Name: dna-affinity-purified chip (dap-chip) method to determine gene targets for bacterial two component regulatory systems
Uploaded: 2014-07-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA-affinity-purified Chip DAP-chip Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems at JoVE.com

Vi takker Amy Chen for hennes hjelp i forberedelsene til video skyte og for å demonstrere teknikken. Dette arbeidet ble utført av ENIGMA: Økosystemer og nettverk Integrert med gener og molekylære forsamlinger (http://enigma.lbl.gov), en vitenskapelig fokusområde Program ved Lawrence Berkeley National Laboratory, ble støttet av Office of Science, Office of Biological and Environmental Research, av US Department of Energy i henhold til kontrakt nummer DE-AC02-05CH11231.

Merk: Protokollen nedenfor er skreddersydd for bestemmelse av genet mål av RR DVU3023 fra bakterien Desulfovibrio vulgaris Hildenborough. Den kan tilpasses til en hvilken som helst annen transcriptional regulator av interesse. En. Clone og rense RR <ol><li> Klone RR genet, spesielt DVU3023, fra D. vulgaris Hildenborough inn i en Escherichia coli-ekspresjonsvektor slik at genet er C-terminalt His-tagget og ekspresjon er under kontroll av en T7-promoter. Me...

<ol>
	<li>Galperin, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+structure+and+function+of+response+regulator+output+domains.">Diversity of structure and function of response regulator output domains.</a> Curr Opin Microbiol. 13, 150-159 (2010).</li><li>Casino, P., Rubio, V., Marina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+signal+transduction+by+two-component+systems.">The mechanism of signal transduction by two-component systems.</a> Curr Opin Struct Biol. 20, 763-771 (2010).</li><li>Aparicio, O., Geisberg, J. V., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+for+determining+the+association+of+proteins+with+specific+genomic+sequences+in+vivo.">Chromatin immunoprecipitation for determining the association of proteins with specific genomic sequences in vivo.</a> Curr Protoc Cell Biol. 17 (17), (2004).</li><li>McCleary, W. R., Stock, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetyl+phosphate+and+the+activation+of+two-component+response+regulators.">Acetyl phosphate and the activation of two-component response regulators.</a> J Biol Chem. 269, 31567-31572 (1994).</li><li>Novichkov, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RegPrecise+web+services+interface:+programmatic+access+to+the+transcriptional+regulatory+interactions+in+bacteria+reconstructed+by+comparative+genomics.">RegPrecise web services interface: programmatic access to the transcriptional regulatory interactions in bacteria reconstructed by comparative genomics.</a> Nucleic Acids Res. 40, 604-608 (2012).</li><li>Studholme, D. J., Buck, M., Nixon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+potential+sigma(N)-dependent+promoters+in+bacterial+genomes.">Identification of potential sigma(N)-dependent promoters in bacterial genomes.</a> Microbiology. 146 (12), 3021-3023 (2000).</li><li>Rajeev, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+mapping+of+two+component+response+regulators+to+gene+targets+in+a+model+sulfate+reducing+bacterium.">Systematic mapping of two component response regulators to gene targets in a model sulfate reducing bacterium.</a> Genome Biol. 12, 99 (2011).</li><li>Crooks, G. E., Hon, G., Chandonia, J. M., Brenner, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WebLogo:+a+sequence+logo+generator.">WebLogo: a sequence logo generator.</a> Genome Res. 14, 1188-1190 (2004).</li><li>Barbieri, C. M., Mack, T. R., Robinson, V. L., Miller, M. T., Stock, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+response+regulator+autophosphorylation+through+interdomain+contacts.">Regulation of response regulator autophosphorylation through interdomain contacts.</a> J Biol Chem. 285, 32325-32335 (2010).</li><li>Bourret, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receiver+domain+structure+and+function+in+response+regulator+proteins.">Receiver domain structure and function in response regulator proteins.</a> Curr Opin Microbiol. 13, 142-149 (2010).</li><li>Gao, R., Stock, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+strategies+for+phosphorylation-mediated+regulation+of+response+regulator+activity.">Molecular strategies for phosphorylation-mediated regulation of response regulator activity.</a> Curr Opin Microbiol. 13, 160-167 (2010).</li><li>Hung, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+of+the+response+regulator+ComE+from+Streptococcus+mutans+is+affected+by+phosphorylation.">Oligomerization of the response regulator ComE from Streptococcus mutans is affected by phosphorylation.</a> J Bacteriol. 194, 1127-1135 (2012).</li><li>Ladds, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+response+regulator+Spo0A+from+Bacillus+subtilis+is+efficiently+phosphorylated+in+Escherichia+coli.">The response regulator Spo0A from Bacillus subtilis is efficiently phosphorylated in Escherichia coli.</a> FEMS Microbiol Lett. 223, 153-157 (2003).</li><li>Wen, Y., Feng, J., Scott, D. R., Marcus, E. A., Sachs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+HP0165-HP0166+two-component+system+in+expression+of+some+acidic-pH-upregulated+genes+of+Helicobacter+pylori.">Involvement of the HP0165-HP0166 two-component system in expression of some acidic-pH-upregulated genes of Helicobacter pylori.</a> J Bacteriol. 188, 1750-1761 (2006).</li><li>Liu, X., Noll, D. M., Lieb, J. D., Clarke, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIP-chip:+rapid+and+accurate+determination+of+DNA-binding+specificity.">DIP-chip: rapid and accurate determination of DNA-binding specificity.</a> Genome Res. 15, 421-427 (2005).</li><li>Gossett, A. J., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Immunoprecipitation+(DIP)+for+the+Determination+of+DNA-Binding+Specificity.">DNA Immunoprecipitation (DIP) for the Determination of DNA-Binding Specificity.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Mascher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Streptococcus+pneumoniae+cia+regulon:+CiaR+target+sites+and+transcription+profile+analysis.">The Streptococcus pneumoniae cia regulon: CiaR target sites and transcription profile analysis.</a> J Bacteriol. 185, 60-70 (2003).</li><li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq:+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology.">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).</li><li>Lefrancois, P., Zheng, W., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-Seq+using+high-throughput+DNA+sequencing+for+genome-wide+identification+of+transcription+factor+binding+sites.">ChIP-Seq using high-throughput DNA sequencing for genome-wide identification of transcription factor binding sites.</a> Methods Enzymol. 470, 77-104 (2010).</li><li>Ho, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-chip+versus+ChIP-seq:+lessons+for+experimental+design+and+data+analysis.">ChIP-chip versus ChIP-seq: lessons for experimental design and data analysis.</a> BMC Genomics. 12, 134 (2011).</li><li>Liu, X., Lee, C. K., Granek, J. A., Clarke, N. D., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+comparison+of+Leu3+binding+in+vitro+and+in+vivo+reveals+the+importance+of+nucleosome+occupancy+in+target+site+selection.">Whole-genome comparison of Leu3 binding in vitro and in vivo reveals the importance of nucleosome occupancy in target site selection.</a> Genome Res. 16, 1517-1528 (2006).</li></ol>

DAP-chip metoden beskrevet her ble brukt til å bestemme genet mål for flere RR i Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7 av hvilken som er vist her som en representant resultat. For RR DVU3023, velger en kandidat genet målet var grei. DVU3025 er lokalisert umiddelbart nedstrøms for RR-genet, og RR og målgener er konservert i flere Desulfovibrio arter, og i tillegg DVU3025 har en predikert sigma54-avhengige promotor. Den EMSA gir en enkel metode for å teste hurtig RR for binding til kand...

Bakterienes evne til å overleve og trives er kritisk avhengig av hvor godt de er i stand til å oppfatte og svare på forstyrrelser i sine miljøer, og dette i sin tur er avhengig av sine signaltransduksjonsveiene systemer. Antallet signalanlegg en bakterie koder har blitt kalt sin &quot;mikrobiell IQ&quot;, og kan være en indikasjon på både variasjon av sitt miljø og sin evne til å oppfatte flere signaler og finjustere sitt svar en. To komponent signaltransduksjonsveiene systemer (TCS) er de mest utbredte signalsystemer som brukes av bakterier, og de ​​består av en histidin kinase (HK) som registrerer eksternt signal og sender via fosforylering til en effektor respons regulator (RR) 2. RR kan ha en rekke utgangs domener og dermed ulike effektor moduser, men det vanligste svaret er transkripsjonsregulering via en DNA bindende domene en. Signalene som registreres og de tilsvarende funksjoner av de vast fleste overlevende er fortsatt ukjent. Selv om in vivo-metoder som for eksempel chip-chip blir rutinemessig brukt for bestemmelse av genomisk bindingsseter for transkripsjonsfaktorene 3, kan de bare anvendes for bakterielle tokomponent-system hvis RR aktiveringsbetingelser eller signaler er kjent. Ofte de miljømessige signaler som aktiverer en TCS er vanskeligere å fastslå enn sine genet mål. Den in vitro mikromatrisebasert assay som er beskrevet her kan brukes for effektivt og raskt bestemme de genet mål og forutsi funksjoner av overlevende. Denne analysen tar fordel av det faktum at RR kan bli fosforylert og dermed aktiveres in vitro ved hjelp av små molekyl givere som acetyl fosfat 4.. I denne fremgangsmåten, kalt DAP-chip for DNA-affinitetsrenset-chip (figur 1), blir RR genet av interesse klonet med en His-tag i E. coli, og en etterfølgende renset merket protein tillates å bind å skåret genomisk DNA. Den proteinbundet DNA blir deretter anriket ved affinitets-rensing, blir den anrikede og inngangs DNA amplifisert, fluorescensmerkede, samles sammen og hybridisert til en flislegging array som er spesiallaget for organismen av interesse (fig. 1). Microarray eksperimenter er gjenstand for artefakter og derfor ytterligere trinn benyttes for å optimalisere assay. Et slikt trinn er å forsøke å finne en target for RR som studeres ved hjelp av elektroforetisk mobilitet shift assay (EMSA) (se arbeidsflyt i figur 2). Deretter, etter binding til genomisk DNA, og de DAP trinn, blir proteinbundet og inngangs DNA undersøkt av qPCR for å se om den positive målet er anriket på protein-bundet fraksjon i forhold til inngangs fraksjon, noe som bekrefter optimale bindingsbetingelser for RR (figur 2). Etter at matrisen hybridisering, blir dataene analyseres for å finne toppene av høyere intensitet signal som indikerer genomiske loci hvor proteinet hAnnonsen bundet. Funksjonene kan forutsies for en RR basert på genet mål oppnådd. De mål-genomiske loci blir brukt til å forutsi binding site motiv, som deretter eksperimentelt validert ved hjelp EMSAs (figur 2). De funksjonelle prediksjoner og genet mål for strømlikeretteren kan deretter bli utvidet til nært beslektede arter som koder ortologe RR ved å skanne de genomer for tilsvarende bindingsmotiver (figur 2). DAP-chip metoden kan gi et vell av informasjon for en TCS der det tidligere var det ingen. Fremgangsmåten kan også brukes for en hvilken som helst transcriptional regulator hvis proteinet kan renses, og DNA-bindingsforhold kan bestemmes, og for en hvilken som helst organisme av interesse med et genom-sekvens er tilgjengelig. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51715/51715fig1highres.jpg" width="500" /> Figur 1. DNA-affinitetsrenset-chip (DAP-chip) strategi 7. RR-genet fra organismen av interesse er klonet med carboxy-terminalt His-tag i en E. coli uttrykk belastning. Renset His-merket protein som blir aktivert ved fosforylering med acetyl-fosfat, og blandet med skåret genom-DNA. En aliquot av bindingsreaksjon blir lagret som input DNA, mens resten er utsatt for affinitetsrensing ved hjelp av Ni-NTA harpiks. Den inn-og RR-bundet DNA er hele genomet amplifisert og merket med Cy3 Cy5 og hhv. Det merkede DNA blir samlet sammen og hybridisert til en flislegging matrise, som så blir analysert for å bestemme de genet mål. Figur modifisert og gjengitt ved hjelp av Creative Commons-lisens fra 7. <img alt="Fig. 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51715/51715fig2highres.jpg" width="500" /> Figur 2. Oppsummering av arbeidsflyt. For noen renset tagget Proteinkonn, begynne med å bestemme et mål ved hjelp av EMSA. Tillat protein å binde genomisk DNA og deretter DNA-affinitet-renser (DAP) og hele genomet forsterke (WGA) beriket og innspill DNA. Dersom et gen mål er kjent, bruker qPCR for å sikre at den kjente målet er anriket med protein-bundne fraksjon. Hvis ingen mål kunne fastslås, gå direkte til DNA merking og rekke hybridisering. Hvis berikelse av qPCR ikke kunne observeres, deretter gjenta protein-gDNA bindende og DAP-WGA trinn ved hjelp av ulike protein mengder. Bruk rekke analyse for å finne topper og kart dem til å målrette gener. Bruk oppstrøms regioner i målgener å forutsi bindingssetet motiver. Validere motivene eksperimentelt ved hjelp av EMSAs. Bruk motiv for å skanne genomene til beslektede arter som koder orthologs av RR under studien, og spår gener målrettet i disse artene også. Basert på genet mål som oppnås, kan den fysiologiske funksjon av RR og dets orthologs forutsies. Figur modifisert og gjengitt ved hjelp av kreative commons lisens fra 7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="719">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:248px;">Company</td>
			<td style="width:113px;">Catalog number</td>
			<td style="width:104px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">HisTrapFF column (Ni-Sepharose column)</td>
			<td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>17-5255-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Akta explorer (FPLC instrument)</td>
			<td colspan="2">GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">HiPrep 26/10 Desalting column</td>
			<td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>17-5087-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Qiaquick Gel extraction kit</td>
			<td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td>
			<td align="right">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Biotin-labeled oligonucleotides</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">6% polyacrylamide-0.5X TBE precast mini DNA retardation gel</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td>
			<td>EC63652BOX</td>
			<td>Alternately, you can pour your own gel.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Nylon membrane</td>
			<td>EMD Millipore, Billerica, MA, USA</td>
			<td>INYC00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Trans-Blot SD Semi-dry electrophoretic transfer cell</td>
			<td>Biorad, Hercules, CA, USA</td>
			<td>170-3940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Extra thick blot paper, 8 x 13.5 cm</td>
			<td>Biorad, Hercules, CA, USA</td>
			<td>170-3967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">UV crosslinker Model XL-1000</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:113px;">11-992-89</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Nucleic Acid chemiluminescent detection kit (Pierce)</td>
			<td>Thermo fisher Scientific, Rockford, IL, USA</td>
			<td align="right">89880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Ni-NTA agarose resin</td>
			<td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td>
			<td align="right">30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="119">
			<td height="119" style="height:119px;width:255px;">GenomePlex Whole genome amplification kit (Fragmentation buffer, library preparation buffer, library stabilization solution, library preparation enzyme, 10X amplification master mix, WGA polymerase )</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>WGA2-50RXN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Nanodrop ND-1000</td>
			<td colspan="2">Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA</td>
			<td>For quantitation of DNA</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Perfecta Sybr Green SuperMix, with ROX</td>
			<td>Quanta biosciences</td>
			<td>95055-500</td>
			<td>Any Sybr Green PCR mix may be used</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">PlateMax Ultra clear heat sealing film for qPCR</td>
			<td>Axygen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">96 well clear low profile PCR microplate</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td>
			<td colspan="2">PCR-96-LP-AB-C</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Applied Biosystems StepOne Plus Real time PCR system</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td>
			<td align="right">4376600</td>
			<td>Any real time PCR system may be used</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Qiaquick PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td>
			<td align="right">28104</td>
			<td>Any PCR clean up kit may be used</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Cy3/Cy5-labeled nonamers</td>
			<td>Trilink biotechnologies, San Diego, CA, USA</td>
			<td colspan="2">N46-0001, N46-0002</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Klenow polymerase 50,000U/ml, 3&#39;-5&#39; exo-</td>
			<td>New England Biolabs, Ipswich, MA</td>
			<td>M0212M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Hybridization system</td>
			<td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This company no longer makes arrays or related items, so alternate sources such as Agilent or Affymetrix will need to be used,</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Custom printed microarrays and mixers</td>
			<td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:255px;">Hybridization kit (2X Hybridization buffer, Hybridization component A, Alignment oligo)</td>
			<td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Wash buffer kit (10X Wash buffer I, II, III, 1 M DTT)</td>
			<td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">GenePix 4200A microarray scanner</td>
			<td colspan="2">Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA</td>
			<td>This model has been replaced by superior ones</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">GenePix Pro microarray software</td>
			<td colspan="2">Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Nimblescan v.2.4, ChIP-chip analysis software</td>
			<td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna-affinity-purified chip (dap-chip) method to determine gene targets for bacterial two component regulatory systems

In vivo metoder som chip-chip er veletablerte teknikker som brukes for å fastsette den globale genet mål for transkripsjonsfaktorer. Men de er av begrenset bruk i å utforske bakterielle to komponent reguleringssystemer med uncharacterized aktiveringsforhold. Slike systemer regulere transkripsjon kun ved aktivering i nærvær av unike signaler. Siden disse signaler er ofte ukjente, kan de in vitro mikromatrisebasert metode som er beskrevet i denne video artikkelen brukes til å bestemme genet mål og bindingsseter for respons regulatorer. Dette DNA-affinitetsrenset-chip-metoden kan anvendes for en hvilken som helst renset regulator i en hvilken som helst organisme med en sekvens genom. Protokollen omfatter å la den rensede merkede protein å binde seg til skåret genom-DNA og så affinitet rensing av proteinbundet DNA, etterfulgt av fluorescerende merking av DNA og hybridisering til en tilpasset flislegging array. Foregående fremgangsmåter kan benyttes for å optimalisere assay for spesific regulatorer er også beskrevet. Toppene som genereres av matrisedataanalyse blir brukt til å forutsi binding site motiv, som deretter eksperimentelt validert. Motivet spådommer kan videre brukes til å bestemme genet mål av ortologe respons regulatorer i nært beslektede arter. Vi demonstrerer anvendelsen av denne metoden ved å bestemme genet mål og bindende site motiver og dermed forutsi funksjon for en sigma54 avhengig respons regulator DVU3023 i miljø bakterien Desulfovibrio vulgaris Hildenborough.

Ovennevnte metode ble brukt for å bestemme de globale genet mål av RRS i modellen sulfat reduserende bakterien Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7. Denne organisme har et stort antall overlevende representert ved over 70 RR, som indikerer den store variasjonen av mulige signaler som den registrerer og reagerer på. In vivo-analyser for funksjonene til disse signalsystemer er vanskelig å utføre siden deres signaler og dermed deres aktiveringsbetingelser er ukjent. Her DAP-chip metoden ...

Watch this Scientific Journal Video about DNA-affinity-purified Chip DAP-chip Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems at JoVE.com

DNA-affinity-purified Chip DAP-chip Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

DNA-affinitetsrenset Chip (DAP-chip) metode for å bestemme genet mål for Bakteriell To komponent Regulatory Systems

Denne filmen artikkelen beskriver en in vitro mikromatrisebasert metode for å bestemme de genet mål og bindingsseter for to-komponent-system respons regulatorer.

In vivo methods such as ChIP-chip are well-established techniques used to determine global gene targets for transcription factors. However, they are of ...

Research

JoVE Journal

Biology

DNA-affinity-purified Chip (DAP-chip) Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

Bestemme Bidrag av energisystemene under trening

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Bruken av<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Hel-organ Imaging og kvantitativ Tissue Histologi fastslår Bio-distribusjon av fluorescensmerkede molekyler

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

Bruke en helmontert immunhistokjemisk metode for å studere innerveringen av galdevegen i<em&gt; Suncus murinus</em

This work describes the whole-mount immunohistochemistry staining method in detail, using neurofilament protein antibody to label the innervation of the ...

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Laktat Dehydrogenase lagring analysen-En enkel og pålitelig metode å avgjøre Bulk Autophagic lagring aktivitet i pattedyrceller

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression

Live Imaging av mikrokolonier med høy gjennomstrømning for å måle heterogenitet i vekst og genuttrykk

Precise measurements of between- and within-strain heterogeneity in microbial growth rates are essential for understanding genetic and environmental ...

Profiling of H3K4me3 Modification in Plants using Cleavage under Targets and Tagmentation

Profilering av H3K4me3 Modifikasjon i planter ved hjelp av spalting under mål og tagmentering

Epigenomic regulation at the chromatic level, including DNA and histone modifications, behaviors of transcription factors, and non-coding RNAs with their ...