Name: dna-affinity-purified chip (dap-chip) method to determine gene targets for bacterial two component regulatory systems
Uploaded: 2014-07-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA-affinity-purified Chip DAP-chip Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems at JoVE.com

Vi tackar Amy Chen för hennes hjälp i förberedelserna för video shoot och för att demonstrera tekniken. Arbetet utfördes av ENIGMA: Ekosystem och nätverk Integrerat med Gener och Molecular Assemblies (http://enigma.lbl.gov), en vetenskaplig Fokusområde Program vid Lawrence Berkeley National Laboratory, stöddes av Office of Science, kontor för bio-och Environmental Research, av US Department of Energy enligt kontrakt nr DE-AC02-05CH11231.

OBS: Protokollet nedan är anpassad för bestämning av genen mål i RR DVU3023 från bakterien Desulfovibrio vulgaris Hildenborough. Den kan anpassas till varje annan transkriptionsregulator av intresse. 1. Clone och rena RR <ol><li> Klona RR genen, speciellt DVU3023, från D. vulgaris Hildenborough in i en Escherichia coli-uttrycksvektor så att den gen som är C-terminalt His-märkt och expression är under kontroll av en T7-promotor. Anmärkning: Flera...

<ol>
	<li>Galperin, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+structure+and+function+of+response+regulator+output+domains.">Diversity of structure and function of response regulator output domains.</a> Curr Opin Microbiol. 13, 150-159 (2010).</li><li>Casino, P., Rubio, V., Marina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+signal+transduction+by+two-component+systems.">The mechanism of signal transduction by two-component systems.</a> Curr Opin Struct Biol. 20, 763-771 (2010).</li><li>Aparicio, O., Geisberg, J. V., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+for+determining+the+association+of+proteins+with+specific+genomic+sequences+in+vivo.">Chromatin immunoprecipitation for determining the association of proteins with specific genomic sequences in vivo.</a> Curr Protoc Cell Biol. 17 (17), (2004).</li><li>McCleary, W. R., Stock, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetyl+phosphate+and+the+activation+of+two-component+response+regulators.">Acetyl phosphate and the activation of two-component response regulators.</a> J Biol Chem. 269, 31567-31572 (1994).</li><li>Novichkov, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RegPrecise+web+services+interface:+programmatic+access+to+the+transcriptional+regulatory+interactions+in+bacteria+reconstructed+by+comparative+genomics.">RegPrecise web services interface: programmatic access to the transcriptional regulatory interactions in bacteria reconstructed by comparative genomics.</a> Nucleic Acids Res. 40, 604-608 (2012).</li><li>Studholme, D. J., Buck, M., Nixon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+potential+sigma(N)-dependent+promoters+in+bacterial+genomes.">Identification of potential sigma(N)-dependent promoters in bacterial genomes.</a> Microbiology. 146 (12), 3021-3023 (2000).</li><li>Rajeev, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+mapping+of+two+component+response+regulators+to+gene+targets+in+a+model+sulfate+reducing+bacterium.">Systematic mapping of two component response regulators to gene targets in a model sulfate reducing bacterium.</a> Genome Biol. 12, 99 (2011).</li><li>Crooks, G. E., Hon, G., Chandonia, J. M., Brenner, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WebLogo:+a+sequence+logo+generator.">WebLogo: a sequence logo generator.</a> Genome Res. 14, 1188-1190 (2004).</li><li>Barbieri, C. M., Mack, T. R., Robinson, V. L., Miller, M. T., Stock, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+response+regulator+autophosphorylation+through+interdomain+contacts.">Regulation of response regulator autophosphorylation through interdomain contacts.</a> J Biol Chem. 285, 32325-32335 (2010).</li><li>Bourret, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receiver+domain+structure+and+function+in+response+regulator+proteins.">Receiver domain structure and function in response regulator proteins.</a> Curr Opin Microbiol. 13, 142-149 (2010).</li><li>Gao, R., Stock, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+strategies+for+phosphorylation-mediated+regulation+of+response+regulator+activity.">Molecular strategies for phosphorylation-mediated regulation of response regulator activity.</a> Curr Opin Microbiol. 13, 160-167 (2010).</li><li>Hung, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+of+the+response+regulator+ComE+from+Streptococcus+mutans+is+affected+by+phosphorylation.">Oligomerization of the response regulator ComE from Streptococcus mutans is affected by phosphorylation.</a> J Bacteriol. 194, 1127-1135 (2012).</li><li>Ladds, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+response+regulator+Spo0A+from+Bacillus+subtilis+is+efficiently+phosphorylated+in+Escherichia+coli.">The response regulator Spo0A from Bacillus subtilis is efficiently phosphorylated in Escherichia coli.</a> FEMS Microbiol Lett. 223, 153-157 (2003).</li><li>Wen, Y., Feng, J., Scott, D. R., Marcus, E. A., Sachs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+HP0165-HP0166+two-component+system+in+expression+of+some+acidic-pH-upregulated+genes+of+Helicobacter+pylori.">Involvement of the HP0165-HP0166 two-component system in expression of some acidic-pH-upregulated genes of Helicobacter pylori.</a> J Bacteriol. 188, 1750-1761 (2006).</li><li>Liu, X., Noll, D. M., Lieb, J. D., Clarke, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIP-chip:+rapid+and+accurate+determination+of+DNA-binding+specificity.">DIP-chip: rapid and accurate determination of DNA-binding specificity.</a> Genome Res. 15, 421-427 (2005).</li><li>Gossett, A. J., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Immunoprecipitation+(DIP)+for+the+Determination+of+DNA-Binding+Specificity.">DNA Immunoprecipitation (DIP) for the Determination of DNA-Binding Specificity.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Mascher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Streptococcus+pneumoniae+cia+regulon:+CiaR+target+sites+and+transcription+profile+analysis.">The Streptococcus pneumoniae cia regulon: CiaR target sites and transcription profile analysis.</a> J Bacteriol. 185, 60-70 (2003).</li><li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq:+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology.">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).</li><li>Lefrancois, P., Zheng, W., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-Seq+using+high-throughput+DNA+sequencing+for+genome-wide+identification+of+transcription+factor+binding+sites.">ChIP-Seq using high-throughput DNA sequencing for genome-wide identification of transcription factor binding sites.</a> Methods Enzymol. 470, 77-104 (2010).</li><li>Ho, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-chip+versus+ChIP-seq:+lessons+for+experimental+design+and+data+analysis.">ChIP-chip versus ChIP-seq: lessons for experimental design and data analysis.</a> BMC Genomics. 12, 134 (2011).</li><li>Liu, X., Lee, C. K., Granek, J. A., Clarke, N. D., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+comparison+of+Leu3+binding+in+vitro+and+in+vivo+reveals+the+importance+of+nucleosome+occupancy+in+target+site+selection.">Whole-genome comparison of Leu3 binding in vitro and in vivo reveals the importance of nucleosome occupancy in target site selection.</a> Genome Res. 16, 1517-1528 (2006).</li></ol>

DAP-chip-metod som beskrivs här har med framgång använts för att bestämma genen mål för flera RRs i Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7 av vilka en visas här som ett representativt resultat. För RR DVU3023, välja en kandidat gen mål var enkelt. DVU3025 är belägen omedelbart nedströms om RR-genen och RR och målgener är konserverade i flera Desulfovibrio arter, och dessutom DVU3025 har en förutsagd sigma54-beroende promotor. EMSA tillhandahåller en enkel metod för att sna...

Förmågan hos bakterier att överleva och frodas är kritiskt beroende på hur väl de kan uppfatta och reagera på störningar i sina miljöer, och detta i sin tur är beroende av sina signalöverföringssystem. Antalet signalsystem en bakterie Kodar har kallat sin &quot;mikrobiell IQ&quot; och kan vara en indikation på såväl variationen i dess miljö och dess förmåga att känna flera signaler och finjustera sitt svar 1. Två komponentsignalöverföringssystem (TCS) är de vanligaste signalsystem som används av bakterier, och de består av en histidin kinas (HK) som känner av den externa signalen och sänder via fosforylering till en effektor svar regulator (RR) 2. RR kan ha en mängd olika utgångs domäner och därmed olika effektor lägen, men det vanligaste svaret är transkriptionsreglering via en DNA-bindande domän 1. De signaler, som avkänns och de motsvarande funktionerna hos vast majoriteten av TV-kamerasystem är fortfarande okända. Även in vivo-metoder såsom chip-chip används rutinmässigt för bestämning av genomiska bindningsställen för transkriptionsfaktorer 3, kan de endast användas för bakteriella tvåkomponentsystem RR om aktiverande villkor eller signaler är kända. Ofta de miljömässiga signaler som aktiverar en TCS är svårare att avgöra än sina genen mål. Den in vitro-mikroarray-baserad analys som beskrivs här kan användas för att effektivt och snabbt bestämma genmål och förutse funktioner TV-kamerasystem. Denna analys tar fördel av det faktum att RR kan fosforyleras och sålunda aktiveras in vitro med användning av små molekyler givare som acetylfosfat 4. I denna metod, benämnd DAP-chip för DNA-affinitetsrenat-chip (figur 1), är RR intressanta genen klonas med en His-tag i E. coli och renas därefter taggade proteinet tillåts bind att skjuvas genom-DNA. Den proteinbundna DNA sedan berikas av affinitetsrening, är det anrikade och input-DNA förstärks, fluorescerande, sammanförs och hybridiseras till en kakel array som anpassade görs till organismen av intresse (Figur 1). Microarray experiment är föremål för artefakter och därmed ytterligare steg används för att optimera analysen. Ett sådant steg är att försöka bestämma ett mål för RR som studeras med hjälp av elektro mobilitet förskjutningsanalyser (EMSA) (se arbetsflödet i Figur 2). Sedan, efter bindning till genomiskt DNA och DAP steg, är proteinbundet och input-DNA undersöktes genom qPCR för att se om den positiva målet anrikas i den proteinbundna fraktionen i förhållande till den ingående fraktionen, vilket bekräftar optimala bindningsbetingelser för RR (Figur 2). Efter array hybridisering, är de data som analyseras för att hitta toppar av högre intensitet signal som indikerar genomisk lokus där proteinet had bunden. Funktioner kan förutsägas för RR baserad på genen mål som uppnåtts. De målinriktade genomic loci används för att förutsäga bindningsställemotiv, vilka sedan experimentellt validerade använder EMSAs (Figur 2). De funktionella förutsägelser och gen mål för RR kan sedan utvidgas till att nära besläktade arter som kodar ortologa RR genom att skanna dessa genomen för liknande bindande motiv (Figur 2). DAP-chip-metoden kan ge en mängd information för en TCS där tidigare det fanns ingen. Metoden kan också användas för någon transkriptionsregulator om proteinet kan renas och DNA-bindningsförhållanden kan bestämmas, och för en organism av intresse med en genomsekvens som finns tillgänglig. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51715/51715fig1highres.jpg" width="500" /> Figur 1. DNA-affinitetsrenat-chip (DAP-chip) strategi 7. RR-genen från organismen av intresse klonas med en karboxi-terminal His-tag i en E. coli-expressionsstammen. Purified His-märkta proteinet aktiveras genom fosforylering med acetylfosfat, och blandas med skjuvade genomiskt DNA. En alikvot av bindningsreaktionen sparas som input-DNA, medan resten utsattes för affinitetsrening med användning av Ni-NTA-harts. Ingången och RR bundna DNA är hela genom förstärkt, och märkta med Cy3 och Cy5, respektive. Det märkta DNA poolas tillsammans och hybridiserades till en plattsättning array, som sedan analyseras för att fastställa genmål. Figur modifierad och omtryckt genom att använda Creative Commons-licens från 7. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51715/51715fig2highres.jpg" width="500" /> Figur 2. Sammanfattning av arbetsflöde. För varje renad taggade protein, börja med att bestämma ett mål med hjälp av Europeiska sjösäkerhetsbyrån. Låt protein för att binda iskt DNA och DNA-affinitetsrena (DAP) och hela genomet förstärker (WGA) den berikade och input-DNA. Om en gen som målet är känt använder qPCR för att säkerställa att det kända målet anrikas i den proteinbundna fraktionen. Om inget mål kunde bestämmas, gå direkt till DNA-märkning och array hybridisering. Om anrikning av qPCR inte kunde observeras, sedan upprepa protein gDNA bindande och DAP-WGA steg med hjälp av olika protein belopp. Använd array analys för att hitta toppar och mappa dem till mål gener. Använd de uppströms regionerna av målgener för att förutsäga bindningsställe motiv. Validera motiven experimentellt med EMSAs. Använd motivet att skanna genom av besläktade arter som kodar ortologer av RR som studeras, och förutsäga gener inriktade på dessa arter. Baserat på genen mål som uppnåtts, kan den fysiologiska funktionen av RR och dess ortologer förutsägas. Figur modifierad och omtryckt genom att använda den kreativa commons licens från 7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="719">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:248px;">Company</td>
			<td style="width:113px;">Catalog number</td>
			<td style="width:104px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">HisTrapFF column (Ni-Sepharose column)</td>
			<td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>17-5255-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Akta explorer (FPLC instrument)</td>
			<td colspan="2">GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">HiPrep 26/10 Desalting column</td>
			<td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>17-5087-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Qiaquick Gel extraction kit</td>
			<td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td>
			<td align="right">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Biotin-labeled oligonucleotides</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">6% polyacrylamide-0.5X TBE precast mini DNA retardation gel</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td>
			<td>EC63652BOX</td>
			<td>Alternately, you can pour your own gel.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Nylon membrane</td>
			<td>EMD Millipore, Billerica, MA, USA</td>
			<td>INYC00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Trans-Blot SD Semi-dry electrophoretic transfer cell</td>
			<td>Biorad, Hercules, CA, USA</td>
			<td>170-3940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Extra thick blot paper, 8 x 13.5 cm</td>
			<td>Biorad, Hercules, CA, USA</td>
			<td>170-3967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">UV crosslinker Model XL-1000</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:113px;">11-992-89</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Nucleic Acid chemiluminescent detection kit (Pierce)</td>
			<td>Thermo fisher Scientific, Rockford, IL, USA</td>
			<td align="right">89880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Ni-NTA agarose resin</td>
			<td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td>
			<td align="right">30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="119">
			<td height="119" style="height:119px;width:255px;">GenomePlex Whole genome amplification kit (Fragmentation buffer, library preparation buffer, library stabilization solution, library preparation enzyme, 10X amplification master mix, WGA polymerase )</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>WGA2-50RXN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Nanodrop ND-1000</td>
			<td colspan="2">Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA</td>
			<td>For quantitation of DNA</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Perfecta Sybr Green SuperMix, with ROX</td>
			<td>Quanta biosciences</td>
			<td>95055-500</td>
			<td>Any Sybr Green PCR mix may be used</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">PlateMax Ultra clear heat sealing film for qPCR</td>
			<td>Axygen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">96 well clear low profile PCR microplate</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td>
			<td colspan="2">PCR-96-LP-AB-C</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Applied Biosystems StepOne Plus Real time PCR system</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td>
			<td align="right">4376600</td>
			<td>Any real time PCR system may be used</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Qiaquick PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td>
			<td align="right">28104</td>
			<td>Any PCR clean up kit may be used</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Cy3/Cy5-labeled nonamers</td>
			<td>Trilink biotechnologies, San Diego, CA, USA</td>
			<td colspan="2">N46-0001, N46-0002</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Klenow polymerase 50,000U/ml, 3&#39;-5&#39; exo-</td>
			<td>New England Biolabs, Ipswich, MA</td>
			<td>M0212M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Hybridization system</td>
			<td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This company no longer makes arrays or related items, so alternate sources such as Agilent or Affymetrix will need to be used,</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Custom printed microarrays and mixers</td>
			<td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:255px;">Hybridization kit (2X Hybridization buffer, Hybridization component A, Alignment oligo)</td>
			<td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Wash buffer kit (10X Wash buffer I, II, III, 1 M DTT)</td>
			<td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">GenePix 4200A microarray scanner</td>
			<td colspan="2">Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA</td>
			<td>This model has been replaced by superior ones</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">GenePix Pro microarray software</td>
			<td colspan="2">Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Nimblescan v.2.4, ChIP-chip analysis software</td>
			<td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna-affinity-purified chip (dap-chip) method to determine gene targets for bacterial two component regulatory systems

In vivo-metoder såsom chip-chip är väl etablerade tekniker som används för att fastställa det övergripande gen mål för transkriptionsfaktorer. De är dock av begränsad nytta för att utforska bakteriella två komponent regelsystem med uncharacterized aktiveringsvillkor. Sådana system endast reglerar transkriptionen när den aktiveras i närvaro av unika signaler. Eftersom dessa signaler är ofta okänd, kan det in vitro-mikromatrisbaserad metod som beskrivs i denna video artikeln användas för att bestämma genen mål och bindningsställen för responsregulatorer. Denna DNA-affinitetsrenade-chip metoden kan användas för alla renade regulatorn i organismen med en sekvens genom. Protokollet involverar att låta den renade märkta proteinet att binda till skjuvade genomiskt DNA och därefter affinitetsrenande erhållna proteinbundna DNA: t, följt av fluorescensmärkning av DNA: t och hybridisering till en anpassad tiling array. Föregående stegen, som kan användas för att optimera analysen för specific tillsynsmyndigheter beskrivs också. Topparna som genereras genom analys av array-data används för att förutsäga bindningsställemotiv, vilka sedan experimentellt validerade. De motiv förutsägelser kan användas vidare för att bestämma genen mål av ortologa regulatorer svar på närbesläktade arter. Vi visar att tillämpningen av denna metod genom att bestämma genen mål och bindande site motiv och därmed förutsäga funktionen för en sigma54 beroende respons regulator DVU3023 i miljö bakterien Desulfovibrio vulgaris Hildenborough.

Metoden ovan tillämpades för att fastställa de globala genmål av RRS i modellen sulfatreducerande bakterie Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7. Denna organism har ett stort antal TV-kamerasystem som representeras av över 70 RR, anger många möjliga signaler som den känner och reagerar på. In vivo-analyser på funktionerna i dessa signalsystem är svåra att utföra eftersom deras signaler och därmed deras aktiverande villkor är okända. Här DAP-chip metod användes för att bes...

Watch this Scientific Journal Video about DNA-affinity-purified Chip DAP-chip Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems at JoVE.com

DNA-affinity-purified Chip DAP-chip Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

DNA-affinitetsrenade Chip (DAP-chip) metod för att bestämma genen mål för bakteriell Två komponent regelsystem

Denna video artikeln beskriver en microarray baserad in vitro-metod för att bestämma genen mål och bindningsställen för två komponentregulatorer systemets svars.

In vivo methods such as ChIP-chip are well-established techniques used to determine global gene targets for transcription factors. However, they are of ...

Research

JoVE Journal

Biology

DNA-affinity-purified Chip (DAP-chip) Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Bakteriell Gene Expression Analysis Använda Microarrays

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

Hi-C: En metod för att studera den tredimensionella arkitektur för ledare.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

Kromatin Immunoprecipitation (chip) för analys Dynamisk Histon Ändring i aktiverade genuttryck i humana celler

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Genomvid Analys med hjälp av chip för att identifiera isoform-specifik gen mål

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

Fastställande av bidrag Energy Systems under träning

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Användningen av<em&gt; Ex vivo</em&gt; Hela organ Imaging och Kvantitativ Tissue histologi att bestämma Bio-fördelningen av fluorescerande molekyler

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

Användning av en helmonterad immunhistokemisk metod för att studera gallringens innervation i<em&gt; Suncus murinus</em

This work describes the whole-mount immunohistochemistry staining method in detail, using neurofilament protein antibody to label the innervation of the ...

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Laktatdehydrogenas kvarstad analysen — En enkel och tillförlitlig metod för att bestämma Bulk Autophagic kvarstad aktivitet i däggdjursceller

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression

Live imaging av mikrokolonier med hög genomströmning för att mäta heterogenitet i tillväxt och genuttryck

Precise measurements of between- and within-strain heterogeneity in microbial growth rates are essential for understanding genetic and environmental ...

Profiling of H3K4me3 Modification in Plants using Cleavage under Targets and Tagmentation

Profilering av H3K4me3 Modifiering i växter som använder klyvning under mål och tagning

Epigenomic regulation at the chromatic level, including DNA and histone modifications, behaviors of transcription factors, and non-coding RNAs with their ...