Name: an immunofluorescent method for characterization of barrett&#8217;s esophagus cells
Uploaded: 2014-07-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Immunofluorescent Method for Characterization of BarrettÃ¢â‚¬â„¢s Esophagus Cells at JoVE.com

Este trabalho foi financiado por doações do St, Fundação de Joseph (AJF, LJI) e American Lung Association, RG-224607-N (LJI).

1. Linha celular Manutenção <ol><li> Humana imortalizada BE displásicas de alto grau (CP-B, CP-C, CP-D) e metaplásico (CP-A) de linhas celulares por transfecção estável da telomerase humana transcriptase (TERT) de proteína 11 reversa. </li><li> Manter BE linhas de células de queratinócitos em meio suplementado com extracto de pituitária de bovino (BPE), factor de crescimento epidérmico (EGF), 5% de soro fetal bovino (FBS), aminoácidos não essenciais (NEAA), penicilina-estreptomicina-neomicina ...

<ol>
	<li>Reid, B. J., Li, X., Galipeau, P. C., Vaughan, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrett's+oesophagus+and+oesophageal+adenocarcinoma:+time+for+a+new+synthesis.">Barrett's oesophagus and oesophageal adenocarcinoma: time for a new synthesis.</a> Nat. Rev. Cancer. 10, 87-101 (2010).</li><li>Hayeck, T. J., Kong, C. Y., Spechler, S. J., Gazelle, G. S., Hur, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+Barrett's+esophagus+in+the+US:+estimates+from+a+simulation+model+confirmed+by+SEER+data.">The prevalence of Barrett's esophagus in the US: estimates from a simulation model confirmed by SEER data.</a> Dis. Esophagus. 23, 451-457 (2010).</li><li>Brown, L. M., Devesa, S. S., Chow, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+of+adenocarcinoma+of+the+esophagus+among+white+Americans+by+sex,+stage,+and+age.">Incidence of adenocarcinoma of the esophagus among white Americans by sex, stage, and age.</a> J. Natl. Cancer Inst. 100, 1184-1187 (2008).</li><li>Konturek, P. C., Burnat, G., Hahn, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Barret's+adenocarcinoma+cell+growth+by+simvastatin:+involvement+of+COX-2+and+apoptosis-related+proteins.">Inhibition of Barret's adenocarcinoma cell growth by simvastatin: involvement of COX-2 and apoptosis-related proteins.</a> J. Physiol. Pharmacol. 58 Suppl 3, 141-148 (2007).</li><li>Peng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+peroxidase+7+protects+against+oxidative+DNA+damage+in+oesophageal+cells.">Glutathione peroxidase 7 protects against oxidative DNA damage in oesophageal cells.</a> Gut. 61, 1250-1260 (2012).</li><li>Vona-Davis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAPK+and+PI3K+inhibition+reduces+proliferation+of+Barrett's+adenocarcinoma+in+vitro.">MAPK and PI3K inhibition reduces proliferation of Barrett's adenocarcinoma in vitro.</a> Surg. Res. 127, 53-58 (2005).</li><li>Inge, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+small+molecule+inhibitor+of+the+Src+kinase,+reduces+the+growth+and+activates+apoptosis+in+pre-neoplastic+Barrett's+esophagus+cell+lines:+evidence+for+a+noninvasive+treatment+of+high-grade+dysplasia.">a small molecule inhibitor of the Src kinase, reduces the growth and activates apoptosis in pre-neoplastic Barrett's esophagus cell lines: evidence for a noninvasive treatment of high-grade dysplasia.</a> Thoracic Cardiovasc. Surg. 145, 531-538 (2013).</li><li>Jovov, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+transport+and+barrier+function+in+a+telomerase-immortalized+human+nondysplastic,+Barrett's+cell+line+(BAR-T).">Ion transport and barrier function in a telomerase-immortalized human nondysplastic, Barrett's cell line (BAR-T).</a> Dis. Esophagus. 22, 386-395 (2009).</li><li>Merlo, L. M., Kosoff, R. E., Gardiner, K. L., Maley, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+co-culture+model+of+esophageal+cells+identifies+ascorbic+acid+as+a+modulator+of+cell+competition.">An in vitro co-culture model of esophageal cells identifies ascorbic acid as a modulator of cell competition.</a> BMC Cancer. 11, 461 (2011).</li><li>Zhang, H. Y., Hormi-Carver, K., Zhang, X., Spechler, S. J., Souza, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+benign+Barrett's+epithelial+cells,+acid+exposure+generates+reactive+oxygen+species+that+cause+DNA+double-strand+breaks.">In benign Barrett's epithelial cells, acid exposure generates reactive oxygen species that cause DNA double-strand breaks.</a> Cancer Res. 69, 9083-9089 (2009).</li><li>Palanca-Wessels, M. C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+lifespan+of+Barrett's+esophagus+epithelium+transduced+with+the+human+telomerase+catalytic+subunit:+a+useful+in+vitro+model.">Extended lifespan of Barrett's esophagus epithelium transduced with the human telomerase catalytic subunit: a useful in vitro model.</a> Carcinogenesis. 24, 1183-1190 (2003).</li><li>Kumble, S., Omary, M. B., Cartwright, C. A., Triadafilopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Src+activation+in+malignant+and+premalignant+epithelia+of+Barrett's+esophagus.">Src activation in malignant and premalignant epithelia of Barrett's esophagus.</a> Gastroenterology. 112, 348-356 (1997).</li><li>Inge, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-Catenin+overrides+Src-dependent+activation+of+beta-catenin+oncogenic+signaling.">alpha-Catenin overrides Src-dependent activation of beta-catenin oncogenic signaling.</a> Mol. Cancer Ther. 7, 1386-1397 (2008).</li><li>Coluccia, A. M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKI-606+Decreases+Growth+and+Motility+of+Colorectal+Cancer+Cells+by+Preventing+pp60(c-Src)-Dependent+Tyrosine+Phosphorylation+of+&#946;-Catenin+and+Its+Nuclear+Signaling.">SKI-606 Decreases Growth and Motility of Colorectal Cancer Cells by Preventing pp60(c-Src)-Dependent Tyrosine Phosphorylation of &#946;-Catenin and Its Nuclear Signaling.</a> Cancer Res. 66, 2279-2286 (2006).</li><li>Nam, J. -. S., Ino, Y., Sakamoto, M., Hirohashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Src+Family+Kinase+Inhibitor+PP2+Restores+the+E-Cadherin/Catenin+Cell+Adhesion+System+in+Human+Cancer+Cells+and+Reduces+Cancer+Metastasis.">Src Family Kinase Inhibitor PP2 Restores the E-Cadherin/Catenin Cell Adhesion System in Human Cancer Cells and Reduces Cancer Metastasis.</a> Clin. Cancer Res. 8, 2430-2436 (2002).</li><li>Chu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p27+phosphorylation+by+Src+regulates+inhibition+of+cyclin+E-Cdk2.">p27 phosphorylation by Src regulates inhibition of cyclin E-Cdk2.</a> Cell. 128, 281-294 (2007).</li><li>Inge, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+E-cadherin+promotes+cell+survival+by+activating+epidermal+growth+factor+receptor.">Soluble E-cadherin promotes cell survival by activating epidermal growth factor receptor.</a> Exp. Res. 317, 838-848 (2011).</li><li>Gan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+ERK+and+Akt+pathways+in+regulation+of+EGFR-mediated+signaling+and+motility+in+prostate+cancer+cells.">Differential roles of ERK and Akt pathways in regulation of EGFR-mediated signaling and motility in prostate cancer cells.</a> Oncogene. 29, 4947-4958 (2010).</li></ol>

Temos delineado um método para aplicação de IF de células ser no sentido de elucidar os efeitos fisiológicos de terapias específicas sobre estas células. Embora se tenha descrito o uso desses procedimentos contra células BE, verificou-se que estes métodos também são aplicáveis ​​a uma variedade de diferentes tipos de células 13,17,18. Além disso, esses procedimentos podem ser modificados de várias formas para optimizar a coloração para alvos específicos. Nós...

Esôfago de Barrett (EB) é uma mudança metaplásico no epitélio escamoso normal do esôfago e uma consequência da exposição crônica ao conteúdo gástricas resultantes da doença do refluxo gastroesofágico (DRGE) 1. BE é pensado para ser um mecanismo de proteção em resposta a RGE, no entanto, a presença de BE confere um risco aumentado de adenocarcinoma esofágico (EAC), uma doença que acarreta uma sobrevivência significativamente pobre 1. As estimativas atuais sugerem que até 5,6% da população americana tem BE, porém, como BE é muitas vezes assintomática, pensa-se que a maioria das BE permanece sem diagnóstico 2. Como as taxas de incidência de ambos DRGE e EAC têm visto um crescimento contínuo 3, tornou-se importante para compreender os mecanismos moleculares envolvidos na progressão do BE para EAC, particularmente porque essas informações poderiam fornecer abordagens terapêuticas no sentido de prevenir a progressão da BE à EAC. 1. A inflamação crônica, lesões e danos genotóxicos resultantes da exposição prolongada ao conteúdo gástrico exercer pressão seletiva sobre a lesão estar promovendo a progressão neoplásica a EAC. Uma série de alterações genéticas foram identificadas durante a BE à progressão EAC. No entanto, apesar disso, há uma clara falta de entendimento sobre as mudanças exatas na sinalização celular e os efeitos subsequentes sobre a estrutura e função celular. Imortalizado em linhas celulares in vitro são ferramentas úteis para o estudo dos efeitos de sinalização de células, particularmente em investigar os efeitos dos compostos terapêuticos alvo. A recente disponibilidade comercial de ser linhas de células imortalizadas permite tais estudos. Embora os ensaios de alto rendimento, como os ensaios de viabilidade amplamente utilizada, pode ser valioso para avaliar os efeitos das terapias-alvo sobre a proliferação celular e survival 4-6, estes ensaios não são úteis para interrogar os efeitos de sinalização de células sobre a morfologia celular. Coloração de imunofluorescência (IF) é uma técnica útil para investigar os efeitos de terapias específicas sobre as características morfológicas, de crescimento e sobrevivência das células e as proteínas que estão envolvidas. Nosso laboratório adaptou esses métodos para linhas de células imortalizadas BE, usando IF para avaliar os efeitos de uma droga clinicamente disponíveis mediante linhas de células BE na esperança de delinear um possível tratamento quimiopreventivo e biomarcador para tratamento de drogas 7. Da mesma forma, a aplicação destas técnicas na EAC, BE e linhas de células do esôfago imortalizados delineou conclusões críticas sobre BE à progressão EAC 8-10. Encontramos se a análise de células ser tratados com terapias direcionadas tem valor, permitindo a caracterização de mudanças na estrutura celular e localização de proteínas. Aqui, apresentamos os nossos métodos para IF de ser células imortalizadas para characterize tratamento medicamentoso.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="743">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:116px;">Company</td>
			<td style="width:108px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:224px;">Comments/ Description (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CP-A (Metaplastic Cell Line)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-4027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CP-B (High-grade Dysplastic Cell Line)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-4028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CP-C (High-grade Dysplastic Cell Line)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-4029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CP-D (High-grade Dysplastic Cell Line)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Keratinocyte-SFM (1X), Liquid</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17005-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.25% Trypsin-EDTA (1X), Phenol Red&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum, Qualified, HI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10438026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PSN ANTIBIOTIC MIXTURE</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS - Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pro-long Gold Antifade Reagent with DAPI&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Circular Glass Coverslip 18mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-183-86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;-catenin Primary Antibody (Rabbit)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9562S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alexafluor 488 (Goat Anti-Rabbit)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10cm TC treated PS dish, sterile</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7682-3394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12-well TC treated PS plate, sterile</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>5666-5180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine Serum Albumin - Fraction V</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85040C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SKI-606 (Bosutinib)</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Square Bioassay Dish&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>240835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Parafilm&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82024-546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Disposable Pasteur Pipets, Flint Glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nexcelom Mini Cell Counter</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cellometer Counting Chambers</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>CHT4-SD100-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zeiss Apotome microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an immunofluorescent method for characterization of barrett&#8217;s esophagus cells

Adenocarcinoma de esôfago (EAC) tem uma taxa de sobrevida global de menos de 17% ea incidência de EAC aumentou dramaticamente ao longo das últimas duas décadas. Um dos principais fatores de risco de EAC é o esôfago de Barrett (BE), uma mudança metaplásico do esôfago escamoso normal em resposta a azia crônica. Apesar da ligação bem estabelecida entre EAC e BE, o interrogatório dos eventos moleculares, particularmente vias de sinalização alterados envolvendo progressão da SER para EAC, são mal compreendidos. Grande parte isto é devido à falta de modelos in vitro adequados disponíveis para estudar estas doenças. Recentemente, as linhas de células imortalizadas BE tornaram-se disponíveis comercialmente permitindo estudos in vitro de BE. Aqui, apresentamos um método para coloração de imunofluorescência de linhas de células imortalizadas BE, permitindo caracterização in vitro de sinalização e estrutura da célula após a exposição a compostos terapêuticos. Aplicação destas técnicas irá help desenvolver insights sobre os mecanismos envolvidos na BE à progressão EAC e fornecer potenciais caminhos para o tratamento e prevenção da EAC.

Um exemplo dos resultados obtidos com a aplicação dos procedimentos descritos está ilustrada nas Figuras 1A-D. Lamelas com PC-D e FP-C BE células foram tratadas durante 24 horas com 1 uM do inibidor de Src família, SKI-606, ou veículo (DMSO) e coradas utilizando os procedimentos descritos acima para o Adherens junção de sinalização Wnt e proteína, β -catenina. Visualização de β-catenina foi conseguida por marcação com uma IgG anti-coelho acoplado a um fluoróforo verde, enquanto que a r...

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An Immunofluorescent Method for Characterization of BarrettÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Esophagus Cells

Há uma necessidade visível de uma melhor informação sobre os condutores moleculares de Esôfago de Barrett. Coloração de imunofluorescência é uma técnica útil para entender os efeitos da sinalização celular na morfologia celular. Nós apresentamos um protocolo simples e eficaz para o uso de coloração de imunofluorescência para avaliar tratamento terapêutico em células esôfago de Barrett.

O método de imunofluorescência para Caracterização de Células Esôfago de Barrett

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One ...

Research

JoVE Journal

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An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&#8217;s Esophagus Cells

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Biologia

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