Name: collection and extraction of saliva dna for next generation sequencing
Uploaded: 2014-08-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing at JoVE.com

This work was funded by a National Institutes of Health R01 (DC009453 support to CWB).

הערה: לפני מתן דגימות רוק כל הנושאים נתנו הסכמה מדעת התואמת את הקווים המנחים לטיפול בבני אדם בבית החולים לילדים בפריסה ארצית. .1 רוק איסוף ואחסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני אוסף רוק, להבטיח כי הפה של הנושא הוא ללא מ?...

<ol>
	<li>Quinque, D., Kittler, R., Kayser, M., Stoneking, M., Nasidze, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+saliva+as+a+source+of+human+DNA+for+population+and+association+studies.">Evaluation of saliva as a source of human DNA for population and association studies.</a> Analytical Biochemistry. 353, 272-277 (2006).</li><li>Min, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+mircosatellite+and+SNP+genotyping+success+rates+established+in+a+large+number+of+genomic+DNA+samples+extracted+from+mouth+swabs+and+genotypes.">High mircosatellite and SNP genotyping success rates established in a large number of genomic DNA samples extracted from mouth swabs and genotypes.</a> Twin Research and Human Genetics. 9, 501-506 (2006).</li><li>Dlugos, D. J., Scattergood, T. M., Ferraro, T. N., Berrettinni, W. H., Buono, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+rates+and+fear+of+phlebotomy+in+pediatric+patients+in+a+genetic+study+of+epilepsy.">Recruitment rates and fear of phlebotomy in pediatric patients in a genetic study of epilepsy.</a> Epilepsy &amp; Behavior. 6, 444-446 (2005).</li><li>Etter, J. F., Neidhart, E., Bertand, S., Malafosse, A., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collecting+saliva+by+mail+for+genetic+and+cotinine+analyses+in+participants+recruited+through+the+internet.">Collecting saliva by mail for genetic and cotinine analyses in participants recruited through the internet.</a> European Journal of Epidemiology. 20, 833-838 (2005).</li><li>Hansen, T. V., Simonsen, M. K., Nielsen, F. C., Hundrup, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collection+of+blood,+saliva,+and+buccal+cell+samples+in+a+pilot+study+on+the+danish+nurse+cohort:+Comparison+of+the+response+rate+and+quality+of+genomic+DNA.">Collection of blood, saliva, and buccal cell samples in a pilot study on the danish nurse cohort: Comparison of the response rate and quality of genomic DNA.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 16, 2072-2076 (2007).</li><li>Van Schie, R. C. A. A., Wilson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saliva:+A+convenient+source+of+DNA+for+analysis+of+bi-allelic+polymorphisms+of+fc&#947;+receptor+iia+(cd32)+and+fc&#947;+receptor+iiib+(cd16).">Saliva: A convenient source of DNA for analysis of bi-allelic polymorphisms of fc&#947; receptor iia (cd32) and fc&#947; receptor iiib (cd16).</a> Journal of Immunological Methods. 208, 91-101 (1997).</li><li>Dawes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimates,+from+salivary+analyses,+of+the+turnover+time+of+oral+mucosal+epithelium+in+humans+and+the+number+of+bacteria+in+an+edentulous+mouth.">Estimates, from salivary analyses, of the turnover time of oral mucosal epithelium in humans and the number of bacteria in an edentulous mouth.</a> Archives of Oral Biology. 48, 329-336 (2003).</li><li>Bahlo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saliva-derived+DNA+performs+well+in+large-scale,+high-density+single-nucleotide+polymorphism+microarray+studies.">Saliva-derived DNA performs well in large-scale, high-density single-nucleotide polymorphism microarray studies.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 19, 794-798 (2010).</li><li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+performance+between+saliva+and+blood-derived+genomic+dnas+on+the+dmet+array:+A+comparison.">Genotyping performance between saliva and blood-derived genomic dnas on the dmet array: A comparison.</a> PLoS ONE. 7 (3), e33968 (2012).</li><li>Simmons, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+genotype-phenotype+model+determinism:+Application+to+bivariate+reading/language+traits+and+epistatic+interactions+in+language-impaired+families.">Increasing genotype-phenotype model determinism: Application to bivariate reading/language traits and epistatic interactions in language-impaired families.</a> Human Heredity. 70, 232-244 (2010).</li><li>Zeugin, J. A., Hartley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+precipitation+of+DNA.">Ethanol precipitation of DNA.</a> Focus. 7, 1-2 (1985).</li><li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+Transform.">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler Transform.</a> Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).</li><li>McKenna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genome+Analysis+Toolkit:+a+MapReduce+framework+for+analyzing+next-generation+DNA+sequencing+data.">The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data.</a> Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).</li><li>DePristo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+framework+for+variation+discovery+and+genotyping+using+next-generation+DNA+sequencing+data.">A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data.</a> Nature Genetics. 43, 491-498 (2011).</li></ol>

ההליך הנוכחי הוא פרוטוקול מיצוי DNA מותאם שהשתפר במידה ניכרת תשואה של DNA משקל המולקולרי הגבוה בהשוואה לשיטות סטנדרטית, מבלי להתפשר על איכות DNA. השלב הקריטי עם ההשפעה הגדולה ביותר על התשואה ביותר היה צעד 5.2, הכולל צעד צנטריפוגה כבר במהלך משקעים אתנול מכל פרוטוקול שפורסם ...

קבלת DNA באיכות גבוהה עבור מחקרים גנטיים אנושיים היא חיונית בתהליך גילוי גנים למחלות. דם, אם כי דורש הליך פולשני וגם להיות יקר יותר מאשר אוסף רוק, הוא מועדף ליצירת שורות תאים הונצחו כמקור אינסופי של DNA, או iPSCs ללימודים פונקציונליים, ולפעמים DNA הדם משמש בעת שורות תאים אינן זמינות. עם זאת, קבלת דם דורשת phlebotomist מאומן ויש לו דם מחצית חיים קצרים יותר מאשר רוק 1. DNA מרוק הוא פחות יקר וקל יותר להשגה, שכן הוא יכול להיות שנאסף ונשלח באמצעות הדואר ללא הצורך בphlebotomist, ובכך להגדיל בריכות נושא הפוטנציאל הרבה מעבר לאגן ההיקוות של בתי חולים ומעבדות 2. הרשמה למחקר ניתן לשפר את האיכות יש לי נושאים האפשרות של מתן דגימת רוק במקום דם 3, 4. חששות לגבי הכמות והאיכות של DNA מרוק יכולים להיות המוגבלים הנרחבדואר למרות מחקרים שנעשה לאחרונה מחקרים רבים המראים את התאמתו של כל רוק, עם ממוצע של 4.3 x 10 5 תאים למיליליטר, לבדיקות DNA על פני שיטות מטליות buccal המבוגרות שלא לקבל כמויות משמעותיות של רוק 2, 3, 4, 5, 6. בעוד ספרות צנועה קיימת מראה את ההתאמה של DNA רוק השלם נגזר עבור יישומי גנוטיפ כולל שיטות המבוסס על microarray 8, 9, רצף 10, אין מחקרים בחנו הדור הבא (NGS). המטרה לייעול פרוטוקול חילוץ זה כל DNA הרוק הייתה למקסם את הכמות ואיכות עבור יישומי גנטיקה בדרך יעילה עלות שמיושמת בקלות במעבדות עם חומרים כימיים וחומרים נפוצים. מיצוי DNA מרוק דורש מספר הליכים: 1) איסוף ואחסון, טיפול RNase 2) תמוגה תא, 3), 4) ממטרים חלבון, 5) משקעים אתנול, 6) להחזרת נוזלי DNA. פתרון DNA ייצוב הצפת, שתוארבעבר 2, פונקציות כראוי ללא שינוי. שום ניסיון לייעל את טיפול RNase וצעדים להחזרת נוזלי DNA נעשה. לכל שלב שנותר, מספר משתנה שיכול להשפיע על תשואה זוהו. כל אחד ממשתנים היו מניפולציות באופן אישי ושיפור בתפוקה ואיכות הוערך סטטיסטי. עבור משתנים שהוצגו כדי לשפר את התשואה ו / או איכות DNA, הערכים אופטימליים נכללו בפרוטוקול הסופי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="260">
	<tbody>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:88px;">15ml Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:88px;">Fisher</td>
			<td style="width:84px;">12-565-268</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:88px;">Cell Lysis Solution</td>
			<td style="width:88px;">Qiagen</td>
			<td style="width:84px;">158908</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:88px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:88px;">Sigma</td>
			<td style="width:84px;">P6556</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:88px;">Protein Precipitation Solution</td>
			<td style="width:88px;">Qiagen</td>
			<td style="width:84px;">158912</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:88px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:88px;">Fisher</td>
			<td style="width:84px;">A416-4</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:88px;">Glycogen</td>
			<td style="width:88px;">EZ-BioResearch</td>
			<td style="width:84px;">S1003</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:88px;">70% Ethanol</td>
			<td style="width:88px;">Fisher</td>
			<td style="width:84px;">04-355-305</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:88px;">Tris-EDTA (TE)</td>
			<td style="width:88px;">Fisher</td>
			<td style="width:84px;">BP2473-1</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:88px;">NaCl</td>
			<td style="width:88px;">Fisher</td>
			<td style="width:84px;">AC194090010</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:88px;">Tris HCl</td>
			<td style="width:88px;">Fisher</td>
			<td style="width:84px;">BP1757-100</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:88px;">EDTA(0.5M) Solution</td>
			<td style="width:88px;">Fisher</td>
			<td style="width:84px;">03-500-506</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:88px;">Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td style="width:88px;">Fisher</td>
			<td style="width:84px;">BP166-100&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:88px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:88px;">Distributor</td>
			<td style="width:84px;">Catalog#</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:88px;">Analog Vortex Mixer</td>
			<td style="width:88px;">Fisher</td>
			<td style="width:84px;">02-215-365</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:88px;">Centrifuge 5810R</td>
			<td style="width:88px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:84px;">5811 000.010</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection and extraction of saliva dna for next generation sequencing

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality DNA. However, DNA extraction from saliva can yield high quality DNA with little to no degradation/fragmentation that is suitable for a variety of DNA assays without the expense of a phlebotomist and can even be acquired through the mail. However, at present, no saliva DNA collection/extraction protocols for next generation sequencing have been presented in the literature. This protocol optimizes parameters of saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for DNA assays with the highest standards, including microarray genotyping and next generation sequencing.

כדי לקבוע פרמטרים אופטימליים להפקה DNA סדרה של עקירות DNA מזווגות בוצעה. דגימת רוק אחת פוצלה וכל מנה שנבדקה עם אחד משני ערכים אפשריים עבור משתנה נתון. לפחות שמונה חזרות של כל בדיקה לזווג בוצעו (למשל, דגימת רוק אחת הייתה aliquoted לבדוק חילוץ עם או בלי הדגירה C ° 50 ראשונית)....

Watch this Scientific Journal Video about Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing at JoVE.com

Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

איסוף והפקת DNA רוק לסידור הדור הבא

DNA extraction from saliva can provide a readily available source of high molecular weight DNA, with little to no degradation/fragmentation. This protocol provides optimized parameters for saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for downstream DNA assays with high quality requirements.

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Generation of Alginate Microspheres for Biomedical Applications

דור של אלגינט microspheres עבור יישומים ביו

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and ...

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

The ÃƒÅ½Ã‚Â±-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

Α-מבחן: ראפיד נייד ללא ספירת CD4 באמצעות הרוק שלם

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time ...

Collection Protocol for Human Pancreas

אוסף פרוטוקול לבלב אנוש

This dissection and sampling procedure was developed for the Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) program to standardize preparation ...

Sampling Human Indigenous Saliva Peptidome Using a Lollipop-Like Ultrafiltration Probe: Simplify and Enhance Peptide Detection for Clinical Mass Spectrometry

רוק הדגימה האדם Peptidome ילידים באמצעות בדיקה Lollipop-Like Ultrafiltration: פשט ולשפר גילוי פפטיד של ספקטרומטריית מסה קלינית

Although human saliva proteome and peptidome have been revealed 1-2 they were majorly identified from tryptic digests of saliva proteins. Identification ...

Collecting Saliva and Measuring Salivary Cortisol and Alpha-amylase in Frail Community Residing Older Adults via Family Caregivers

Salivary measures have emerged in bio-behavioral research  that are easy-to-collect, minimally invasive, and relatively inexpensive  biologic markers of ...

A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies

A Next-generation Tissue Microarray ngTMA Protocol for Biomarker Studies

פרוטוקול Microarray רקמות הדור הבא (ngTMA) לביומרקר לימודים

Biomarker research relies on tissue microarrays (TMA). TMAs are produced by repeated transfer of small tissue cores from a &#8216;donor&#8217; block into ...

Integration of Wet and Dry Bench Processes Optimizes Targeted Next-generation Sequencing of Low-quality and Low-quantity Tumor Biopsies

אינטגרציה של Wet ותהליכי ספסל יבשים מבצעת אופטימיזציה ממוקד רצף הדור הבא של איכות נמוכה וביופסיות גידול נמוכה כמות

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using ...

Whole Genome Sequencing of Candida glabrata for Detection of Markers of Antifungal Drug Resistance

Whole Genome Sequencing of Candida glabrata for Detection of Markers of Antifungal Drug Resistance

הגנום כולו רצף של קנדידה glabrata עבור זיהוי של סמנים של פטריות תרופתיים

Candida glabrata can rapidly acquire mutations that result in drug resistance, especially to azoles and echinocandins. Identification of genetic mutations ...

On-Site Sampling and Extraction of Brain Tumors for Metabolomics and Lipidomics Analysis

באתר דגימה וחילוץ של גידולים במוח עבור מטבולומיקה וניתוח Lipidomics

Despite the variety of tools available for cancer diagnosis and classification, methods that enable fast and simple characterization of tumors are still ...

Microscopic Characterization and TLC-Based Identification of Rhodiola crenulate

Field Collection and Laboratory Routine Identification of Rhodiola crenulata

Author Spotlight: Developing Identification Methods for Rhodiola crenulata and Investigating Its Resource Distribution and Pharmacological Effects

איסוף שדה וזיהוי שגרתי במעבדה של רודיולה קרנולטה

The identification of medicinal materials is the premise and guarantee of drug safety. The majority of scientific researchers are bound to favor the ...