Name: expression of recombinant cellulase cel5a from trichoderma reesei in tobacco plants
Uploaded: 2014-06-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo BMBF Forschungsinitiative &quot;Bioenergie 2021 - Forschung für die Nutzung von Biomasse&quot; eo Cluster de Excelência &quot;Combustíveis sob medida a partir de biomassa&quot;, que é financiado através da Iniciativa de Excelência pelos governos federal e estaduais alemães para promover a ciência e pesquisa em universidades alemãs.

1. Crescimento do tipo selvagem de N. tabacum plantas <ol><li> Para crescer N. tabacum L. cv. Plantas Petit Havana SR1 no solo, colocar sementes de tabaco em potes adequados cheios de envasamento solo normal para a germinação. Após 2 semanas, a transferência de mudas para vasos individuais. Incubar as plantas em uma estufa com constante de 22 ° C (período escuro) ou 25 ° C (período de luz) e 70% de umidade relativa do ar. Fornecer iluminação em um ciclo claro / escuro 16/8 h luz (por ex...

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	<li>Garvey, M., Klose, H., Fischer, R., Lambertz, C., Commandeur, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulases+for+biomass+degradation:+comparing+recombinant+cellulase+expression+platforms.">Cellulases for biomass degradation: comparing recombinant cellulase expression platforms.</a> Trends in Biotechnology. 31, 581-593 (2013).</li><li>Klose, H., G&#252;nl, M., Usadel, B., Fischer, R., Commandeur, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+inducible+expression+of+a+mesophilic+cellulase+avoids+adverse+effects+on+plant+development.">Ethanol inducible expression of a mesophilic cellulase avoids adverse effects on plant development.</a> Biotechnology for Biofuels. 6, 53 (2013).</li><li>Klose, H., R&#246;der, J., Girfoglio, M., Fischer, R., Commandeur, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperthermophilic+endoglucanase+for+in+planta+lignocellulose+conversion.">Hyperthermophilic endoglucanase for in planta lignocellulose conversion.</a> Biotechnology for Biofuels. 5, 63 (2012).</li><li>Sharma, A. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulase+linkers+are+optimized+based+on+domain+type+and+function:+Insights+from+sequence+analysis,+biophysical+measurements,+and+molecular+simulation.">Cellulase linkers are optimized based on domain type and function: Insights from sequence analysis, biophysical measurements, and molecular simulation.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Boonvitthya, N., Bozonnet, S., Burapatana, V., O'Donohue, M. J., Chulalaksananukul, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+heterologous+expression+of+Trichoderma+reesei+endoglucanase+II+and+cellobiohydrolase+II+in+the+yeasts+Pichia+pastoris+and+Yarrowia+lipolytica.">Comparison of the heterologous expression of Trichoderma reesei endoglucanase II and cellobiohydrolase II in the yeasts Pichia pastoris and Yarrowia lipolytica.</a> Molecular Biotechnology. 54, 158-169 (2013).</li></ol>

A expressão recombinante de celulases é um campo de grande interesse, devido ao desejo de sistemas de produção de biocombustíveis mais eficientes 1. As plantas oferecem muitas possibilidades para a produção de celulase de sucesso, com recursos como técnicas de colheita econômica e métodos autohydrolysis sendo propriedades muito desejáveis ​​para a produção de biocombustíveis em larga escala. Além disso, o uso de diferentes localizações para a produção de proteínas de permitir, se neces...

<html> Degradação de biomassa lignocelulósica e sua conversão em combustível líquido foi concebido como um método para reduzir a dependência dos combustíveis fósseis. Um obstáculo significativo na criação de sistemas de processamento de biomassa é economicamente viáveis ​​na degradação enzimática da celulose e hemicelulose 1. Os sistemas de expressão de plantas apresentam um grande potencial para a produção de enzimas a uma escala industrial. Agricultura, sistemas para instalações de colheita economicamente e em termos de volume já estão estabelecidos, como têm sido há milhares de anos. A produção de celulases em plantas é desejável devido a factores tais como a facilidade de autohydrolysis 2, e o potencial para maximizar o uso de níveis mais baixos de enzima, aumentando a digestibilidade das paredes das células das plantas 1. Finalmente, sistemas de plantas permitir o direccionamento das proteínas recombinantes para áreas específicas de células de plantas e são capazes de modificar posttranslationally enzimas onde requeridas 3. ve_content &quot;&gt; Nicotiana tabacum (tabaco) é muito comumente utilizado como um organismo modelo para estudos de expressão de proteínas heterólogas em plantas, devido ao seu rápido crescimento e de biomassa de acumulação de recursos 4. A expressão transitória de proteínas recombinantes é uma técnica que permite a produção de proteína em períodos de tempo curtos 5, enquanto mantém a flexibilidade como para a localização e, portanto, as modificações pós-traducionais das proteínas seleccionadas, ou seja, celulases. Isso permite a produção de celulase (s) para a análise básica, ao mesmo tempo, preparando o terreno para novas estratégias de expressão em plantas. Usando essa estratégia expressão transitória, uma endoglucanase de glicosil hidrolases da família 5, Cel5A, derivado do hospedeiro do fungo Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) 6 é produzido (doravante referida como TrCel5A). TrCel5A é uma proteína de 42 kDa, que é nativamente glicosilada e é altamente ativo em hidráulicaroylzing cadeias de celulose 7. A técnica de expressão transitória descrito aqui baseia-se num sistema relativamente comumente utilizado, infiltrando-se as folhas das plantas com a Agrobacterium transportando o gene de interesse num vector de expressão apropriado. Para permitir a análise rápida de expressão bem sucedida em planta, TrCel5A também pode ser expressa como uma proteína de fusão com mCherry, uma proteína fluorescente monomérica originalmente derivada de Discosoma sp. Proteína dsRed 8, com um período adicional de seis resíduos de histidina (His-tag) fundido com a o C-terminal (TrCel5A-mCherry). Expressão da proteína de fusão heteróloga, TrCel5A-mCherry, pode, assim, ser controlada dentro da planta em crescimento usando luz verde para examinar mCherry dispersão. Se desejado, as secções finas de material de planta pode ser examinado sob luz verde ao microscópio para estabelecer a localização específica da proteína. Para este trabalho, sinal e transentar péptidos foram incorporadas na construção para a localização da exportação da proteína heteróloga para o retículo endoplasmático 9. Para analisar a actividade de plantas, incluindo as celulases expressas TrCel5A, uma série de testes de actividade de celulase pode ser executado. Após a extracção do total de proteínas vegetais solúveis, TrCel5A podem ser parcialmente purificadas utilizando uma técnica de incubação térmica. O tamanho da proteína é efectuada por meio de SDS-PAGE seguido por Western blot. Zimografia pode ser utilizado para analisar a actividade contra os substratos, por exemplo, de celulose, que foi carboxi-metilado (fazendo carboximetilcelulose: CMC) para a solubilidade 10. Actividade de celulase e glicosidase pode ser monitorizada utilizando o fluoróforo 4-metilumbeliferilo (4-MU), associada com β-D-celobiósido (combinados: 4-MUC). Outro método para avaliar a actividade de endoglucanase envolve a análise de espectrometria de CMC que tem sido associado com um azo-dye (Remazolbrilliant Blue R) 11. Além disso, a actividade da proteína de ambas as endoglucanases e uma variedade de celulases pode ser monitorizado pela utilização de um teste de análise de açúcar, tais como a hidrazida de p-hidroxi-benzóico (PAHBAH) ensaio de 12. Estas técnicas podem ser utilizados para elucidar e quantificar a actividade da celulase expressa de interesse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="823">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:308px;">4-methylumbelliferyl &#946;-D-cellobioside</td>
			<td style="width:127px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:156px;">M6018</td>
			<td style="width:232px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic acid</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>3738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetosyringon (concentrated)</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotic - kanamycin</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>T832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotic - rifampicin</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>4163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotic - carbenicillin</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>6344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibody - rabbit anti His(6) pAb</td>
			<td>ROCKLAND</td>
			<td>600-401-382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibody - goat anti rabbit AP, FC pAb</td>
			<td>DIANOVA</td>
			<td>111-055-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Azo-carboxymethyl cellulose</td>
			<td>MEGAZYME</td>
			<td>S-ACMC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>C4805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carboxymethyl cellulose</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>3333.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>C2730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Congo red</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>75768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Coomasie brilliant blue G 250</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>9598.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D(+)-glucose</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>8337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>K928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter paper - Rotilabo blotting paper</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>CL67</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NBT/BCIP</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>72091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MES buffer</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>4256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>8388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium citrate</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>3580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium dodecylsulfate</td>
			<td>SERVA</td>
			<td>20765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>6771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Soil, Einheitserde classic&#160;</td>
			<td>PATZER GMBH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectrometer - Infinite M200</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S-5390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4-Hydroxy benzhydrazide&#160;</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>H9882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>1058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UV light source - BLAK RAY</td>
			<td>UVP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vibratome - VT1000S</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of recombinant cellulase cel5a from trichoderma reesei in tobacco plants

Enzimas degradantes Celulose, celulases, são alvos de pesquisa e interesses industriais. A preponderância destas enzimas in-a-cultura difíceis organismos, tais como fungos de construção de hifas e bactérias anaeróbias, acelerou o uso de tecnologias recombinantes neste campo. Métodos de expressão de plantas são um sistema conveniente para a produção em grande escala de enzimas e outras proteínas industrialmente úteis. Nisto, os métodos para a expressão transiente de uma endoglucanase de fungos, Trichoderma reesei Cel5A, Nicotiana tabacum são demonstradas. A expressão da proteína de sucesso é mostrado, monitorizada por fluorescência utilizando uma proteína de fusão mCherry enzima. Além disso, um conjunto de ensaios de base são usadas para examinar a actividade de T. expresso transitoriamente reesei Cel5A, incluindo SDS-PAGE, Western blot, zimografia, bem como a fluorescência e ensaios de degradação de substrato à base de corantes. O sistema aqui descrito pode ser usado para produzir uma célula activaULASE em um curto período de tempo, de modo a avaliar o potencial de produção em plantas através de sistemas de expressão constitutiva ou induzida.

TrCel5A e TrCel5A-mCherry foram expressos com sucesso em plantas do tabaco usando o sistema de expressão transiente (Figuras 1A e 1B). O exame do modelo da proteína de fusão TrCel5A-mCherry expressão revelado folhas saudáveis ​​(Figura 1C), que mostrou a expressão de proteínas largamente espalhada sob luz verde (Figura 1D). Extracção das proteínas totais foi realizada em plantas de tabaco que tinham folhas que ...

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Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

As plantas de tabaco foram utilizadas para produzir uma celulase fúngica, TrCel5A, através de um sistema de expressão transiente. A expressão pode ser controlada por meio de uma proteína de fusão fluorescente, e a actividade da proteína foi caracterizada pós-expressão.

Expressão da proteína recombinante a partir da celulase Cel5A<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; Em Plantas de tabaco

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture ...

Research

JoVE Journal

Environment

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

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Ambiente

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