Name: averaging of viral envelope glycoprotein spikes from electron cryotomography reconstructions using jsubtomo
Uploaded: 2014-10-21T13:00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo at JoVE.com

This work was supported by the Academy of Finland (130750 and 218080 to J.T.H.), the Wellcome Trust (090532/Z/09/Z; 089026/Z/09/Z to T.A.B.), and by the MRC (MR/J007897/1 to J.T.H and T.A.B; MR/L009528/1 to T.A.B.).

<ol>
	<li>Nickell, S., Mihalache, O., Beck, F., Hegerl, R., Korinek, A., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+the+26S+proteasome+by+cryoelectron+tomography.">Structural analysis of the 26S proteasome by cryoelectron tomography.</a> Biochemical and biophysical research communications. 353 (1), 115-120 (2007).</li><li>Goldie, K. N., Wedig, T., Mitra, A. K., Aebi, U., Herrmann, H., Hoenger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+3-D+structure+of+vimentin+intermediate+filaments+by+cryo-electron+tomography.">Dissecting the 3-D structure of vimentin intermediate filaments by cryo-electron tomography.</a> Journal of structural biology. 158 (3), 378-385 (2007).</li><li>Cheng, Y., Boll, W., Kirchhausen, T., Harrison, S. C., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography+of+clathrin-coated+vesicles:+structural+implications+for+coat+assembly.">Cryo-electron tomography of clathrin-coated vesicles: structural implications for coat assembly.</a> Journal of molecular biology. 365 (3), (2007).</li><li>Gr&#252;newald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+herpes+simplex+virus+from+cryo-electron+tomography.">Three-dimensional structure of herpes simplex virus from cryo-electron tomography.</a> Science. 302 (5649), 1396-1398 (2003).</li><li>Murphy, G. E., Leadbetter, J. R., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+structure+of+the+complete+Treponema+primitia+flagellar+motor.">In situ structure of the complete Treponema primitia flagellar motor.</a> Nature. 442 (7106), 1062-1064 (2006).</li><li>Medalia, O., Weber, I., Frangakis, A., Nicastro, D., Gerisch, G., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+architecture+in+eukaryotic+cells+visualized+by+cryoelectron+tomography.">Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography.</a> Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).</li><li>Heymann, J. B., Cardone, G., Winkler, D. C., Steven, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+resources+for+cryo-electron+tomography+in+Bsoft.">Computational resources for cryo-electron tomography in Bsoft.</a> Journal of structural biology. 161 (3), 232-242 (2008).</li><li>Kremer, J., Mastronarde, D., McIntosh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of structural biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Casta&#241;o-D&#237;ez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamo:+a+flexible,+user-friendly+development+tool+for+subtomogram+averaging+of+cryo-EM+data+in+high-performance+computing+environments.">Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments.</a> Journal of structural biology. 178 (2), 139-151 (2012).</li><li>Hrabe, T., Chen, Y., Pfeffer, S., Cuellar, L. K., Mangold, A. -. V., F&#246;rster, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PyTom:+a+python-based+toolbox+for+localization+of+macromolecules+in+cryo-electron+tomograms+and+subtomogram+analysis.">PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis.</a> Journal of structural biology. 178 (2), 177-188 (2012).</li><li>Fern&#225;ndez, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+methods+for+electron+tomography.">Computational methods for electron tomography.</a> 43 (10), 1010-1030 (2012).</li><li>Briggs, J. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+in+situ--the+potential+of+subtomogram+averaging).">Structural biology in situ--the potential of subtomogram averaging).</a> Current opinion in structural biology. 23 (2), 261-267 (2013).</li><li>Frangakis, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+macromolecular+complexes+in+cryoelectron+tomograms+of+phantom+cells.">Identification of macromolecular complexes in cryoelectron tomograms of phantom cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14153-14158 (2002).</li><li>Zanetti, G., Briggs, J. A. G., Gr&#252;newald, K., Sattentau, Q. J., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomographic+structure+of+an+immunodeficiency+virus+envelope+complex+in+situ.">Cryo-electron tomographic structure of an immunodeficiency virus envelope complex in situ.</a> PLoS pathogens. 2 (8), (2006).</li><li>Liu, J., Bartesaghi, A., Borgnia, M. J., Sapiro, G., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+native+HIV-1+gp120+trimers.">Molecular architecture of native HIV-1 gp120 trimers.</a> Nature. 455 (7209), (2008).</li><li>Meyerson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+molecular+structures+of+HIV+envelope+glycoproteins+using+cryo-electron+tomography+and+automated+sub-tomogram+averaging.">Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (58), (2011).</li><li>Baker, T. S., Olson, N. H., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adding+the+third+dimension+to+virus+life+cycles:+three-dimensional+reconstruction+of+icosahedral+viruses+from+cryo-electron+micrographs.">Adding the third dimension to virus life cycles: three-dimensional reconstruction of icosahedral viruses from cryo-electron micrographs.</a> Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 63 (4), 862-922 (1999).</li><li>Huiskonen, J. T., Butcher, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-containing+viruses+with+icosahedrally+symmetric+capsids.">Membrane-containing viruses with icosahedrally symmetric capsids.</a> Current opinion in structural biology. 17 (2), 229-236 (2007).</li><li>Liljeroos, L., Huiskonen, J. T., Ora, A., Susi, P., Butcher, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryotomography+of+measles+virus+reveals+how+matrix+protein+coats+the+ribonucleocapsid+within+intact+virions.">Electron cryotomography of measles virus reveals how matrix protein coats the ribonucleocapsid within intact virions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (44), (2011).</li><li>Arranz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+native+influenza+virion+ribonucleoproteins.">The structure of native influenza virion ribonucleoproteins.</a> Science. 338 (6114), 1634-1637 (2012).</li><li>Karotki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eisosome+proteins+assemble+into+a+membrane+scaffold.">Eisosome proteins assemble into a membrane scaffold.</a> Journal of Cell Biology. 195 (5), 889-902 (2011).</li><li>Pietil&#228;, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virion+architecture+unifies+globally+distributed+pleolipoviruses+infecting+halophilic+archaea.">Virion architecture unifies globally distributed pleolipoviruses infecting halophilic archaea.</a> Journal of virology. 86 (9), 5067-5079 (2012).</li><li>Huiskonen, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryotomography+of+Tula+hantavirus+suggests+a+unique+assembly+paradigm+for+enveloped+viruses.">Electron cryotomography of Tula hantavirus suggests a unique assembly paradigm for enveloped viruses.</a> Journal of virology. 84 (10), 4889-4897 (2010).</li><li>Bowden, T. A., Bitto, D., McLees, A., Yeromonahos, C., Elliott, R. M., Huiskonen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthobunyavirus+ultrastructure+and+the+curious+tripodal+glycoprotein+spike.">Orthobunyavirus ultrastructure and the curious tripodal glycoprotein spike.</a> PLoS pathogens. 9 (5), (2013).</li><li>Maurer, U. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Structure+of+Herpesvirus+Fusion+Glycoprotein+B-Bilayer+Complex+Reveals+the+Protein-Membrane+and+Lateral+Protein-Protein+Interaction.">The Structure of Herpesvirus Fusion Glycoprotein B-Bilayer Complex Reveals the Protein-Membrane and Lateral Protein-Protein Interaction.</a> Structure. 21 (8), 1396-1405 (1993).</li><li>Gan, L., Ladinsky, M. S., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+in+a+marine+picoeukaryote+is+a+disordered+assemblage+of+nucleosomes.">Chromatin in a marine picoeukaryote is a disordered assemblage of nucleosomes.</a> Chromosoma. 122 (5), 377-386 (2013).</li><li>Scheres, S. H. W., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+overfitting+in+cryo-EM+structure+determination.">Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination.</a> Nature. 9 (9), 853-854 (2012).</li><li>Heymann, J. B., Belnap, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bsoft:+image+processing+and+molecular+modeling+for+electron+microscopy.">Bsoft: image processing and molecular modeling for electron microscopy.</a> Journal of structural biology. 157 (1), 3-18 (2007).</li><li>Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+density+maps+with+UCSF+Chimera.">Visualizing density maps with UCSF Chimera.</a> Journal of structural biology. 157 (1), 281-287 (2007).</li><li>Faini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structures+of+COPI-coated+vesicles+reveal+alternate+coatomer+conformations+and+interactions.">The structures of COPI-coated vesicles reveal alternate coatomer conformations and interactions.</a> Science. 336 (6087), 1451-1454 (2012).</li><li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabs+enable+single+particle+cryoEM+studies+of+small+proteins.">Fabs enable single particle cryoEM studies of small proteins.</a> Structure. 20 (4), 582-592 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> ידע של מבנה ספייק גליקופרוטאין הנגיפי על קרום virion הוא חיוני להבנת שכפול נגיף ופיתוח תרופות לטיפול ולמניעת זיהום. cryo-מיקרוסקופ אלקטרונים בשילוב עם מיצוע חלקיק יחיד התפתח כשיטת המנוצלת ביותר כדי לפתור את המבנים של חלקיקי נגיף עטפו, כוללים הקוצים גליקופרוטאין. עם זאת, שיטה זו מוגבלת לicosahedrally וירוסים סימטריים. כאן, באמצעות היישום של אלקטרון cryo-טומוגרפיה ומיצוע subtomogram בJsubtomo, שהצגנו פרוטוקול כללי לקביעת קוצים גליקופרוטאין על pleomorphic עטף וירוסים שאינם ניתנים לשיטות ביולוגיה אחרות הנוכחיות מבניות. תוצאות הנציג שלנו מראות כי הרזולוציה של שיטה זו היא מספיק כדי לחשוף תובנות ארכיטקטורת תחום, oligomerization, וארגון מסדר גבוה יותר של קוצים גליקופרוטאין על virions שלמה. jove_content &quot;&gt; השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול זה הוא בניית שני מודלים התחלה אמינות שאינם תלויים מבחינה סטטיסטית זה מזה ביצוע. מוצלח של שלב זה מבוסס על ההנחה כי הקוצים גליקופרוטאין הם מספיק גדולים ולא עמוסים אחד נגד השני בחוזקה רבה מדי, כדי שקוצים בודדים יכול יוכר מבחינה ויזואלית וידני הרים בtomograms, ושני מודלים עצמאיים בממוצע. אם זה לא ריאלי, יכול להיות ניסו שני שינויים בפרוטוקול. ראשית, ניתן לבנות שני מודלים אקראיים עצמאיים על ידי ההגדרה ראשונה שתי תת קבוצות של subtomograms אקראיות ולאחר מכן ממוצע subtomograms בתוך תת אלה 30. שני, אם מבנה של ספייק המבודד כבר נגזר באמצעים אחרים, למשל על ידי קריסטלוגרפיה רנטגן, ניתן להשתמש בו כמודל התחלה. עם זאת, יש להקפיד לנמוך תעבור סינון מודל זה באמצעות חתך ברזולוציה נמוכה (50-70 א), כשני מודלים וכתוצאה מכך בסיבוב הבא של עידון יהיהלהיות עצמאי מבחינה סטטיסטית רק מעבר להחלטה זו. בשל אזהרה זו, הגישה לשעבר מומלצת. הרזולוציה השגה מפרוטוקול זה תלוי בארבעה גורמים עיקריים: א. אסטרטגיה של איסוף נתונים והאיכות של נתוני הקלט, ii. מספר subtomograms, iii. דיוק יישור של subtomograms, וiv. ההטרוגניות של המבנים. בעוד המגבלה הראשונה ושנייה ניתן להתגבר במידה רבה על ידי שימוש בגלאים גבוהים אות לרעש ישירים אלקטרונים בשילוב עם CTF תיקן טומוגרפיה ואיסוף נתונים אוטומטי, דיוק היישור מושפע יותר על ידי הגודל וצורה של המבנה של העניין עצמו. בעת החלת פרוטוקול זה על קוצים קטנים חסרי מאפיינים בולטים, זה עשוי להיות יתרון לאגד שברי Fab לספייק כדי לשפר את דיוק היישור וכך החלטה ביום 31 ב. לבסוף, תצורות מרובות תערוכה אם המבנים להיות בממוצע, משנה tomogrשיטות סיווג בבוקר עשויות לשמש לממוצע תצורות שונות בנפרד. לשם כך, Jsubtomo משתלב עם חבילת דינמו, מציע subtomogram החזק סיווג 9. הפרוטוקול לעיל הוא משלים לקריסטלוגרפיה רנטגן של גליקופרוטאינים נגיפיים מבודדים. יכולים להיות מצוידים מבנים קריסטלוגרפיים לממוצעים תת tomogram להשיג את הכיוון המדויק של גליקופרוטאין ביחס לקרום virion. יישום של מתודולוגיה זו, ללא ספק, ימשיך לשפוך אור על מבנה נגיף עטוף וpathobiology.

cryo-טומוגרפיה של האלקטרון היא טכניקת הדמיה cryo-מיקרוסקופ אלקטרונים המאפשרת החישוב של שחזור תלת ממדים (3D) של דגימות ביולוגיות מורכבות. דגימות מתאימות נעות בין מתחמים מטוהרים macromolecular 1, חוטים 2, שלפוחית ​​מצופה 3, ווירוסים קרום pleomorphic 4 לתאים פרוקריוטים כל 5 ואפילו אזורים דקים של תאים האיקריוטים כל 6. בעקבות איסוף הנתונים של הטיה סדרה, כרכי טומוגרפיה 3D, או tomograms, ניתן לחשב באמצעות מספר חבילות תוכנה שהוקמו, כולל 7 Bsoft וIMOD 8. שני היבטים חלק מהלימוד של דגימות ביולוגיות על ידי גבול cryo-טומוגרפיה של אלקטרון הפרשנות הביולוגית של הכרכים טומוגרפית המקבילים. ראשית, בשל המינון המוגבל האלקטרון שיכול להיות מיושם על חומרים ביולוגיים לפני הצגת נזקי קרינה משמעותיות, signaיחסי ליטר לרעש בנתונים טומוגרפיה הם בדרך כלל נמוכים מאוד. שני, כתוצאה ממדגם מצומצם גיאומטריה הטיה במהלך איסוף הנתונים, כמה תצוגות של האובייקט להישאר נעדרו, שמוביל לחפץ שנקרא &#39;טריז חסר&#39; בטומוגרפיה הנפח. עם זאת, שניהם של מגבלות אלה ניתן להתגבר אם טומוגרפיה הנפח מכיל חוזר על מבנים זהים, כגון מתחמי macromolecular, שיכול להיות בהצלחה בממוצע 9-12. לפני ממוצע של מבנים משחזורי tomogram, אובייקטים של עניין יש למצוא ומיושרים לאותו הכיוון. איתור מבנים כאלה עשויים להיות מושגת על ידי מתאם צולב של מבנה תבנית בטומוגרפיה עוצמת הקול באמצעות גישה המכונה לעתים קרובות כתבנית תואמת 13. התבנית המשמשת בתהליך התאמה זה יכול לנבוע מהאלקטרון cryo-מיקרוסקופיה או cryo-טומוגרפיה של אלקטרון בשילוב עם שחזור 3D, או שזה יכול להיות מפת צפיפות מדומה ממבנה אטומי. כמה חבילות חישובית פותחו כדי לבצע משימות אלה 11. ממוצע של קוצים גליקופרוטאין של וירוסי קרום, כגון HIV-1, הייתה גישה מוצלחת במיוחד לחקר המבנה שלהם 14-16. הבנה של המבנה היא חלק בלתי נפרד לחשיפת שני הבסיס המולקולרי של אינטראקציות-מארח וירוס ומנחה פיתוח עיצוב אנטי וחיסון. בעוד קריסטלוגרפיה macromolecular היא הטכניקה שבה נקטה ברזולוציה גבוהה (בדרך כלל טובה יותר מאשר 4 א) ניתוח מבני של גליקופרוטאינים נגיפיים בודדים והמתחמים שלהם, מבני רנטגן וכתוצאה משיטה זו הם של חלבונים מבודדים מהסביבה הטבעית הקרומית על virion . לפיכך, פרטים חשובים כגון ארכיטקטורה גבוהה יותר בסדר גודל של גליקופרוטאינים נגיפיים, בהקשר של virion, יישארו חסרים. מצד השני, אלקטרון cryo-מיקרוסקופיה ושחזור חלקיק בודדשל וירוסים עטופים כולו מוגבל לvirions עם הסימטריה icosahedral 17,18. cryotomography אלקטרונים בשילוב עם יישור משנה נפח וכך יצא כטכניקה משלימה המאפשרת המחקר של קוצים גליקופרוטאין של, וירוסי pleomorphic בצורה סדירה באתר. פיתחנו תוכנה בשם Jsubtomo (www.opic.ox.ac.uk/jsubtomo) לצורך זיהוי, היישור, והמיצוע של כרכים תת טומוגרפית. Jsubtomo נוצל בקביעת המבנה של מספר המבנים התאיים ונגיפיים 19-26. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט, המאפשר למבני ספייק נגיפי-משטח הנחישות. כדי לעקוף את יתר העידון של מבנים בממוצע על ידי קישור בין רעש, ערכת העידון &quot;תקן זהב&quot; תאומץ 10,27. לבסוף, אסטרטגיות להדמיה ופרשנות של תוצאות אופייניות הם דנו.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="686">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:184px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Jsubtomo (ver 1.3.1)</td>
			<td style="width:184px;">University of Oxford</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>www.opic.ac.uk/jsubtomo</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bsoft (ver 1.8.7)</td>
			<td style="width:184px;">NIAMS, NIH</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>bsoft.ws</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UCSF Chimera</td>
			<td style="width:184px;">UCSF</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>www.cgl.ucsf.edu/chimera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

averaging of viral envelope glycoprotein spikes from electron cryotomography reconstructions using jsubtomo

וירוסים אפפו לנצל גליקופרוטאינים קרום על פני השטח שלהם לתווך כניסה לתאי מארח. ניתוח מבני תלת ממדי של &quot;הקוצים&quot; גליקופרוטאין אלה הוא לעתים קרובות מאתגר מבחינה טכנית אך חשוב להבנת הפתוגנזה נגיפית ובתכנון תרופות. הנה, פרוטוקול מוצג לקביעת מבנה ספייק נגיפית באמצעות מיצוע חישובית של נתונים cryo-טומוגרפיה של אלקטרון. cryo-טומוגרפיה של האלקטרון היא טכניקה במיקרוסקופ אלקטרונים המשמשת לחישוב שחזורים תלת ממדיים טומוגרפית נפח, או tomograms, של דגימות ביולוגיות pleomorphic כגון וירוסי קרום במצב כמעט טבעי, קפוא התייבשות. tomograms אלה לחשוף מבנים של עניין בשלושה ממדים, אם כי ברזולוציה נמוכה. מיצוע חישובית של כרכי משנה, או תת tomograms, יש צורך לקבל פירוט ברזולוציה גבוה יותר של חזרה על מוטיבים מבניים, כגון קוצים גליקופרוטאין ויראלי. גישה חישובית מפורטת לעלייgning וממוצע משנה tomograms באמצעות חבילת תוכנת Jsubtomo מתוארת. גישה זו מאפשרת הדמיה של המבנה של קוצים גליקופרוטאין נגיפיים לרזולוציה בטווח של 20-40 A ומחקר של חקר אינטראקציות מסדר גבוהות יותר ספייק לספייק על קרום virion. תוצאות אופייניות מוצגות לוירוס Bunyamwera, וירוס עטף מהמשפחה Bunyaviridae. משפחה זו היא קבוצה מבנית מגוונת של פתוגנים מהווים איום על בריאות אדם ובעלי חיים.

אנו מדגימים את היישום של זרימת העבודה מיצוע משנה tomogram שתוארה לעיל למורכב מעטפת גליקופרוטאין של וירוס Bunyamwera (Orthobunyavirus, Bunyaviridae) באמצעות נתונים שפורסמו בעבר להגדיר 24. פרמטרים איסוף נתונים ועידונם מופיעים בטבלה 1. tomogram נציג אחד שמוצג באיור 2. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פרמטר (יחידה) </td><td> ערך </td></tr><tr><td> איסוף נתונים </td><td></td></tr><tr><td> מתח (ק) </td><td> 300 </td></tr><tr><td> הגדלה מכוילת (X) </td><td> 111,000 </td></tr><tr><td> גודל פיקסל (א) </td><td> 5.4 </td></tr><tr><td> מינון משוער (ה - / 2) </td><td> 100 </td></tr><tr><td> Underfocus (מיקרומטר) </td><td> 4.0-4.5 </tד&gt; </tr><tr><td> אפס CTF הראשון (א) </td><td> 26-30 </td></tr><tr><td> טווח הטיה (°) </td><td> -60-60 </td></tr><tr><td> דגימת הטיה (°) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> נתונים ועידון </td><td></td></tr><tr><td> Tomograms </td><td> 11 </td></tr><tr><td> Virions </td><td> 29 </td></tr><tr><td> זרעים לvirion </td><td> 106 </td></tr><tr><td> מספר כולל של זרעים </td><td> 3,074 </td></tr><tr><td> Spikes זוהה </td><td> 1,346 </td></tr><tr><td> קוצים לאחר הסרת חפיפות </td><td> 1,401 </td></tr><tr><td> קוצים לאחר בחירה מבוססת חוצה קשר </td><td> 1,022 </td></tr><tr><td> Spikes נכלל בממוצע הסופי </td><td> 1,022 </td></tr><tr><td> סימטריה </td><td> C3 </td></tr><tr><td> דגימה הזוויתי (°) </td><td> 8 </td></tr><tr><td> רזולוציהטווח שימוש בעידון (א) </td><td> 42-334 </td></tr><tr><td> אומדן החלטה סופי ב (א) </td><td> 35 </td></tr></tbody></table> טבלה 1: איסוף נתונים Bunyamwera וסטטיסטיקת עידון. CTF, פונקצית העברת ניגוד. ב מחושב באמצעות מתאם פגז פורייה בין שני מבנים באופן עצמאי מעודנים בסף של 0.143. <img alt="איור 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig2highres.jpg" width="600" /> איור 2:. Slice דרך tomogram של virions Bunyamwera כמה מבטי צד ספייק ניכרו בפריפריה של כל virion מצוינים עם ראשי חץ. Tomogram היה נמוך לעבור סינון ל60 א. סרגל קנה מידה 100 ננומטר. ראשית, אנו מעודנים מודל ראשוני באמצעות 205 קוצים ידני הרימו ( <strong&gt; איור 3). סימטריה משולשת של המרכז ביותר ספייק הייתה ברורה מבלי להחיל כל סימטריה (איור 3 ב) והוטלה בסיבובים הבאים של עידון (איור 3 ג). לאיתור כל הקוצים באופן אוטומטי על פני שטח virion, אנחנו שנוצרנו 106 זרעים עבור כל virion ברדיוס של 43 ננומטר וריווח של 20 מעלות (איור 4 א) וiteratively מעודנים עמדותיהם ביחס לקרום (איור 4). <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig3highres.jpg" width="600" /> איור 3: עידון של מבנה התבנית הראשוני. () Cylindrically ממוצע התבנית (C100) הבנויה מתפקידים שהוגדרו באופן ידני של קוצים. (B) צפיפות פי ממוצע לאחר חמישה סבבים של עידון ללא כל סימטריה (C1) שהוטלה מציגה עלייה חדה בפי שלושהתכונות סימטריות. הרזולוציה של המודל היא 48 א. (C) הממוצע של ספייק הוחלט ב41 Å לאחר חמישה סבבים של עידון עם סימטריה פי שלוש. <img alt="איור 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig4highres.jpg" width="600" /> איור 4:. עידון של הזרעים AB) קבוצת משנה של זרעים לפני () ועידון אחרי (B) מוצגים בצפיפות virion אחד מהאיור 2 זרעים ב( ב) היו מבוססים על צולב בהתאמה צבעים. מקדמי מתאם (כחול, מתאם נמוך; מתאם גבוה אדום,). התיקונים הטובים ביותר התאמתו גליקופרוטאין ספייק (75% העליונים לאחר הסרת חפיפה; ~ 1,000 הקוצים) ששימשו בחישוב ממוצע הסופי. הממוצע הוחלט 35 החלטה (איור 5). זה חשף מבנה ספייק trimeric באמצע, בבנוסף לכמה תרומה משישה קוצים הסמוכות. מודלים מורכבים של virions, מחושבת על ידי הצבת המבנה בעמדות הידועות, חשפו מיקום של הקוצים על פני השטח virion (איור 6 א). מדי פעם, טלאים הורו באופן מקומי של קוצים ניכרו (איור 6). <img alt="איור 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig5highres.jpg" width="600" /> איור 5: מבנה מעודן של תיקון של שכבת ספייק גליקופרוטאין לאחר התאמת תבנית. (AB) שתי מפות &quot;אפילו &#39;ו&#39; מוזר &#39;, שחזרו משני חצאים של הנתונים מוצגים. שתי מפות להראות מידה יוצאת דופן של דמיון, המאמתות את validness של הגישה. האורינטציה סביב הציר הארוך ספייק היא שונה כשתי המפות שוחזרו באופן עצמאי באופן מלא מכל אחר. (C) הממוצע של שתי המפות מוצג בההחלטה הסופית של 35 א. <img alt="איור 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig6highres.jpg" width="600" /> איור 6: מיקום של הקוצים על virion Bunyamwera. מודל משולב לvirion (). צפו בוקטורים (מקלות) מצביעים על האוריינטציות של הקוצים. צבעים מצביעים על המתאם הצולב בין כל ספייק ומבנה התבנית (כחול, מתאם נמוך; מתאם גבוה אדום,). (ב) תקריב של תיקון מסודר של קוצים.

Watch this Scientific Journal Video about Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo at JoVE.com

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

An approach is presented for determining structures of viral membrane glycoprotein complexes using a combination of electron cryo-tomography and sub-tomogram averaging with the computational package Jsubtomo.

ממוצע של ויראלי מעטפת גליקופרוטאין Spikes מאלקטרוני Cryotomography שחזור באמצעות Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

באמצעות assay הפאן ויראלי microarray (Virochip) אל מסך דוגמאות קליניות עבור פתוגנים ויראליים

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

קביעת מבנים מולקולריים של גליקופרוטאינים HIV מעטפה באמצעות אלקטרונים cryo-טומוגרפיה ו ממוצעים אוטומטי תת tomogram

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

חסכונית שיטת מעקב אחר מקור מיקרוביאלית באמצעות וירוסים אדם ובעלי חיים ספציפיים

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

בידוד של פידליטי גרסאות של וירוסים RNA ו אפיון תדירות המוטציה וירוס

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

ההפרדה של ה-DNA חד גדילי, פעמיים תקועים DNA ו-RNA מהקהילה ויראלי הסביבה באמצעות כרומטוגרפיה hydroxyapatite

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

ההכנה של ה-DNA ויראלי של Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

הדמיה של HIV-1 מעטפה הנגרמת סינפסה Virological והאיתות על bilayers שומנים סינתטי

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

הערכת קונפורמציה של HIV-1 trimeric מעטפת גליקופרוטאינים שימוש ELISA Assay מבוסס Cell

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

התפתחות Lyophilized Loop בתיווך ריאגנטים הגברה איזו תרמים לצורך זיהוי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

מדידת טיטר נוגדנים עיכוב Neuraminidase שפעת ידי enzyme-linked Assay לקטינים

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...