Name: capsular serotyping of streptococcus pneumoniae by latex agglutination
Uploaded: 2014-09-25T00:00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination at JoVE.com

This work was part of the PneuCarriage project, funded by the Bill and Melinda Gates Foundation with contribution by the Victorian Government&#8217;s Operational Infrastructure Support Program.

1 Preparação de in-house Reagentes látex <ol><li> Preparação de solução salina tamponada com glicina (GBS) <ol><li> Adicionar 1,5 g de glicina, cloreto de sódio e 11,7 g de 100 ml de água destilada para uma proveta de vidro de 200 ml. </li><li> Misturar até dissolver-se utilizando um agitador magnético. </li><li> Transferir a mistura de 500 ml de medição de cilindro e adicionando água destilada, para perfazer um total de 200 ml. </li><li> Transferir a solução de volta para o copo de 200 ml, verificar o pH e ajustar para 8,2 com hidróxido de sódio 5 M. NOTA: O hidróxido de sódio é corrosivo, usar equipamento de protecção pessoal. </li><li> Filtrar esterilizar a solução com 0,22 mm e vários filtros de 60 ml seringas em um frasco de vidro com tampa de rosca ml preautoclaved 250. </li><li> Armazenar à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Preparação de GBS com 0,2% de albumina de soro bovino <ol><li> Adicionar 0,2 g de albumina de soro bovino (BSA) em pó e 100 ml de GBS para uma proveta de vidro de 200 ml e misturar até se dissolver utilizando um agitador magnético. </li><li> Filtraresterilizar a solução através de filtros de 0,22 mM utilizando várias seringas de 60 ml em um ml preautoclaved parafuso frasco de vidro tampado 250. </li><li> Armazenar a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparação de reagentes Latex <ol><li> Rotular a 2 ml redondas microtubo de fundo. NOTA: rodada tubos de fundo são usados ​​para minimizar partícula acerto o que pode afetar ligação de anticorpos. </li><li> Usando uma pipeta P1000 com pontas estéreis adicionar 975 ul de GBS no tubo de microcentrífuga, em seguida, adicionar 25 ul de anti-soro pneumocócica adequado ao reagente de látex a ser preparado (por exemplo, associação, grupo, o tipo ou o factor). Inverta cinco vezes para misturar. </li><li> Dilui-se partículas de látex de poliestireno 01:10 por adição de 120 ul de partículas de látex de 1,080 pi de solução salina fisiológica estéril. NOTA: Este pode ser feito em grandes volumes, mas deve ser feito fresco cada vez que os reagentes de látex são produzidas. </li><li> Adicionar 1000 mL da suspensão de látex 1:10 (preparado no passo 1.3.3) para o 1,000 ul de suspensão 1:40 de anti-soro (preparado no passo 1.3.2). Inverta cinco vezes para misturar. </li><li> Incubar a 37 ° C sobre uma roda de rotação lenta (por exemplo, 4 rpm para uma roda de 38,5 cm de diâmetro), durante 2 horas. </li><li> Centrifugar durante 15 minutos a 1100 x g. Descartar o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o sedimento em 2 ml de solução salina estéril. </li><li> Centrifugar durante 15 minutos a 1100 x g. Descartar o sobrenadante e adicionar 1 ml de GBS e delicadamente ressuspender o sedimento. </li><li> Pipetar a suspensão de látex em um rotulados 5 ml com tampa de rosca de tubo. Adicione mais 1 ml de GBS. </li><li> Adicionar 2 ml de GBS contendo 0,2% de BSA (w / v) (pH 8,2) (preparada no passo 1.2). Adicionar 40 ul de 10% (w / v) de solução de azida de sódio como conservante. NOTA: A azida sódica é perigoso se inalado, e é uma pele e dos olhos irritante. É desejável para adquirir uma solução preparada a 10% em vez do que a forma em pó, como o que minimiza o risco de exposição por inalação. Equipamento de proteção individual (incluindo luvas umóculos d respingo) deve ser usado quando manusear este reagente. Consulte a Ficha de Segurança para obter detalhes. </li><li> Reagentes de látex armazenar a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparação do reagente de látex controlo negativo <ol><li> Rotular a 2 ml redondas microtubo de fundo. NOTA: rodada tubos de fundo são usados ​​para minimizar partícula acerto o que pode afetar ligação de anticorpos. </li><li> Usando uma pipeta P1000 com pontas estéreis adicionar 975 ul de GBS no tubo de microcentrífuga, em seguida, adicionar 25 ul de anti-soro de coelho normal. Inverta cinco vezes para misturar. </li><li> Proceda como nos passos 1.3.3 a 1.3.10 acima </li></ol></li></ol> 2 Controle de Qualidade (CQ) de látex Reagentes <ol><li> Traga reagente de látex para TR. Imediatamente antes da utilização, mistura suavemente o reagente de látex, invertendo o tubo várias vezes. </li><li> Verifique reagente para autoaglutinação pipetando 15 mL em uma lâmina de vidro e proceda como nos passos 4.7 e 4.8 abaixo. Não deve haver umgglutination das partículas de látex. O reagente deve aparecer branca e lisa. </li><li> Teste o reagente contra um painel de baixa passagem isolados de pneumococo. Use culturas recém-cultivadas preparados como no passo 3 O painel de isolados deve incluir isolados do sorotipo &#39;target&#39; (o sorotipo específico para o reagente a ser testada) e sorotipos &quot;não-alvo&quot; (isolados de outros sorotipos que não deve normalmente cruzam reagem com o reagente). Inclua pelo menos um isolado de cada alvo e não-alvo para cada sorotipo reagente látex passando por QC. Se houver apenas um alvo ou sorotipo não-alvo, teste de duas amostras diferentes do sorotipo particular. NOTA: O painel de teste deve incluir vários isolados de cada sorotipo, alguns dos quais são comuns na doença invasiva e / ou coleções de culturas de tipo. É preferível incluir uma carruagem isolados, uma vez que são muitas vezes mais exigente para o serótipo (dados não mostrados), assim, ainda mais a testar o Capacidadef os reagentes e garantir que os reagentes são provavelmente capazes de sorotipagem tanto invasivo e transporte isola. </li><li> Proceder com testes de reagentes de látex com alvo e pneumocócica não-alvo isolados de acordo com o método descrito nas etapas 3 e 4 abaixo. </li><li> Reagentes de controle de qualidade no momento da produção e, em seguida, pelo menos, anualmente. NOTA: Se um reagente não passa QC, o lote deve ser descartada e uma nova preparação feita. Em caso de falha de repetição QC recomendamos os reagentes ser produzidos utilizando os métodos alternativos descritos no Ortika et al. De 2013 8 e na discussão que se segue. </li></ol> 3 Preparação das Culturas pneumocócicas para sorotipagem <ol><li> Usando uma agulha esterilizada selecionar uma única colônia da pneumocócica e isolar este raia-se para um meio de ágar de sangue não selectivo sólida de modo que o inoculo primário cobre aproximadamente um terço da superfície da chapa. Streak para colónias isoladas. NOTA: As lâminas preparadas a partir de cavalo desfibrinado ou sangue de carneiro são adequados; mas as placas de sangue preparadas com sangue ou sangue de animais com citrato não são. </li><li> Incubar a placa S / N a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2. </li><li> Observar o crescimento na placa para avaliar a pureza e que há um crescimento suficiente para serotipagem. Observação: Uma cultura pura do isolado de pneumococos é necessário para serotipagem. Na nossa experiência, confluentes, ou perto de crescimento confluente abrangendo aproximadamente um terço da superfície da placa é geralmente suficiente para completar a serotipagem. Como as culturas pneumocócicas podem ser propenso a autólise, culturas preparadas para sorotipagem deve ser testada dentro de 24 horas de subcultura. Não tome a placa de cultura de fora da incubadora mais do que 15 a 20 minutos antes da sorotipagem começa. </li></ol> 4 Realização de sorotipagem de aglutinação em látex <ol><li> Remova todos os reagentes de látex de geladeira e deixe-os a aquecer a temperatura ambiente por aproximadamentemadamente 30 min. Imediatamente antes da utilização, inverter cuidadosamente os tubos para misturar os reagentes. </li><li> Rotular uma lâmina de microscópio. </li><li> Coloque 15 mL de reagente de látex controle negativo sobre a lâmina de microscópio. </li><li> Usando um circuito descartável 1 ml estéril tomar uma varredura da cultura pneumocócica para que o ciclo é de aproximadamente meio cheio. </li><li> Suavemente manchar o inoculo sobre a superfície da lâmina próximo da gota de reagente de látex de controlo negativo. O inóculo deve ser visível sobre a lâmina de vidro. </li><li> Depressa e bem misturar o inóculo para o reagente de látex de controle negativo usando o loop. Certifique-se de que a queda não se espalhou mais longe do que seu tamanho inicial. </li><li> Pegue o slide, segurando-o em ambas as extremidades. Balance a deslizar para trás e para frente para 1 min. Ter o cuidado de manter o líquido em movimento, lentamente, e assegurar que o tamanho da gota não aumenta. NOTA: Como alternativa, use uma placa oscilante. </li><li> Observe a aglutinação macroscópica (ou seja, porolho nu) e compensação da suspensão contra um fundo preto. </li><li> Se o reagente de látex de controlo negativo não mostra nenhuma aglutinação ou de compensação continua testando a cultura, substituindo os reagentes de teste de látex para o reagente de látex de controlo negativo em passos 4,1-4,8 acima. Um laço fresco deve ser usado de cada vez. Prossiga com o teste dos reagentes de látex começando com as piscinas. </li><li> Teste cada um dos reagentes de látex &#39;pool&#39; em sucessão, até que um teste positivo é obtido. NOTA:. A ordem dos testes das piscinas podem ser feitas em &#39;rounds&#39; para refletir a incidência local dos sorotipos específicos (por exemplo, por meio de testes para as três piscinas mais prováveis ​​sobre o primeiro slide Se uma reação positiva não é obtido, em seguida, teste a próxima mais provável três das piscinas restantes na segunda corrediça, e assim por diante até que uma reacção positiva é obtido). Isto assegura que os serotipos mais comuns são testados em primeiro lugar, minimizando o tempo e os reagentes necessários. </li><li>Usando a chave do fabricante do anti-soro anti-soros individuais determinar quais são representados no conjunto positivo. </li><li> Teste cada um dos grupos ou tipos contidos na piscina positiva individualmente para determinar o &#39;grupo&#39; ou &#39;tipo&#39; como nos passos 4,1-4,8 acima. </li><li> Determinar o resultado por referência a chave do fabricante do anti-soro. Se um &#39;tipo&#39; é determinado (por exemplo, o sorotipo 5), então não há mais testes são necessários e este resultado é gravado. </li><li> Se um &#39;grupo&#39; é determinado (por exemplo, grupo 19), em seguida, referem-se à chave fabricantes para determinar os fatores a serem testados. Continuar os testes com os reagentes de látex &quot;fator&quot; individuais e determinar o sorotipo final (por exemplo, 19B sorotipo). </li></ol>

<ol>
	<li>Rudan, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+etiology+of+childhood+pneumonia+in+2010:+estimates+of+incidence,+severe+morbidity,+mortality,+underlying+risk+factors+and+causative+pathogens+for+192+countries.">Epidemiology and etiology of childhood pneumonia in 2010: estimates of incidence, severe morbidity, mortality, underlying risk factors and causative pathogens for 192 countries.</a> J Glob Health. 3 (10401), (2013).</li><li>O'Brien, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+disease+caused+by+Streptococcus+pneumoniae+in+children+younger+than+5+years:+global+estimates.">Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates.</a> Lancet. 374, 893-902 (2009).</li><li>Henrichsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six+newly+recognized+types+of+Streptococcus+pneumoniae.">Six newly recognized types of Streptococcus pneumoniae.</a> J Clin Microbiol. 33, 2759-2762 (1995).</li><li>Hausdorff, W. P., Bryant, J., Paradiso, P. R., Siber, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Which+pneumococcal+serogroups+cause+the+most+invasive+disease:+implications+for+conjugate+vaccine+formulation+and+use,+part+I.">Which pneumococcal serogroups cause the most invasive disease: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I.</a> Clin Infect Dis. 30, 100-121 (2000).</li><li>Mulholland, K., Satzke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+replacement+after+pneumococcal+vaccination.">Serotype replacement after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 379, 1388-1389 (2012).</li><li>Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+replacement+in+disease+after+pneumococcal+vaccination.">Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 378, 1962-1973 (2011).</li><li>Satzke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+method+for+detecting+upper+respiratory+carriage+of+Streptococcus+pneumoniae:+Updated+recommendations+from+the+World+Health+Organization+Pneumococcal+Carriage+Working+Group.">Standard method for detecting upper respiratory carriage of Streptococcus pneumoniae: Updated recommendations from the World Health Organization Pneumococcal Carriage Working Group.</a> Vaccine. , (2013).</li><li>Ortika, B. D., Habib, M., Dunne, E. M., Porter, B. D., Satzke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+latex+agglutination+reagents+for+pneumococcal+serotyping.">Production of latex agglutination reagents for pneumococcal serotyping.</a> BMC Res Notes. 6 (49), (2013).</li><li>Adegbola, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+and+antimicrobial+susceptibility+patterns+of+isolates+of+Streptococcus+pneumoniae+causing+invasive+disease+in+The+Gambia+1996-2003.">Serotype and antimicrobial susceptibility patterns of isolates of Streptococcus pneumoniae causing invasive disease in The Gambia 1996-2003.</a> Trop Med Int Health. 11, 1128-1135 (2006).</li><li>Slotved, H. C., Kaltoft, M., Skovsted, I. C., Kerrn, M. B., Espersen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple,+rapid+latex+agglutination+test+for+serotyping+of+pneumococci+(Pneumotest-Latex).">Simple, rapid latex agglutination test for serotyping of pneumococci (Pneumotest-Latex).</a> J Clin Microbiol. 42, 2518-2522 (2004).</li><li>Turner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+detection+of+nasopharyngeal+cocolonization+by+multiple+pneumococcal+serotypes+by+use+of+latex+agglutination+or+molecular+serotyping+by+microarray.">Improved detection of nasopharyngeal cocolonization by multiple pneumococcal serotypes by use of latex agglutination or molecular serotyping by microarray.</a> J Clin Microbiol. 49, 1784-1789 (2011).</li><li>Mudany, M. A., Kikuchi, K., Totsuka, K., Uchiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+new+serotyping+kit+for+Streptococcus+pneumoniae.">Evaluation of a new serotyping kit for Streptococcus pneumoniae.</a> J Med Microbiol. 52, 975-980 (2003).</li><li>Lalitha, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotyping+of+Streptococcus+pneumoniae+by+agglutination+assays:+a+cost-effective+technique+for+developing+countries.">Serotyping of Streptococcus pneumoniae by agglutination assays: a cost-effective technique for developing countries.</a> Bull World Health Organ. 74, 387-390 (1996).</li><li>Shutt, C. K., Samore, M., Carroll, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+Denka+Seiken+slide+agglutination+method+to+the+quellung+test+for+serogrouping+of+Streptococcus+pneumoniae+isolates.">Comparison of the Denka Seiken slide agglutination method to the quellung test for serogrouping of Streptococcus pneumoniae isolates.</a> J Clin Microbiol. 42, 1274-1276 (2004).</li><li>Gella, F., Serra, J., Gener, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latex+agglutination+procedures+in+immunodiagnosis.">Latex agglutination procedures in immunodiagnosis.</a> Pure Appl Chem. 63, 1131-1134 (1991).</li><li>Habib, M., Porter, B. D., Satzke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsular+serotyping+of+Streptococcus+pneumoniae+using+the+Quellung+reaction.">Capsular serotyping of Streptococcus pneumoniae using the Quellung reaction.</a> J. Vis. Exp. (84), (2014).</li><li>Arai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+antiserum-coated+latex+particles+for+serotyping+Streptococcus+pneumoniae.">Use of antiserum-coated latex particles for serotyping Streptococcus pneumoniae.</a> Microbiol Immunol. 45, 159-162 (2001).</li><li>Lafong, A. C., Crothers, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+latex+agglutination+method+for+typing+pneumococci.">Simple latex agglutination method for typing pneumococci.</a> J Clin Pathol. 41, 230-231 (1988).</li><li>Ortega-Vinuesa, J. L., Bastos-Gonzalez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+factors+affecting+the+performances+of+latex+agglutination+tests.">A review of factors affecting the performances of latex agglutination tests.</a> J Biomater Sci Polym Ed. 12, 379-408 (2001).</li><li>Yap, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+slide+latex+agglutination+test+for+rotavirus+antigen+detection.">Development of a slide latex agglutination test for rotavirus antigen detection.</a> Malays J Pathol. 16, 49-56 (1994).</li><li>Severin, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latex+agglutination+in+the+diagnosis+of+meningococcal+meningitis.">Latex agglutination in the diagnosis of meningococcal meningitis.</a> J Clin Pathol. 25, 1079-1082 (1972).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Aglutinação em látex é um método simples, rápido e barato para sorotipagem pneumocócica. Comerciais pneumocócicas reagentes de aglutinação de látex estão disponíveis, mas que atualmente não fazem distinção todos os sorotipos de pneumococos conhecida 10,12. No entanto, reagentes de aglutinação de látex pode ser facilmente produzido em casa usando anti-soros comprado levantada contra antígenos capsulares de pneumococos específicos. No método aqui descrito, os anticorpos são passivamente ligado a partículas de látex para fazer um conjunto de reagentes de aglutinação de látex. Uma reacção positiva ocorre quando o látex anticorpos específicos ligados às partículas de látex atribuem aos antigénios sobre a cápsula polissacarídica do pneumococo isolar 18,19. As partículas de látex ligados aos anticorpos permite a reacção anticorpo-antigénio específico a ser visualizado sem ampliação. Aglutinação em látex é um método adequado para um elevado rendimento laboratóriosd também para locais com poucos recursos. As principais vantagens do método são de aglutinação em látex que não é necessário equipamento especializado para executar o teste, os reagentes têm um prazo de validade de pelo menos 2 anos, quando armazenados a 4 ° C, 8, e que é de baixo custo, simples e rápida de realizar. Serotipagem um isolado de pneumococos por aglutinação em látex leva aproximadamente 10 minutos, e até quatro reagentes de látex podem ser testadas em paralelo a uma lâmina. Além disso, se a prevalência de serotipos é conhecida para a configuração epidemiológica relevante, os testes podem ser realizados em rodadas começando com as piscinas que contêm os serotipos mais comuns de modo semelhante ao teste de Quellung 17. Esta abordagem minimiza o número de testes necessários para determinar o serotipo. O método também é altamente reprodutível entre diferentes operadores (dados não mostrados). Uma desvantagem de aglutinação em látex serotipagem é que a produção dos reagentes é demorado, tendo cerca de quatro horas; embora REAGE múltiplaes podem ser facilmente produzidos em paralelo. Além disso, alguns antígenos são comuns a diferentes sorotipos de pneumococo, resultando em reações cruzadas com alguns anti-soros (por exemplo, o sorotipo 29, 42 e Grupo 35). No entanto, estas reacções cruzadas estão bem caracterizados pelo uso comercial anti-soros (o que é normalmente pré-absorvido para remover os anticorpos de reacção cruzada mais problemáticos) e tabelas de reacção adicionais são fornecidos pelo fabricante, a fim de distinguir o que se encontra presente serótipo. Reagentes de látex pode também reagiram de forma cruzada se os anticorpos não estão alinhados adequadamente sobre as partículas de látex; estes são detectados como falhas QC. Na nossa experiência, rigoroso QC é central para o sucesso deste método, mesmo quando os anti-soros disponíveis comercialmente são usados ​​para a produção. QC demora aproximadamente 15 min por reagente e depende de um conjunto de QC apropriada isolados como descrito acima. O método aqui descrito resulta em reagentes que dão uma reacção positiva bem widiluir o período de teste. Na nossa experiência, os falsos positivos são raros, na prática, (dados não mostrados). Falsos negativos ocasionais são observadas; geralmente estes se relacionam com problemas conhecidos com um anti-soro específico (por exemplo, o sorogrupo 6 isolados não pode reagir com piscina B anti-soro), ou baixa regulação da expressão cápsula pelo isolado. Usando o algrorithm sorotipagem fornecido pelo fabricante também é importante, como na maioria dos casos, uma reação positiva ou negativa falsa levará a um resultado &quot;final cego &#39;. Nestes casos, e quando as reações são de difícil interpretação, recomendamos repetir-testes e / ou testes por um método alternativo, como a reação Quellung. Alguns solução de problemas é por vezes necessária para fazer reagentes de látex satisfatórios. No método aqui descrito, o anticorpo é ligado a partículas de látex, através de adsorção passiva 15,19, então uma variável crítica é a concentração de anticorpo utilizado, o que determina quão bema superfície das partículas de látex é coberto e o subsequente alinhamento dos locais activos de anticorpos 15,20. Por conseguinte, se o anticorpo em excesso insuficiente ou está ligado às partículas de látex, as reacções antígeno-anticorpo não será óptimo, e reagentes insatisfatórias podem ser produzidos 15,20,21. Como os títulos de anticorpos variar entre diferentes lotes de soros, um conjunto padrão de diluições pode não produzir os reagentes que um bom desempenho 8. Um ponto de partida útil é a utilização de uma diluição 1:40 do anti-soro, se este não é bem sucedida, diluir ainda mais o anti-soro. Em nossa experiência, isso geralmente resolve o problema 8. Em um pequeno número de casos reagentes podem apresentar aglutinação fraca que não é acompanhada de compensação da suspensão, quando testado com alvo isolados. Nestes casos, a diluição de anti-soro não melhora a qualidade do reagente, mas reagentes satisfatórios podem ser geralmente produzidos por omitindo a centrifugação e passos de lavagem 8,22 </sup&gt;. Revestidas de anticorpo partículas de látex são usados ​​comumente em microbiologia de diagnóstico para a detecção, identificação ou sorotipagem de muitos micróbios diferentes 15,20. Como tal, o método aqui descrito pode ser adequado para a preparação de reagentes de látex para outras finalidades, desde que os anti-soros adequados estão disponíveis e são adequados CQ adoptada.

Streptococcus pneumoniae (pneumococo) é uma das principais causas de morbidade e mortalidade em crianças menores de cinco anos de idade, particularmente em locais com poucos recursos de 1,2 em todo o mundo. Gamas de doença pneumocócica de infecções localizadas a condições de risco de vida, tais como pneumonia, sepse e meningite 1,2. Mais de 90 sorotipos de pneumococos foram identificados com base em diferenças na sua polissacarídeo capsular 3. As vacinas atuais direcionar o polissacarídeo capsular e fornecer proteção contra os principais sorotipos causadores de doença invasiva 4. Sorotipagem pneumocócica isolamentos é importante para avaliar o impacto da vacinação sobre a carruagem e doença, bem como proporcionar informações epidemiológicas mais amplo 5,6. O actual método &quot;padrão ouro&quot; para sorotipagem pneumocócica é o teste Quellung, mas é demorado e requer alguma habilidade para perform 7. Aglutinação em látex é um método de sorotipagem alternativa recomendada pela Organização Mundial da Saúde 7. Aglutinação em látex é rápido e simples de realizar, e é empregada em muitos laboratórios em todo o mundo 8-11. Importante, aglutinação em látex mostrou precisão comparável ao teste Quellung para sorotipagem pneumocócica 10,12-14. No geral, este método é ideal para locais com poucos recursos, bem como laboratórios de alto rendimento. Os reagentes de aglutinação de látex (&#39;reagentes de látex&#39;) são criados por meio da ligação de anticorpos a partículas de látex 15. Numa reacção positiva, estas partículas marcadas aglutinar na presença do antigénio específico. Reagentes de látex comerciais estão disponíveis para uma gama restrita de sorotipos. Reagentes de látex também pode ser preparada em casa usando anti-soros comercialmente disponível 10. Misturas de anti-soro (&quot;pools&quot;), bem como os anti-soros específicos para s pneumocócicaserogroups (por exemplo, grupo 19), os serotipos individuais (por exemplo, o serotipo 5), e a antigénios específicos (&quot;factores&quot;, por exemplo., factor de 19c reconhecimento do serotipo 19A) para a definição mais serotipos dentro grupos estão disponíveis 16. Este manuscrito descreve os principais passos na produção de reagentes de látex utilizando ligação passiva de anti-soros disponíveis comercialmente a partículas de látex. O controlo de qualidade (QC) os aspectos deste método encontram-se descritos, e um protocolo para o uso de reagentes de látex para serotipagem pneumocócica está incluído.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1085">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:180px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:263px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:299px;">Microparticles based on polystyrene, 800 nm</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:127px;">65984-10 ml-F</td>
			<td style="width:263px;">Or other volumes as required</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:299px;">Normal rabbit serum</td>
			<td style="width:180px;">Antibodies Australia&#160;</td>
			<td style="width:127px;">NRS-1ml</td>
			<td style="width:263px;">Or other volumes as required, bring to room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:299px;">Pneumococcus (Neufeld) antisera</td>
			<td style="width:180px;">SSI Diagnostica</td>
			<td style="width:127px;">Various</td>
			<td style="width:263px;">Bring to room temperature before use 
			<a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:299px;">Sterile Bovine Albumin&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:127px;">A-4503</td>
			<td style="width:263px;">Bring to room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:299px;">Sodium azide 10% (v/v) solution&#160;</td>
			<td style="width:180px;">VWR International</td>
			<td style="width:127px;">ROAC3902/100ml</td>
			<td style="width:263px;">Caution: hazardous if inhaled; skin and eye irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml</td>
			<td style="width:180px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:127px;">0030 120.094</td>
			<td style="width:263px;">Round bottom</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:180px;">Merck</td>
			<td style="width:127px;">10241.AP</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:299px;">Calibrated disposable inoculating loops 1 &#181;l</td>
			<td style="width:180px;">Copan</td>
			<td style="width:127px;">CD175SO1</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:299px;">Glass microscope slides 76 mm x 26 mm</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">LBS 2950RC</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:299px;">5 M NaOH</td>
			<td style="width:180px;">BDH</td>
			<td style="width:127px;">10252</td>
			<td style="width:263px;">Caution: highly corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Glycine</td>
			<td style="width:180px;">Merck</td>
			<td style="width:127px;">10119.05</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Horse Blood Agar (HBA) plates</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">PP2001</td>
			<td>Bring to room temperature before use 
			<a href="http://www.thermofisher.com.au/">http://www.thermofisher.com.au</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Rotating wheel</td>
			<td style="width:180px;">Wyble Engineering Development Corporation</td>
			<td style="width:127px;">Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:299px;">Polystyrene flat bottom screw cap tube, 5 ml</td>
			<td style="width:180px;">Technoplas</td>
			<td style="width:127px;">S5016SU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">60 ml syringes without needles</td>
			<td style="width:180px;">Terumo</td>
			<td style="width:127px;">SS-60L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Millex-GP syringe filter unit, 0.22 &#181;m</td>
			<td style="width:180px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:127px;">SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Brochure on Neufeld antisera</td>
			<td style="width:180px;">Statens Serum Institut</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td>Key to determining serotypes 
			<a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Key to pneumococcal factor serum</td>
			<td style="width:180px;">Statens Serum Institut</td>
			<td align="right" style="width:127px;">18058</td>
			<td style="width:263px;">For determining serotype within Groups 
			<a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">*alternative sources are available for most materials</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capsular serotyping of streptococcus pneumoniae by latex agglutination

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the &#8216;gold standard&#8217; Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective. 
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.

Uma reacção positiva ocorre quando o látex de anticorpo específico de tipo ligado à partícula de látex liga-se a cápsula do pneumococo, e a aglutinação das partículas anticorpo marcado resulta 15. Figura 1A mostra uma reacção positiva, que é caracterizada por aglutinação e de limpeza de fundo suspensão. Uma reacção negativa é caracterizado por a suspensão reagente de aglutinação em látex remanescente suave e branco (Figura 1B). Os reagentes são optimizados de modo a que uma reacção positiva deve ser observada antes do fim do intervalo de tempo de um minuto (geralmente detectáveis ​​em cerca de 20 seg). Nós não recomendamos a leitura reações após o intervalo de tempo de 1 min. Muito ocasionalmente, exibir reacções de aglutinação fracas em torno da borda da gota que não é acompanhada por compensação da suspensão de fundo, ou aparecem &quot;fibroso&quot;, sem compensação de fundo (dados não mostrados). Estes são mais como<html> reações negativas ly. Em tais casos, é recomendável um novo ensaio e / ou investigação adicional utilizando outro método serotipagem (por exemplo, a reacção de Quellung 17). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51747/51747fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. reações de aglutinação de látex positivos e negativos. Preparações dos pneumocócica isolar misturado com o reagente de aglutinação em látex, mostrando uma reação positiva (A) ou uma reação negativa (B). Aglutinação acompanhada por compensação do fundo é visto na reacção positiva (A) .há nenhuma aglutinação de látex com o reagente de controlo negativo ou de uma reacção de teste negativo (B). Fotografias 8 usada com permissão.&quot;Target =&quot; _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Watch this Scientific Journal Video about Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination at JoVE.com

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Teste de aglutinação em látex é um método simples, rápido e barato para sorotipagem Streptococcus pneumoniae, e também tem sido amplamente aplicada em microbiologia de diagnóstico. Este manuscrito descreve a produção in-house de reagentes de aglutinação de látex, procedimentos de controle de qualidade e da aplicação desta técnica de sorotipagem pneumocócica.

Capsular sorotipagem de<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Por aglutinação em látex

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Usando imagens Bioluminescent para Investigar sinergismo entre Streptococcus pneumoniae E Vírus da Influenza A em Ratos infantil

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Imunologia e Infecção

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Invasão das células humanas por um agente patogénico

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

Método de aglutinação de partículas de Identificação Poliovirus

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Imagens de células vivas de Bacillus subtilis E Streptococcus pneumoniae Usando Microscopia lapso de tempo Automated

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Caracterização de Respostas Inflamatórias Durante Colonização Intranasal com Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Acompanhamento da evolução das Membrane Polaridade, integridade de membrana e intracelulares Ion concentrações no<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Usando corantes fluorescentes

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

A sorotipagem capsular de<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Usando o Reaction Quellung

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

Proteômica Profiling de macrófagos por eletroforese 2D

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Imagem não invasivo do imunitário inatas Response em um modelo de peixe-zebra larval de<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Um modelo murino de Grupo B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Colonização Vaginal

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...