Name: generation and purification of human ino80 chromatin remodeling complexes and subcomplexes
Uploaded: 2014-10-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes at JoVE.com

Lavoro in laboratorio degli autori è supportata da una sovvenzione da parte del National Institute of scienze mediche generali (GM41628) e da una sovvenzione all&#39;Istituto Stowers per la ricerca medica da Helen Nelson Medical Research Fund presso la Greater Kansas City Community Foundation.

1 Generazione e Cultura HEK293 linee cellulari stabili che esprimono versioni mutate di FLAG Figura intera o epitopi-tagged INO80 o altre subunità INO80 Complex <ol><li> Clone cDNA codificante intera lunghezza o mutante umano INO80 ATPasi o un&#39;altra subunità INO80 nel vettore di espressione di mammifero pcDNA5 / FRT con un morsetto N tag epitopo FLAG in-frame. </li><li> Confermare la sequenza dei cDNA inserito dal sequenziamento del DNA prima di procedere. </li><li> Per eseguire la trasfezione, crescere Flp-In c...

<ol>
	<li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+chromatin+remodeling+complexes,+Annual+Review+of+Biochemistry.">The biology of chromatin remodeling complexes, Annual Review of Biochemistry.</a> 78, 273-304 (2009).</li><li>Szerlong, H., Hinada, K., Viswanathan, R., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HSA+domain+binds+nuclear+actin-related+proteins+to+regulate+chromatin-remodeling+ATPases.">The HSA domain binds nuclear actin-related proteins to regulate chromatin-remodeling ATPases.</a> Nature Struct. Mol. Biol. 15 (5), 469-476 (2008).</li><li>Shen, X., Mizuguchi, G., Hamiche, A., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromatin+remodelling+complex+involved+in+transcription+and+DNA+processing.">A chromatin remodelling complex involved in transcription and DNA processing.</a> Nature. 406 (6795), 541-544 (2000).</li><li>Shen, X., Ranallo, R., Choi, E., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+actin-related+proteins+in+ATP-dependent+chromatin+remodelling.">Involvement of actin-related proteins in ATP-dependent chromatin remodelling.</a> Mol. Cell. 12, 147-155 (2003).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+organization+of+the+human+INO80+chromatin+remodeling+complex:+an+evolutionarily+conserved+core+complex+catalyzes+ATP-dependent+nucleosome+remodeling.">Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (13), 11283-11289 (2011).</li><li>Sauer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+recombination:+developments+and+applications.">Site-specific recombination: developments and applications.</a> 5 (5), 521-527 (1994).</li><li>Gorman, S., Fox, D. T., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinase-mediated+gene+activation+and+site-specific+integration+in+mammalian+cells.">Recombinase-mediated gene activation and site-specific integration in mammalian cells.</a> Science. 251 (4999), 1351-1355 (1991).</li><li>Jin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammalian+chromatin+remodeling+complex+with+similarities+to+the+yeast+INO80+complex.">A mammalian chromatin remodeling complex with similarities to the yeast INO80 complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41207-41212 (2005).</li><li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YY1+functions+with+INO80+to+activate+transcription.">YY1 functions with INO80 to activate transcription.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 14 (9), 872-874 (2007).</li><li>Yao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Modes+of+Regulation+of+the+Uch37+Deubiquitinating+Enzyme+in+the+Proteasome+and+in+the+Ino80+Chromatin-Remodeling+Complex.">Distinct Modes of Regulation of the Uch37 Deubiquitinating Enzyme in the Proteasome and in the Ino80 Chromatin-Remodeling Complex.</a> Mol.Cell. 31 (6), 909-917 (2008).</li><li>Brizzard, B. L., Chubet, R. G., Vizard, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoaffinity+purification+of+FLAG+epitope-tagged+bacterial+alkaline+phosphatase+using+a+novel+monoclonal+antibody+and+peptide+elution,+Biotechniques.">Immunoaffinity purification of FLAG epitope-tagged bacterial alkaline phosphatase using a novel monoclonal antibody and peptide elution, Biotechniques.</a> 16 (4), 730-735 (1994).</li><li>Barker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> At the Bench: A Laboratory Navigator. 10, 207-245 (2005).</li><li>Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+transcription+initiation+by+RNA+polymerase+II+in+a+soluble+extract+from+isolated+mammalian+cell+nuclei.">Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian cell nuclei.</a> Nucleic. Acids. Res. 11 (5), 1475-1489 (1983).</li></ol>

Studi strutturali e funzionali di multi-subunità complessi di rimodellamento della cromatina mammiferi da eucarioti superiori sono stati ostacolati dalla difficoltà di preparare biochimicamente quantità utili di tali complessi contenenti subunità mutante o privi di alcune subunità del tutto. Ci sono una serie di ostacoli tecnici: In primo luogo, la manipolazione genetica in cellule di mammifero è stato tecnicamente impegnativo e richiede tempo. A differenza delle cellule di lievito, il cui genoma può essere facil...

Evolutivamente conservata di famiglia SNF2 complessi di rimodellamento della cromatina sono regolatori chiave di organizzazione della cromatina e l&#39;accessibilità del DNA 1. Questi complessi di rimodellamento comprendono sempre una centrale SNF2-come ATPasi subunità, che, in alcuni casi, assembla con diverse proteine ​​accessorie e forma macro-molecolare assiemi multi-subunità. Per studiare i dettagli molecolari del processo di rimodellamento della cromatina ATP-dipendente, è importante comprendere i contributi di determinati sottoinsiemi di subunità e / o strutture di dominio per le attività dei complessi. Tali analisi richiedono la capacità di generare complessi mutanti altamente purificate che non hanno particolari subunità proteiche o strutture di dominio. Precedenti studi struttura-funzione di ATP-dipendenti complessi di rimodellamento della cromatina sono ampiamente concentrata sul sistema modello di lievito a causa della manipolabilità superiore del genoma del lievito (vedi, per esempio, arbitri 1-4). Data la conservazione deglicomposizione subunità e funzionalità tra complessi di rimodellamento ortologhi, studi sulla struttura e la funzione dei lieviti complessi di rimodellamento hanno fornito importanti informazioni nelle loro controparti in eucarioti superiori. Tuttavia, esistono specie-specifici apprezzabili differenze tra i complessi di rimodellamento, derivante dalla plusvalenza o la perdita di specie-specifica subunità, il guadagno o la perdita di domini specie-specifici della subunità conservati, e la variabilità di sequenza all&#39;interno di domini conservati di subunità conservati. Tali differenze possono in linea di principio essere guidati dalla necessità di cellule eucariotiche superiori di adattarsi a nuovi ambienti molecolari e cellulari. Quindi, capire come subunità di maggiori complessi di rimodellamento eucarioti contribuiscono al processo di rimodellamento nucleosoma è prezioso, perché getta luce non solo sui meccanismi di base del processo di rimodellamento della cromatina ATP-dipendente, ma anche in grado di fornire preziose informazioni sui meccanismi attraverso cui la struttura della cromatina e l&#39;espressione genica in higsuoi eucarioti sono regolati. Finora, ci sono stati solo limitati studi strutturali e funzionali di multi-subunità mammiferi complessi di rimodellamento della cromatina, in parte a causa delle difficoltà nell&#39;ottenere biochimicamente definiti complessi di rimodellamento della cromatina e Sottocomplessi. Abbiamo parzialmente aggirato queste difficoltà con le procedure descritte qui di seguito, in cui la purificazione per immunoaffinità viene utilizzato per preparare intatti INO80 o INO80 Sottocomplessi da cellule umane che esprimono stabilmente N-terminale epitopo FLAG tag wild type o mutanti versioni di INO80 5-7 (Figura 1) . Per ottenere complessi INO80 intatte da cellule umane, ricombinazione Flp-mediata viene utilizzato per generare linee cellulari transgeniche HEK293 stabilmente esprimenti epitopi FLAG cDNA taggati codificano per le subunità del complesso INO80 8-10. Poiché sovra-espressione di subunità INO80 può essere alquanto tossico, è necessario isolare e mantenere linee cellulari clonali sotto co selettivalli operativi per garantire l&#39;espressione stabile del transgene durante i numerosi passaggi necessari per l&#39;espansione delle colture cellulari su larga scala. Per ottenere Sottocomplessi INO80 più piccoli che contengono solo un sottoinsieme di subunità, abbiamo utilizzato con successo due approcci (Figura 2A, B). Nel primo, generiamo linee cellulari HEK293 Flp-In esprimono stabilmente versioni mutanti di INO80 che mancano i domini necessari per l&#39;interazione con le subunità specifiche 5. In alternativa, knockdown siRNA-mediata è utilizzato per esaurire la subunità desiderato da cellule che esprimono un adeguato INO80 subunità FLAG-tag (dati non pubblicati). Infine, per purificare i complessi INO80 umani, FLAG cromatografia a base di agarosio 11 viene utilizzato per arricchire una frazione-INO80 contenente da estratti nucleari, riducendo efficacemente la presenza di contaminanti proteine ​​citosoliche nella frazione finale contenente depurati INO80 o INO80 Sottocomplessi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="890">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Name of Reagent/Material</td>
			<td style="width:212px;">Company</td>
			<td style="width:147px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:173px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:212px;">Cellgro</td>
			<td style="width:147px;">10-013-CV</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax-I (stablized glutamine)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">35050-079</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>SAFC</td>
			<td style="width:147px;">12176C</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FuGENE6 transfection reagent&#160;&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:147px;">E2312</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hygromycin B, sterile in PBS</td>
			<td>AG Scientific</td>
			<td style="width:147px;">H-1012-PBS</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pcDNA5/FRT vector</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">V6010-20</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Flp-In HEK293 cells&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">R780-07</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">pOG44 Flp-Recombinase Expression Vector</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">V600520</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZview&#160; Red ANTI-FLAG&#160; M2 Affinity Gel&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F2426</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">calf serum</td>
			<td>SAFC</td>
			<td style="width:147px;">12138C</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TARGETplus SMARTsiRNA pool</td>
			<td>Dharmacon / Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">various</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5x siRNA resuspension buffer&#160;</td>
			<td>Dharmacon / Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">#B-002000-UB-100</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine RNAiMAX&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">13778</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Opti-MEM Reduced Serum Medium&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">51985-091</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Cellgro</td>
			<td style="width:147px;">45000</td>
			<td style="width:173px;">VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">TrypLE (trypsin)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">12604</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x FLAG Peptide</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F3290</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Bio-Spin Chromatography Column</td>
			<td style="width:212px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:147px;">737-5021</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (50k MWCO)</td>
			<td style="width:212px;">Amicon</td>
			<td style="width:147px;">UFC805024&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeba Desalting Columns&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">89882</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Anti-FLAG M2 antibody, mouse</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F3165</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Anti-FLAG M2 antibody, rabbit</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F7425</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">P8340</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">benzonase&#160;</td>
			<td>Novagen</td>
			<td style="width:147px;">70664</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;"></td>
			<td style="width:212px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Equipment</td>
			<td style="width:212px;">Company</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wheaton Dounce Tissue Grinders</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td style="width:147px;">06-435C&#160;</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">JS-4.2 rotor in a J6 centrifuge&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">339080</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">JA-17 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">369691</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 ml polycarbonate tubes&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">355630</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70 ml polycarbonate bottles&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">355655</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Type 45 Ti rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">339160</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Type 70.1 Ti rotor&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">342184</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Clay Adams Nutator Mixer</td>
			<td style="width:212px;">BD Diagnostics</td>
			<td style="width:147px;">15172-203&#160;</td>
			<td style="width:173px;">VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glas-Col Tube/Vial Rotator</td>
			<td style="width:212px;">Glas-Col</td>
			<td style="width:147px;">099A RD4512</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR thermal cycler PTC 200</td>
			<td>MJ Research</td>
			<td style="width:147px;">PTC 200</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">roller bottle incubator</td>
			<td style="width:212px;">Bellco biotechnology</td>
			<td style="width:147px;">353348</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4</td>
			<td style="width:212px;">Millipore</td>
			<td style="width:147px;">IPFL07810</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">lubricated 1.5ml microcentrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Costar</td>
			<td style="width:147px;">3207</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and purification of human ino80 chromatin remodeling complexes and subcomplexes

INO80 complessi di rimodellamento della cromatina regolano le dinamiche nucleosoma e l&#39;accessibilità del DNA catalizzando ATP-dipendente rimodellamento nucleosoma. Complessi INO80 umani sono composti da 14 subunità proteiche tra cui INO80, un SNF2-come ATPasi, che serve sia come la subunità catalitica e il patibolo per l&#39;assemblaggio dei complessi. Funzioni delle altre subunità ei meccanismi attraverso i quali essi contribuiscono alla cromatina attività rimodellamento del complesso del INO80 rimangono poco conosciuti, in parte a causa della sfida di generare sottoinsiemi INO80 nelle cellule umane o sistemi di espressione eterologhi. Questo protocollo JOVE descrive una procedura che permette la purificazione di INO80 cromatina Sottocomplessi rimodellamento umani che mancano di una subunità o un sottoinsieme di subunità. N-terminale epitopo FLAG tagged INO80 cDNA vengono stabilmente introdotte nel rene embrionale umano (HEK) 293 linee cellulari con ricombinazione Flp-mediata. Nel caso in cui un sottoinsieme di subunità del complesso INO80 è abe cancellato, si esprime invece le proteine ​​mutanti INO80 che non hanno la piattaforma necessaria per il montaggio di queste subunità. Nel caso in cui un individuo subunità deve essere impoverito, uno transfects di targeting siRNA questa subunità in una linea cellulare HEK 293 che esprimono stabilmente FLAG taggati INO80 ATPasi. Estratti nucleari sono preparate, e FLAG immunoprecipitazione viene effettuata per arricchire frazioni proteiche contenenti derivati ​​INO80. Le composizioni di Sottocomplessi INO80 purificati possono poi essere analizzati utilizzando metodi quali immunoblotting, colorazione argento, e spettrometria di massa. I Sottocomplessi INO80 e INO80 generati in base a questo protocollo possono essere ulteriormente analizzati utilizzando vari saggi biochimici, che sono descritte nel protocollo JOVE accompagnamento. I metodi qui descritti possono essere adattati per lo studio delle proprietà strutturali e funzionali di ogni mammifero multi-subunità rimodellamento della cromatina e complessi modificano.

La figura 1 mostra un diagramma di flusso che riassume le procedure utilizzate per generare, purificarsi, e caratterizzare INO80 ATP-dipendenti complessi di rimodellamento della cromatina umani. Secondo quanto illustrato nelle figure 2 e 3, tali procedure consentono la generazione di entrambe le tipo INO80 e INO80 Sottocomplessi selvatici che mancano varie subunità, consentendo così successive analisi biochimiche del contributo di tali sub...

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes at JoVE.com

Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

Questo protocollo descrive una procedura per la generazione e purificare wild type e mutanti versioni del complesso rimodellamento della cromatina INO80 umana. Epitopi tagged versioni di subunità INO80 sono stabilmente espressi in cellule HEK293 e complessi completi e complessi privi di specifici gruppi di subunità sono purificati mediante cromatografia di immunoaffinità.

Generazione e Purificazione di umani INO80 rimodellamento della cromatina Complessi e Sottocomplessi

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 1

DNA and Chromosome Structure

SCIENTISTS IN ACTION

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

Purificazione e visualizzazione di influenza A Complessi Ribonucleoproteina virale

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

Ricerca

Biologia

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Isolamento del pancreas umano Islet: Parte II: La purificazione e la cultura di isole umane

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

La colorazione delle proteine ​​in gel con Coomassie G-250, senza solventi organici acido acetico e

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Generation of Human CD40-activated B cells

Generazione di Human CD40 delle cellule B attivate

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

Visualizzazione delle cellule interstiziali di Cajal (ICC) di rete in topi

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Isolamento di cromatina Purificazione RNA (disturbo)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

Generazione, purificazione e caratterizzazione di specie DISC1 Cell-invasive Protein

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

Generazione di immunoprecipitazione della cromatina Template DNA di alta qualità per high-throughput sequencing (ChIP-Seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Produzione efficiente e purificazione di ricombinante murino kindlina-3 da cellule di insetto per Biofisica Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

Saggi biochimici per le attività di analisi ATP-dipendente rimodellamento della cromatina Enzimi

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...