Name: dna-affinity-purified chip (dap-chip) method to determine gene targets for bacterial two component regulatory systems
Uploaded: 2014-07-21T14:00:00
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Damos las gracias a Amy Chen por su ayuda en la preparación para la filmación del video y para la demostración de la técnica. Este trabajo realizado por ENIGMA: Ecosistemas y redes integradas con Genes y Asambleas Molecular (http://enigma.lbl.gov), un programa científico del área de focalización en el Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley, con el apoyo de la Oficina de Ciencia, Oficina de Biológica y Investigación del Medio Ambiente, del Departamento de Energía de los EE.UU. bajo el Contrato No. DE-AC02-05CH11231.

Nota: El protocolo a continuación está diseñado para la determinación de objetivos de genes de la DVU3023 RR de la bacteria Desulfovibrio vulgaris Hildenborough. Se puede adaptar a cualquier otro regulador transcripcional de interés. 1. Clone y Purify RR <ol><li> Clonar el gen RR, específicamente DVU3023, de D. vulgar Hildenborough en un vector de expresión de Escherichia coli tal que el gen es C-terminal marcada con His y la expresión es bajo el control ...

<ol>
	<li>Galperin, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+structure+and+function+of+response+regulator+output+domains.">Diversity of structure and function of response regulator output domains.</a> Curr Opin Microbiol. 13, 150-159 (2010).</li><li>Casino, P., Rubio, V., Marina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+signal+transduction+by+two-component+systems.">The mechanism of signal transduction by two-component systems.</a> Curr Opin Struct Biol. 20, 763-771 (2010).</li><li>Aparicio, O., Geisberg, J. V., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+for+determining+the+association+of+proteins+with+specific+genomic+sequences+in+vivo.">Chromatin immunoprecipitation for determining the association of proteins with specific genomic sequences in vivo.</a> Curr Protoc Cell Biol. 17 (17), (2004).</li><li>McCleary, W. R., Stock, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetyl+phosphate+and+the+activation+of+two-component+response+regulators.">Acetyl phosphate and the activation of two-component response regulators.</a> J Biol Chem. 269, 31567-31572 (1994).</li><li>Novichkov, P. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receiver+domain+structure+and+function+in+response+regulator+proteins.">Receiver domain structure and function in response regulator proteins.</a> Curr Opin Microbiol. 13, 142-149 (2010).</li><li>Gao, R., Stock, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+strategies+for+phosphorylation-mediated+regulation+of+response+regulator+activity.">Molecular strategies for phosphorylation-mediated regulation of response regulator activity.</a> Curr Opin Microbiol. 13, 160-167 (2010).</li><li>Hung, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+of+the+response+regulator+ComE+from+Streptococcus+mutans+is+affected+by+phosphorylation.">Oligomerization of the response regulator ComE from Streptococcus mutans is affected by phosphorylation.</a> J Bacteriol. 194, 1127-1135 (2012).</li><li>Ladds, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+response+regulator+Spo0A+from+Bacillus+subtilis+is+efficiently+phosphorylated+in+Escherichia+coli.">The response regulator Spo0A from Bacillus subtilis is efficiently phosphorylated in Escherichia coli.</a> FEMS Microbiol Lett. 223, 153-157 (2003).</li><li>Wen, Y., Feng, J., Scott, D. R., Marcus, E. A., Sachs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+HP0165-HP0166+two-component+system+in+expression+of+some+acidic-pH-upregulated+genes+of+Helicobacter+pylori.">Involvement of the HP0165-HP0166 two-component system in expression of some acidic-pH-upregulated genes of Helicobacter pylori.</a> J Bacteriol. 188, 1750-1761 (2006).</li><li>Liu, X., Noll, D. M., Lieb, J. D., Clarke, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIP-chip:+rapid+and+accurate+determination+of+DNA-binding+specificity.">DIP-chip: rapid and accurate determination of DNA-binding specificity.</a> Genome Res. 15, 421-427 (2005).</li><li>Gossett, A. J., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Immunoprecipitation+(DIP)+for+the+Determination+of+DNA-Binding+Specificity.">DNA Immunoprecipitation (DIP) for the Determination of DNA-Binding Specificity.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Mascher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Streptococcus+pneumoniae+cia+regulon:+CiaR+target+sites+and+transcription+profile+analysis.">The Streptococcus pneumoniae cia regulon: CiaR target sites and transcription profile analysis.</a> J Bacteriol. 185, 60-70 (2003).</li><li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq:+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology.">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).</li><li>Lefrancois, P., Zheng, W., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-Seq+using+high-throughput+DNA+sequencing+for+genome-wide+identification+of+transcription+factor+binding+sites.">ChIP-Seq using high-throughput DNA sequencing for genome-wide identification of transcription factor binding sites.</a> Methods Enzymol. 470, 77-104 (2010).</li><li>Ho, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-chip+versus+ChIP-seq:+lessons+for+experimental+design+and+data+analysis.">ChIP-chip versus ChIP-seq: lessons for experimental design and data analysis.</a> BMC Genomics. 12, 134 (2011).</li><li>Liu, X., Lee, C. K., Granek, J. A., Clarke, N. D., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+comparison+of+Leu3+binding+in+vitro+and+in+vivo+reveals+the+importance+of+nucleosome+occupancy+in+target+site+selection.">Whole-genome comparison of Leu3 binding in vitro and in vivo reveals the importance of nucleosome occupancy in target site selection.</a> Genome Res. 16, 1517-1528 (2006).</li></ol>

El método DAP-chip descrito aquí se utilizó con éxito para determinar los objetivos de genes durante varios RR en Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7 de los cuales uno se muestra aquí como un resultado representativo. Para DVU3023 RR, la elección de un objetivo de genes candidatos fue sencillo. DVU3025 está situada inmediatamente aguas abajo del gen RR, y los genes RR y de destino se conservan en varias especies Desulfovibrio, y adicionalmente DVU3025 tiene un promotor sigma54 depe...

La capacidad de las bacterias para sobrevivir y prosperar depende críticamente de lo bien que son capaces de percibir y responder a las perturbaciones en sus ambientes, y esto a su vez depende de los sistemas de transducción de señales. El número de sistemas de señalización A codifica bacteria que se ha llamado su &quot;IQ microbiana&quot; y puede ser una indicación de la variabilidad de su medio ambiente y su capacidad de detectar señales múltiples y afinar su respuesta 1. Sistemas de dos componentes de transducción de señales (TCS) son los sistemas de señalización más prevalentes utilizados por las bacterias, y que consisten en una histidina quinasa (HK) que detecta la señal externa y transmite a través de la fosforilación de un regulador de la respuesta efectora (RR) 2. RR puede tener una variedad de dominios de salida y por lo tanto diferentes modos efectoras, pero la respuesta más común es la regulación transcripcional a través de un ADN de dominio de unión 1. Las señales detectadas y las funciones correspondientes de los conductos deferentest mayoría de TCSs siguen siendo desconocidos. Aunque los métodos in vivo, tales como chip-chip se utilizan rutinariamente para la determinación de sitios de unión de factores de transcripción genómica 3, que sólo se pueden utilizar para bacterianas RR sistema de dos componentes si se conocen las condiciones de activación o señales. A menudo, las señales ambientales que activan una TCS son más difíciles de determinar que sus genes diana. El microarray de ensayo in vitro basado descrito aquí se puede utilizar para determinar eficaz y rápidamente los objetivos de genes y predecir funciones de TCSs. Este ensayo se aprovecha del hecho de que los RR se pueden fosforilar y por lo tanto activan in vitro utilizando pequeñas moléculas donantes como fosfato de acetilo 4. En este método, llamado DAP-chip para ADN-afinidad-chip purificado (Figura 1), el gen RR de interés se clona con una etiqueta de His en E. coli, y una proteína marcada posteriormente purificado se permite a Bind a esquilada de ADN genómico. El ADN unido a la proteína se enriquecen entonces por purificación por afinidad, el ADN enriquecido y de entrada se amplifican, marcado con fluorescencia, agrupados juntos y se hibridó a una matriz de mosaico que está hecho a medida para el organismo de interés (Figura 1). Microarray experimentos están sujetos a los artefactos, por lo que se emplean pasos adicionales para optimizar el ensayo. Una de esas medidas es tratar de determinar un objetivo para el RR en estudio el uso de ensayos de cambio de movilidad electroforética (EMSA) (véase el flujo de trabajo en la Figura 2). Entonces, después de la unión al ADN genómico y los pasos de DAP, el ADN unido a proteína y de entrada se examinó por qPCR para ver si el objetivo positivo se enriquece en la fracción unida a proteínas en relación con la fracción de entrada, confirmando de este modo las condiciones de unión óptimas para el RR (Figura 2). Después de la gama de hibridación, los datos se analizan para encontrar picos de señal de mayor intensidad que indican loci del genoma en donde la proteína had obligado. Las funciones pueden ser predichos para el RR en base a los objetivos de genes obtenidos. Los loci genómicos de destino se utilizan para predecir motivos sitio de unión, que luego son validados experimentalmente utilizando EMSAs (Figura 2). Las predicciones funcionales y objetivos de genes para el RR pueden entonces extenderse a especies que codifican los RR ortólogos mediante el escaneo de los genomas de los motivos de unión similares (Figura 2), estrechamente relacionado. El método DAP-chip puede proporcionar una gran cantidad de información de un TCS donde antes no había ninguna. El método también puede utilizarse para cualquier regulador transcripcional si la proteína se puede purificar y condiciones de unión de ADN se puede determinar, y para cualquier organismo de interés con una secuencia del genoma disponible. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51715/51715fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. El chip purificado-ADN-afinidad (DAP-chip) estrategia 7. El gen RR a partir del organismo de interés se clona con un carboxi-terminal de His-tag en una E. cepa de expresión coli. Se purificó la proteína marcada con His se activa por fosforilación con fosfato de acetilo, y se mezcla con el ADN genómico cortado. Una alícuota de la reacción de unión se guarda como ADN de entrada, mientras que el resto se sometió a purificación de afinidad utilizando resina de Ni-NTA. La entrada y el ADN RR-unidos se todo el genoma amplificado, y marcado con Cy3 y Cy5, respectivamente. El ADN marcado se agrupen y se hibridó a una matriz de suelo de baldosas, que luego se analizó para determinar los objetivos de genes. Figura modificado y reimpreso con el licencia creative commons de 7. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51715/51715fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Resumen de flujo de trabajo. Para cualquier protei etiquetados purificadon, comenzar por la determinación de un destino utilizando la EMSA. Permitir proteínas se unen al ADN genómico y ADN-purificar por afinidad (DAP) y la totalidad de su genoma amplificar (WGA) y la entrada de ADN enriquecido. Si se conoce un gen objetivo, utilizar la qPCR para asegurar que el objetivo conocido se enriquece en la fracción unida a proteínas. Si se pudo determinar ningún objetivo, pase directamente al marcaje de ADN y la gama de hibridación. Si no se pudo observar el enriquecimiento por qPCR, a continuación, repetir la proteína de unión-ADNg y pasos DAP-WGA utilizando diferentes cantidades de proteína. Utilice el análisis conjunto para encontrar picos y asignarlos a los genes objetivo. Utilice las regiones aguas arriba de los genes diana de predecir motivos sitio de unión. Validar los motivos experimentalmente utilizando EMSAs. Utilice el motivo para escanear los genomas de las especies relacionadas que codifican ortólogos de la RR en estudio, y predecir determinados genes en estas especies también. Sobre la base de los objetivos de genes obtenidos, la función fisiológica de la RR y sus ortólogos se puede predecir. Figura modificado y reimpreso usando el C creativoommons licencia de 7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="719">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:248px;">Company</td>
			<td style="width:113px;">Catalog number</td>
			<td style="width:104px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">HisTrapFF column (Ni-Sepharose column)</td>
			<td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>17-5255-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Akta explorer (FPLC instrument)</td>
			<td colspan="2">GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">HiPrep 26/10 Desalting column</td>
			<td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>17-5087-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Qiaquick Gel extraction kit</td>
			<td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td>
			<td align="right">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Biotin-labeled oligonucleotides</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">6% polyacrylamide-0.5X TBE precast mini DNA retardation gel</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td>
			<td>EC63652BOX</td>
			<td>Alternately, you can pour your own gel.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Nylon membrane</td>
			<td>EMD Millipore, Billerica, MA, USA</td>
			<td>INYC00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Trans-Blot SD Semi-dry electrophoretic transfer cell</td>
			<td>Biorad, Hercules, CA, USA</td>
			<td>170-3940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Extra thick blot paper, 8 x 13.5 cm</td>
			<td>Biorad, Hercules, CA, USA</td>
			<td>170-3967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">UV crosslinker Model XL-1000</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:113px;">11-992-89</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Nucleic Acid chemiluminescent detection kit (Pierce)</td>
			<td>Thermo fisher Scientific, Rockford, IL, USA</td>
			<td align="right">89880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Ni-NTA agarose resin</td>
			<td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td>
			<td align="right">30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="119">
			<td height="119" style="height:119px;width:255px;">GenomePlex Whole genome amplification kit (Fragmentation buffer, library preparation buffer, library stabilization solution, library preparation enzyme, 10X amplification master mix, WGA polymerase )</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>WGA2-50RXN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Nanodrop ND-1000</td>
			<td colspan="2">Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA</td>
			<td>For quantitation of DNA</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Perfecta Sybr Green SuperMix, with ROX</td>
			<td>Quanta biosciences</td>
			<td>95055-500</td>
			<td>Any Sybr Green PCR mix may be used</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">PlateMax Ultra clear heat sealing film for qPCR</td>
			<td>Axygen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">96 well clear low profile PCR microplate</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td>
			<td colspan="2">PCR-96-LP-AB-C</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Applied Biosystems StepOne Plus Real time PCR system</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td>
			<td align="right">4376600</td>
			<td>Any real time PCR system may be used</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Qiaquick PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td>
			<td align="right">28104</td>
			<td>Any PCR clean up kit may be used</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Cy3/Cy5-labeled nonamers</td>
			<td>Trilink biotechnologies, San Diego, CA, USA</td>
			<td colspan="2">N46-0001, N46-0002</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Klenow polymerase 50,000U/ml, 3&#39;-5&#39; exo-</td>
			<td>New England Biolabs, Ipswich, MA</td>
			<td>M0212M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Hybridization system</td>
			<td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This company no longer makes arrays or related items, so alternate sources such as Agilent or Affymetrix will need to be used,</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Custom printed microarrays and mixers</td>
			<td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:255px;">Hybridization kit (2X Hybridization buffer, Hybridization component A, Alignment oligo)</td>
			<td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Wash buffer kit (10X Wash buffer I, II, III, 1 M DTT)</td>
			<td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">GenePix 4200A microarray scanner</td>
			<td colspan="2">Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA</td>
			<td>This model has been replaced by superior ones</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">GenePix Pro microarray software</td>
			<td colspan="2">Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Nimblescan v.2.4, ChIP-chip analysis software</td>
			<td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna-affinity-purified chip (dap-chip) method to determine gene targets for bacterial two component regulatory systems

Los métodos in vivo como chip-chip son técnicas bien establecidas que se utilizan para determinar dianas génicas globales para los factores de transcripción. Sin embargo, son de uso limitado en la exploración de dos sistemas de regulación componente bacteriano con condiciones de activación no caracterizados. Tales sistemas regulan la transcripción sólo cuando se activa en la presencia de señales únicas. Puesto que estas señales son a menudo desconocida, el método in vitro de microarrays basado en describe en este artículo de vídeo se puede utilizar para determinar objetivos de genes y sitios de unión para los reguladores de respuesta. Este método chip purificado-ADN-afinidad puede ser utilizado para cualquier regulador purificado en cualquier organismo con un genoma secuenciado. El protocolo consiste en permitir que la proteína marcada purificada para unirse al ADN genómico cortado y después de purificación por afinidad del ADN a las proteínas, seguido de marcaje fluorescente del ADN y la hibridación con un suelo de baldosas gama personalizado. Precediendo pasos que se pueden usar para optimizar el ensayo para la especificaciónTambién se describen los reguladores c. Los picos generados por el análisis de datos de la matriz se utilizan para predecir motivos sitio de unión, que luego se validan experimentalmente. Los motivo de las predicciones se pueden usar además para determinar objetivos de genes de respuesta de los reguladores ortólogos en especies estrechamente relacionadas. Se demuestra la aplicabilidad de este método mediante la determinación de los objetivos de genes y vinculante motivos sitio y predecir así la función de un regulador de respuesta DVU3023 sigma54 dependiente en la bacteria Desulfovibrio vulgaris ambiental Hildenborough.

El método anterior se aplicó para determinar los genes objetivos globales de los RR en el modelo de reducción de sulfato bacteria Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7. Este organismo tiene un gran número de TCSs representado por más de 70 RR, lo que indica la amplia variedad de posibles señales que detecta y responde a. Los análisis in vivo en las funciones de estos sistemas de señalización son difíciles de realizar, ya que sus señales y por lo tanto sus condiciones de activaci?...

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DNA-affinity-purified Chip DAP-chip Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

Purificado de ADN afinidad Chip (DAP-chip) Método para determinar los objetivos de genes para bacteriana Dos Sistemas Regulatorios componentes

Este artículo de vídeo describe un método de microarrays basado en vitro para determinar los objetivos de genes y sitios de unión para dos reguladores de respuesta del sistema de componentes.

In vivo methods such as ChIP-chip are well-established techniques used to determine global gene targets for transcription factors. However, they are of ...

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Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) para el ensayo dinámico de modificación de las histonas en la expresión génica activado en las células humanas

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Análisis de todo el genoma con chip para identificar objetivos específicos para cada isoforma Gene

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

Determinación de la Contribución de los Sistemas de energía durante el ejercicio

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

El uso de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Imaging entero de órganos y de tejidos Histología cuantitativa para determinar la bio-distribución de las moléculas marcadas con fluorescencia

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

Uso de un método inmunohistoquímico de montaje completo para estudiar la inervación del tracto biliar en<em&gt; Suncus murinus</em

This work describes the whole-mount immunohistochemistry staining method in detail, using neurofilament protein antibody to label the innervation of the ...

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

El ensayo de secuestro del lactato deshidrogenasa, Es un método Simple y confiable para determinar la actividad de autofagia secuestro a granel en células de mamíferos

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression

Imágenes en vivo de alto rendimiento de microcolonias para medir la heterogeneidad en crecimiento y expresión génica

Precise measurements of between- and within-strain heterogeneity in microbial growth rates are essential for understanding genetic and environmental ...

Profiling of H3K4me3 Modification in Plants using Cleavage under Targets and Tagmentation

Elaboración de perfiles de modificación de H3K4me3 en plantas utilizando escisión bajo objetivos y etiquetado

Epigenomic regulation at the chromatic level, including DNA and histone modifications, behaviors of transcription factors, and non-coding RNAs with their ...