Name: dna-affinity-purified chip (dap-chip) method to determine gene targets for bacterial two component regulatory systems
Uploaded: 2014-07-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA-affinity-purified Chip DAP-chip Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems at JoVE.com

Agradecemos Amy Chen por sua ajuda na preparação para a filmagem do vídeo e para demonstrar a técnica. Este trabalho realizado pelo ENIGMA: Ecossistemas e redes integradas com os genes e Assembléias Molecular (http://enigma.lbl.gov), um programa científico da área de foco no Lawrence Berkeley National Laboratory, foi apoiado pelo Escritório de Ciência, Instituto de Ciências Biológicas e Pesquisa Ambiental, do Departamento de Energia dos EUA sob Contrato n º DE-AC02-05CH11231.

Nota: O protocolo a seguir é adaptado para determinação de genes alvos do DVU3023 RR da bactéria Desulfovibrio vulgaris Hildenborough. Ele pode ser adaptado a qualquer outro regulador transcricional de interesse. 1. Clone e Purify RR <ol><li> Clonar o gene RR, especificamente DVU3023, de D. vulgaris Hildenborough num vector de expressão de Escherichia coli de modo a que o gene é o C-terminal marcado com His e de expressão está sob o controlo de um promoto...

<ol>
	<li>Galperin, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+structure+and+function+of+response+regulator+output+domains.">Diversity of structure and function of response regulator output domains.</a> Curr Opin Microbiol. 13, 150-159 (2010).</li><li>Casino, P., Rubio, V., Marina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+signal+transduction+by+two-component+systems.">The mechanism of signal transduction by two-component systems.</a> Curr Opin Struct Biol. 20, 763-771 (2010).</li><li>Aparicio, O., Geisberg, J. V., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+for+determining+the+association+of+proteins+with+specific+genomic+sequences+in+vivo.">Chromatin immunoprecipitation for determining the association of proteins with specific genomic sequences in vivo.</a> Curr Protoc Cell Biol. 17 (17), (2004).</li><li>McCleary, W. R., Stock, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetyl+phosphate+and+the+activation+of+two-component+response+regulators.">Acetyl phosphate and the activation of two-component response regulators.</a> J Biol Chem. 269, 31567-31572 (1994).</li><li>Novichkov, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RegPrecise+web+services+interface:+programmatic+access+to+the+transcriptional+regulatory+interactions+in+bacteria+reconstructed+by+comparative+genomics.">RegPrecise web services interface: programmatic access to the transcriptional regulatory interactions in bacteria reconstructed by comparative genomics.</a> Nucleic Acids Res. 40, 604-608 (2012).</li><li>Studholme, D. J., Buck, M., Nixon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+potential+sigma(N)-dependent+promoters+in+bacterial+genomes.">Identification of potential sigma(N)-dependent promoters in bacterial genomes.</a> Microbiology. 146 (12), 3021-3023 (2000).</li><li>Rajeev, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+mapping+of+two+component+response+regulators+to+gene+targets+in+a+model+sulfate+reducing+bacterium.">Systematic mapping of two component response regulators to gene targets in a model sulfate reducing bacterium.</a> Genome Biol. 12, 99 (2011).</li><li>Crooks, G. E., Hon, G., Chandonia, J. M., Brenner, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WebLogo:+a+sequence+logo+generator.">WebLogo: a sequence logo generator.</a> Genome Res. 14, 1188-1190 (2004).</li><li>Barbieri, C. M., Mack, T. R., Robinson, V. L., Miller, M. T., Stock, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+response+regulator+autophosphorylation+through+interdomain+contacts.">Regulation of response regulator autophosphorylation through interdomain contacts.</a> J Biol Chem. 285, 32325-32335 (2010).</li><li>Bourret, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receiver+domain+structure+and+function+in+response+regulator+proteins.">Receiver domain structure and function in response regulator proteins.</a> Curr Opin Microbiol. 13, 142-149 (2010).</li><li>Gao, R., Stock, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+strategies+for+phosphorylation-mediated+regulation+of+response+regulator+activity.">Molecular strategies for phosphorylation-mediated regulation of response regulator activity.</a> Curr Opin Microbiol. 13, 160-167 (2010).</li><li>Hung, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+of+the+response+regulator+ComE+from+Streptococcus+mutans+is+affected+by+phosphorylation.">Oligomerization of the response regulator ComE from Streptococcus mutans is affected by phosphorylation.</a> J Bacteriol. 194, 1127-1135 (2012).</li><li>Ladds, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+response+regulator+Spo0A+from+Bacillus+subtilis+is+efficiently+phosphorylated+in+Escherichia+coli.">The response regulator Spo0A from Bacillus subtilis is efficiently phosphorylated in Escherichia coli.</a> FEMS Microbiol Lett. 223, 153-157 (2003).</li><li>Wen, Y., Feng, J., Scott, D. R., Marcus, E. A., Sachs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+HP0165-HP0166+two-component+system+in+expression+of+some+acidic-pH-upregulated+genes+of+Helicobacter+pylori.">Involvement of the HP0165-HP0166 two-component system in expression of some acidic-pH-upregulated genes of Helicobacter pylori.</a> J Bacteriol. 188, 1750-1761 (2006).</li><li>Liu, X., Noll, D. M., Lieb, J. D., Clarke, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIP-chip:+rapid+and+accurate+determination+of+DNA-binding+specificity.">DIP-chip: rapid and accurate determination of DNA-binding specificity.</a> Genome Res. 15, 421-427 (2005).</li><li>Gossett, A. J., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Immunoprecipitation+(DIP)+for+the+Determination+of+DNA-Binding+Specificity.">DNA Immunoprecipitation (DIP) for the Determination of DNA-Binding Specificity.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Mascher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Streptococcus+pneumoniae+cia+regulon:+CiaR+target+sites+and+transcription+profile+analysis.">The Streptococcus pneumoniae cia regulon: CiaR target sites and transcription profile analysis.</a> J Bacteriol. 185, 60-70 (2003).</li><li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq:+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology.">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).</li><li>Lefrancois, P., Zheng, W., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-Seq+using+high-throughput+DNA+sequencing+for+genome-wide+identification+of+transcription+factor+binding+sites.">ChIP-Seq using high-throughput DNA sequencing for genome-wide identification of transcription factor binding sites.</a> Methods Enzymol. 470, 77-104 (2010).</li><li>Ho, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-chip+versus+ChIP-seq:+lessons+for+experimental+design+and+data+analysis.">ChIP-chip versus ChIP-seq: lessons for experimental design and data analysis.</a> BMC Genomics. 12, 134 (2011).</li><li>Liu, X., Lee, C. K., Granek, J. A., Clarke, N. D., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+comparison+of+Leu3+binding+in+vitro+and+in+vivo+reveals+the+importance+of+nucleosome+occupancy+in+target+site+selection.">Whole-genome comparison of Leu3 binding in vitro and in vivo reveals the importance of nucleosome occupancy in target site selection.</a> Genome Res. 16, 1517-1528 (2006).</li></ol>

O método DAP-chip aqui descrito foi utilizado com sucesso para determinar os genes alvos para vários RRS em Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7 dos quais um é mostrado aqui como um resultado representativo. Para RR DVU3023, escolhendo um alvo gene candidato foi simples. DVU3025 está localizado imediatamente a jusante do gene RR, e os genes-alvo e RR são conservadas em diversas espécies Desulfovibrio, e adicionalmente DVU3025 tem um promotor dependente de sigma54 previsto. O EMSA for...

A capacidade das bactérias para sobreviver e prosperar é criticamente dependente da forma como eles são capazes de perceber e responder a perturbações em seus ambientes, e este por sua vez é dependente de seus sistemas de transdução de sinal. O número de sistemas de sinalização uma bactéria codifica tem sido chamado o seu &quot;QI microbiana&quot; e pode ser uma indicação de ambos variabilidade do seu ambiente e da sua capacidade de sentir múltiplos sinais e afinar a sua resposta 1. Dois sistemas de componentes de transdução de sinal (TCS) são os sistemas de sinalização mais prevalentes utilizados por bactérias, e que consistem de uma histidina-quinase (HK), que detecta o sinal externo e transmite através da fosforilação de um regulador de resposta efectora (RR) 2. RRS pode ter uma variedade de domínios de saída e, portanto, diferentes modos efetoras, mas a resposta mais comum é a regulação da transcrição por meio de um DNA domínio 1 vinculativo. Os sinais detectados e as funções correspondentes dos vast maioria dos TCSs permanecem desconhecidos. Embora métodos in vivo, tais como Chip-chip são habitualmente usadas para a determinação de locais de ligação de factores de transcrição do genoma 3, que apenas pode ser utilizado para RRS sistema de dois componente bacteriano, se são conhecidas as condições de activação ou sinalização. Muitas vezes, os sinais ambientais que ativam a TCS são mais difíceis de determinar que os seus genes alvos. O microarray ensaio in vitro com base aqui descrita pode ser utilizada para determinar rápida e eficazmente os genes alvos e prever as funções de TCS. Este ensaio tira partido do facto de RRS pode ser fosforilada e assim activado in vitro utilizando pequenos doadores molécula como fosfato acetil 4. Neste método, chamado DAP-chip para ADN de afinidade-purificada de chip (Figura 1), o gene da RR de interesse é clonado com uma cauda de His no E. coli, e uma proteína marcada subsequentemente purificado é permitido biª a cortado DNA genômico. O DNA ligado à proteína é então enriquecida por afinidade-purificação, o ADN enriquecido e entrada são amplificados, marcado por fluorescência, reunidas e hibridado com um conjunto azulejos que é feito para o organismo de interesse (Figura 1). Microarray experiências estão sujeitos a artefactos e, por conseguinte, são empregues passos adicionais para optimizar o ensaio. Um tal passo é a tentativa de determinar um destino para o RR em estudo utilizando ensaios de desvio de mobilidade electroforética (EMSA) (ver fluxo de trabalho na Figura 2). Em seguida, após a ligação ao ADN genómico e as etapas de DAP, o DNA ligado à proteína e de entrada são examinados por qPCR para ver se o alvo positivo é enriquecido na fracção ligada à proteína em relação à fracção de entrada, confirmando, assim, as condições óptimas de ligação para o RR (Figura 2). Após a matriz de hibridação, os dados são analisados ​​para encontrar os picos de intensidade de sinal mais elevado, indicando locus genómico onde a proteína hanúncio vinculada. As funções podem ser previstos para o RR com base nos genes alvos obtidos. Os loci alvo genómicas são usadas para prever motivos sítios de ligação, que são, em seguida, experimentalmente validados usando EMSAs (Figura 2). As previsões funcionais e genes alvos para a RR pode então ser estendido para as espécies que codificam RRS ortólogos por inventariar os genomas de motivos de ligação semelhantes (Figura 2) intimamente relacionados. O método DAP-chip pode fornecer uma riqueza de informações para a TCS onde antes não havia nenhuma. O método também pode ser utilizado para qualquer regulador de transcrição se a proteína pode ser purificada e as condições de ligação de ADN pode ser determinada, e para todo o organismo de interesse com uma sequência de genoma disponível. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51715/51715fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. O chip de ADN purificado por afinidade (DAP-estratégia chip) 7. O gene RR a partir do organismo de interesse é clonado com um carboxi-terminal His-tag numa E. tensão expressão coli. Purificado proteína marcada com His é activada por fosforilação com fosfato de acetilo, e misturados com o DNA genómico cortado. Uma aliquota da reacção de ligação é guardado como o ADN de entrada, enquanto o resto é submetido a purificação por afinidade usando uma resina Ni-NTA. A entrada e o DNA ligado a RR são todo o genoma amplificado e marcado com Cy3 e Cy5, respectivamente. O ADN marcado é reunidas e hibridado com uma matriz de ladrilhos, que é então analisado para determinar os alvos do gene. Figura modificada e reimpresso com a licença creative commons de 7. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51715/51715fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Resumo do fluxo de trabalho. Para qualquer Protei marcado purificadon, começar por determinar um alvo usando EMSA. Permitir proteína para ligar DNA genômico e DNA-afinidade-Purify (DAP) e todo o genoma amplificar (WGA) e do DNA de entrada enriquecido. Se um gene alvo é conhecido, usar qPCR para garantir que o alvo conhecido é enriquecido na fracção ligada a proteína. Se nenhum destino poderia ser determinado, prossiga diretamente para rotulagem de DNA e variedade de hibridização. Se o enriquecimento por qPCR não pôde ser observado, em seguida, repita a ligação proteína-gDNA e passos DAP-WGA usando diferentes quantidades de proteína. Use a análise de matriz para encontrar picos e mapeá-los para atingir genes. Use as regiões a montante de genes alvo de prever motivos local de ligação. Validar os motivos experimentalmente usando EMSAs. Use o motivo para digitalizar os genomas de espécies relacionadas que codificam ortólogos da RR em estudo, e prever genes alvo nas espécies também. Com base nos genes alvos obtidos, a função fisiológica da RR e seus ortólogos pode ser previsto. Figura modificada e reimpresso usando o c criativoommons licença de 7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="719">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:248px;">Company</td>
			<td style="width:113px;">Catalog number</td>
			<td style="width:104px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">HisTrapFF column (Ni-Sepharose column)</td>
			<td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>17-5255-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Akta explorer (FPLC instrument)</td>
			<td colspan="2">GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">HiPrep 26/10 Desalting column</td>
			<td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>17-5087-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Qiaquick Gel extraction kit</td>
			<td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td>
			<td align="right">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Biotin-labeled oligonucleotides</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">6% polyacrylamide-0.5X TBE precast mini DNA retardation gel</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td>
			<td>EC63652BOX</td>
			<td>Alternately, you can pour your own gel.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Nylon membrane</td>
			<td>EMD Millipore, Billerica, MA, USA</td>
			<td>INYC00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Trans-Blot SD Semi-dry electrophoretic transfer cell</td>
			<td>Biorad, Hercules, CA, USA</td>
			<td>170-3940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Extra thick blot paper, 8 x 13.5 cm</td>
			<td>Biorad, Hercules, CA, USA</td>
			<td>170-3967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">UV crosslinker Model XL-1000</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:113px;">11-992-89</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Nucleic Acid chemiluminescent detection kit (Pierce)</td>
			<td>Thermo fisher Scientific, Rockford, IL, USA</td>
			<td align="right">89880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Ni-NTA agarose resin</td>
			<td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td>
			<td align="right">30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="119">
			<td height="119" style="height:119px;width:255px;">GenomePlex Whole genome amplification kit (Fragmentation buffer, library preparation buffer, library stabilization solution, library preparation enzyme, 10X amplification master mix, WGA polymerase )</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>WGA2-50RXN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Nanodrop ND-1000</td>
			<td colspan="2">Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA</td>
			<td>For quantitation of DNA</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Perfecta Sybr Green SuperMix, with ROX</td>
			<td>Quanta biosciences</td>
			<td>95055-500</td>
			<td>Any Sybr Green PCR mix may be used</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">PlateMax Ultra clear heat sealing film for qPCR</td>
			<td>Axygen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">96 well clear low profile PCR microplate</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td>
			<td colspan="2">PCR-96-LP-AB-C</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Applied Biosystems StepOne Plus Real time PCR system</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td>
			<td align="right">4376600</td>
			<td>Any real time PCR system may be used</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Qiaquick PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td>
			<td align="right">28104</td>
			<td>Any PCR clean up kit may be used</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Cy3/Cy5-labeled nonamers</td>
			<td>Trilink biotechnologies, San Diego, CA, USA</td>
			<td colspan="2">N46-0001, N46-0002</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Klenow polymerase 50,000U/ml, 3&#39;-5&#39; exo-</td>
			<td>New England Biolabs, Ipswich, MA</td>
			<td>M0212M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Hybridization system</td>
			<td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This company no longer makes arrays or related items, so alternate sources such as Agilent or Affymetrix will need to be used,</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Custom printed microarrays and mixers</td>
			<td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:255px;">Hybridization kit (2X Hybridization buffer, Hybridization component A, Alignment oligo)</td>
			<td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Wash buffer kit (10X Wash buffer I, II, III, 1 M DTT)</td>
			<td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">GenePix 4200A microarray scanner</td>
			<td colspan="2">Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA</td>
			<td>This model has been replaced by superior ones</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">GenePix Pro microarray software</td>
			<td colspan="2">Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Nimblescan v.2.4, ChIP-chip analysis software</td>
			<td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna-affinity-purified chip (dap-chip) method to determine gene targets for bacterial two component regulatory systems

Os métodos in vivo, tais como Chip-chip são técnicas bem estabelecidas usados ​​para determinar genes alvos globais para fatores de transcrição. No entanto, eles são de uso limitado na exploração de dois sistemas de regulação componente bacteriano com condições de ativação descaracterizados. Tais sistemas de regular a transcrição apenas quando activada, na presença de sinais únicos. Uma vez que estes sinais são muitas vezes desconhecidos, o método de microarray com base in vitro descritos neste artigo de vídeo podem ser utilizados para determinar alvos de genes e sítios de ligação para reguladores da resposta. Este método de ADN purificado por afinidade-chip pode ser utilizado para qualquer regulador purificada em qualquer organismo com um genoma sequenciado. O protocolo envolve permitindo que a proteína purificada marcado para se ligar ao DNA genómico cortado e, em seguida, a purificação por afinidade de ADN ligado à proteína, seguido de marcação fluorescente do ADN e hibridação com uma matriz de ladrilhos costume. Precedendo passos que podem ser utilizados para optimizar o ensaio para a especificidadereguladores c também são descritos. Os picos gerados pela análise dos dados de matriz são utilizados para prever motivos sítios de ligação, que são, em seguida, validada experimentalmente. As previsões motivo pode ser ainda utilizado para determinar genes alvos dos reguladores de resposta ortólogos em espécies estreitamente relacionadas. Nós demonstramos a aplicabilidade deste método através da determinação dos genes alvos e motivos do site vinculativo e prevendo, assim, a função de um regulador de resposta DVU3023-dependente sigma54 na bactéria Desulfovibrio vulgaris Hildenborough ambiental.

O método acima foi aplicado para determinar os genes alvos globais dos RRS no sulfato de modelo reduzindo bactéria Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7. Este organismo tem um grande número de TCS representado por mais de 70 RRS, indicando a vasta variedade de possíveis sinais que detecta e responde. Análise in vivo sobre as funções destes sistemas de sinalização são difíceis de realizar uma vez que os sinais e, assim, as suas condições de activação são desconhecidos. Aqui o...

Watch this Scientific Journal Video about DNA-affinity-purified Chip DAP-chip Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems at JoVE.com

DNA-affinity-purified Chip DAP-chip Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

DNA-afinidade-purificada Método Chip (DAP-chip) para determinar genes alvos para bacteriana Dois Sistemas Regulatórios componentes

Este artigo vídeo descreve um método de microarray baseado in vitro para determinar os genes alvos e sítios de ligação para dois reguladores de resposta do sistema de componentes.

In vivo methods such as ChIP-chip are well-established techniques used to determine global gene targets for transcription factors. However, they are of ...

Research

JoVE Journal

Biology

DNA-affinity-purified Chip (DAP-chip) Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Análise de Expressão Gênica Utilizando bacteriana Microarrays

Biologia

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

Oi-C: um método para estudar a arquitetura tridimensional de Genomas.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

Cromatina imunoprecipitação (chips) para a Modificação do ensaio dinâmico Histone na expressão dos genes ativados em células humanas

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Análise do genoma usando chip para identificar alvos isoforma específica Gene

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

Determinar a contribuição dos Sistemas de energia durante o exercício

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

O uso de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Imagem de órgãos inteiros e Histologia Tissue quantitativa para determinar o Bio-distribuição das moléculas fluorescente etiquetado

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

Usando um método imunohistoquímico de montagem total para estudar a preservação do trato biliar em<em&gt; Suncus murinus</em

This work describes the whole-mount immunohistochemistry staining method in detail, using neurofilament protein antibody to label the innervation of the ...

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

O ensaio de sequestro de lactato desidrogenase — Um método simples e confiável para determinar a atividade de Autophagic de sequestro em massa em células de mamíferos

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression

Imagem ao vivo de alta taxa de microcolônias para medir heterogeneidade no crescimento e expressão genética

Precise measurements of between- and within-strain heterogeneity in microbial growth rates are essential for understanding genetic and environmental ...

Profiling of H3K4me3 Modification in Plants using Cleavage under Targets and Tagmentation

Perfil da modificação H3K4me3 em plantas usando decote sob alvos e tagmentação

Epigenomic regulation at the chromatic level, including DNA and histone modifications, behaviors of transcription factors, and non-coding RNAs with their ...