) aufgeteilt. Dieser Prozess in biologischen Membranen ergibt zwei Bruchflächen, eine, die die Organisation der Hälfte der Membran benachbart zu dem Zytoplasma, der PF-Fläche zeigt, und eine, die die Hälfte der bimolekularen Membranschicht, die angrenzend an die extrazelluläre ist enthüllt Milieu, das EF-Gesicht. Wahre Zelloberflächen sind nicht Gefrierbruch Bilder dargestellt, sondern nur angezeigt werden, wenn der nachfolgende Schritt hinzugefügt gefrier Radierung nach der Bruchverfahren verwendet wird. Um effektiv zu ätzen zuvor gebrochen Proben Oberfläche detai zeigenl, müssen Proben mit einer schnellen Rate und ohne unetchablecryoprotectant eingefroren werden. Ätzen von Wasser von der Oberfläche der gebrochenen Probe enthüllt zugrunde liegenden Funktionen wird durch Positionieren des Kühl Mikrotom Arm über dem Probentisch Erzeugen einer Temperaturdifferenz zwischen der Phase hält die Probe und die Kühl Mikrotom Arm, der bewirkt, daß Wasser von der Oberfläche sublimieren erreicht. Wird Wasser von der Oberfläche der gebrochenen Probe während des Gefriert Ätzen Manöver sublimiert, kann Aspekte der aktuellen Zelloberflächen, extrazelluläre Matrix, Cytoskelett-Strukturen und Molekularanordnungen mit hoher Auflösung offenbart. So Gefrierbruch und gefrier Etch sind nicht austauschbare Begriffe, sondern spiegeln eine schrittweise Prozess von denen die letztere kann nicht je nach den Bedürfnissen der jeweiligen Studie notwendig oder wünschenswert sein. Nach dem Gefrierbruch-/ Gefrier Ätzverfahren, die Bruchflächen sind zu richten Verdampzogentive Mäntel aus Kohlenstoff und Platin, um die Unterstützung und Imaging Gegensatz zu der Replik bieten. Das Platin / Kohlenstoff Abbildungsverdampfung kann unidirektional oder Dreh und wird entweder durch Widerstand oder Elektronenkanonen erfolgt. Unidirektionale Abschattung von einem bekannten Winkel, typischerweise 30 ° - 45 °, ist nützlich bei der Durchführung bestimmter morphometrische Berechnungen. Exemplare, die zu tief Ätzen unterzogen worden sind, in der Regel sind Dreh beschattet und die resultierenden Bilder dieser Proben sind fotografisch für die Bewertung umgekehrt. Die historische sowie ein Ziel der vorliegenden Gefrierbruch-/ Gefrier Ätztechnik ist die chemische Fixierung und Verarbeitung Probe Artefakte, die mit mehr konventionellen Transmissionselektronenmikroskopie Verfahren verbunden sind, begrenzen. Allerdings bietet diese Technik eine wesentliche Vorteil in der Fähigkeit, dreidimensionale Detail verleihen und damit Erwerb von morphometrischen Daten in biologischen, Materialwissenschaften zu erleichtern, und nanotechnology Proben. Gefrierbruch-und gefrier Etch Verfahren sind komplex und vielschichtig und einige Aspekte ihrer Anwendung zugeschnitten sind. Diese Präsentation gibt einen Überblick Ansicht der wichtigsten Funktionen des Prozesses und der Leser wird auf umfassende veröffentlichten Protokollen 10, 11, um die Details anzugehen und gestalten den Prozess für bestimmte Forschungsbedarf bezeichnet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plant</td>
			<td style="width:71px;">Balzers</td>
			<td style="width:119px;">BAF400T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Standard buffers</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">standard aldehyde fixatives</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">sodium dichromate</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">sulfuric acid</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Disposable supplies for Platinum/Carbon Evaporation</td>
			<td style="width:71px;">Technotrade International</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Freon</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Disposable supplies for electron microscopy</td>
			<td style="width:71px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Transmission electron microscope</td>
			<td style="width:71px;">Carl Zeiss Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy

Gefrierbruch-/ Gefrier Etch beschreibt einen Prozess, bei dem Proben, in der Regel biologische oder Nanomaterialien in der Natur, werden eingefroren, zerbrochen, und repliziert werden, um ein Kohlenstoff / Platin für die Untersuchung mittels Transmissionselektronenmikroskopie &quot;cast&quot; beabsichtigt. Proben werden ultraschnellen Gefriergeschwindigkeiten unterworfen, oft in Gegenwart von Kryoschutzmitteln Eiskristallbildung zu begrenzen, mit anschließendem Brechen der Probe in flüssigem Stickstoff gekühlten Temperaturen im Hochvakuum. Die resultierenden gebrochenen Oberfläche repliziert und durch Verdampfung von Kohlenstoff und Platin aus einem Winkel, der Oberfläche verleiht dreidimensionalen Detail auf die Guss stabilisiert. Diese Technik hat sich als besonders aufschlussreich für die Untersuchung von Zellmembranen und ihre Spezialisierungen bewährt und hat sich für das Verständnis der Zellform zu verwandten Zellfunktion bei. In diesem Bericht, die Geräteanforderungen und technisches Protokoll für die Durchführung überblicken wirGefrierbruch, der zugehörige Nomenklatur und Eigenschaften der Bruchflächen, Variationen über das herkömmliche Verfahren und Kriterien für die Interpretation der Gefrierbruch-Bilder. Diese Technik wurde häufig für ultrastrukturelle Untersuchung in vielen Bereichen der Zellbiologie und hält Versprechen als eine aufstrebende bildgebendes Verfahren für die molekulare, Nanotechnologie und Materialwissenschaften Studien.

Der Schlüssel Prämisse der Gefrierbruch-Bild Interpretation ist, dass Bruchflächen durch die Lipid-Doppelschicht von Membranen verleihen beiden Bruchflächen, durch das Übereinkommen der PF-Fläche (Plasma-Fraktur-face) und EF-Gesicht (extrazelluläre Fraktur-face) (Abbildung genannt geben 3). Der PF-Fläche die Hälfte der Membranlipiddoppelschicht angrenzend an das Zytoplasma der Zelle und der EF-Fläche die Hälfte der Membranlipiddoppelschicht angrenzend an das extrazelluläre M...

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Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

Technische Grundlagen Elemente der Gefrierbruch-/ Gefrier Etch in Biological Elektronenmikroskopie

Grundlegende Techniken und Ausgestaltungen der Gefrierbruch-Verarbeitung von biologischen Proben und Nanomaterialien für die Prüfung durch Transmissionselektronenmikroskopie beschrieben. Diese Technik ist eine bevorzugte Methode für die Entdeckung ultrastrukturelle Merkmale und Spezialisierungen von biologischen Membranen und für den Erhalt von ultrastruktureller Ebene dimensionale und räumliche Daten in den Materialwissenschaften und der Nanotechnologie-Produkte.

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Vorbereitung der Embryonen für Elektronenmikroskopie der Drosophila Embryonale Herz Rohr

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Forschung

Biologie

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Zeitraffer-Mikroskopie der frühen Embryogenese in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

Mikroskopie von Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Charakterisierung von Verkalkungen Events Verwendung von Live-optische und Elektronenmikroskopie-Techniken in einem Marine-Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Vorbereitung und Beobachtung von Dick biologischen Proben durch Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Biologische Probenvorbereitung durch Hochdruck gefrieren, Mikrowellen-gestützte Kontrastverstärkung und minimale Harz einbetten für Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

Serielle Block-Face-Rasterelektronenmikroskopie (SBF-REM) biologischer Gewebeproben

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...