Name: flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology
Uploaded: 2014-06-25T15:00:00
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The authors thank Dr. Amir Rattner for helpful comments on the manuscript. Supported by the Howard Hughes Medical Institute.

Cette étude a été réalisée en stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Tous les animaux ont été traités selon approuvé protection des animaux et l&#39;utilisation comité (IACUC) protocole MO11M29 des Johns Hopkins Medical Institutions. Consultez vos directives locales du Comité de protection et d&#39;utilisation des animaux institutionnels pour les méthodes d&#39;euthanasie approuvées. Porter des gan...

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	<li>Burns, T., Breathnach, S., Cox, N., Griffiths, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Rook's Textbook of Dermatology. 8th ed. , (2010).</li><li>Lee, J., Tumbar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hairy+tale+of+signaling+in+hair+follicle+development+and+cycling.">Hairy tale of signaling in hair follicle development and cycling.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 23, 906-916 (2012).</li><li>Masland, R. 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Cell Biol. 10, 1257-1268 (2008).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+organization+of+cutaneous+low-threshold+mechanosensory+neurons.">The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons.</a> Cell. 147, 1615-1627 (2011).</li><li>Meyers, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lighting+up+the+senses:+FM1-43+loading+of+sensory+cells+through+nonselective+ion+channels.">Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels.</a> J. Neurosci. 23, 4054-4065 (2003).</li><li>Fujiwara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basement+membrane+of+hair+follicle+stem+cells+is+a+muscle+cell+niche.">The basement membrane of hair follicle stem cells is a muscle cell niche.</a> Cell. 144, 577-589 (2011).</li><li>Orsini, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technique+of+preparation,+study+and+photography+of+benzyl-benzoate+cleared+material+for+embryological+studies.">Technique of preparation, study and photography of benzyl-benzoate cleared material for embryological studies.</a> J. Reprod. Fertil. 3, 283-287 (1962).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat. Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li><li>Kuwajima, T., Sitko, A. 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Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li><li>Aal Ert&#252;rk, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+for+mapping+the+nervous+system.">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nat. Methods. 10, 508-513 (2013).</li></ol>

Maîtrise des méthodes de dissection décrites ci-dessus ne nécessite patience, d&#39;une main ferme, et quelques bons outils de dissection. La dissection de la peau dorsale est relativement facile, mais la queue et la peau de pied dissections - en particulier aux âges postnatales - sont plus difficiles. Au début des âges prénatal (par exemple, avant E15), la peau est difficile à enlever sans le déchirer. Idéalement, pour de nombreuses études sur la croissance et la structuration des structures de la ...

La peau est l&#39;un des organes les plus importants dans le corps, avec des fonctions importantes dans somato-sensation, isolation / thermorégulation, et la défense immunitaire 1. Comprendre les bases moléculaires et cellulaires du développement et de la fonction peau a été de longue date un intérêt en raison de l&#39;importance fondamentale de la peau comme un système biologique et sa pertinence pour la dermatologie. La peau des mammifères contient une variété de structures multicellulaires, y compris les couches stratifiées de kératinocytes, du tissu conjonctif dermique, plusieurs types de follicules pileux, les glandes sébacées, les muscles arrector de pili, les vaisseaux sanguins, et au moins une douzaine de classes distinctes de afférente (sensorielles) et efférentes nerf des fibres (figure 1). Les différentes régions du corps sont associées à des caractéristiquement différents types de peau. Dans la plupart des mammifères, près de la surface du corps est recouvert d&#39;une peau qui est très dense avec les follicules pileux. [Les humains et les rats-taupes nus constituent des exceptions à THest modèle.] cheveux est absent de la face palmaire des mains et des pieds, qui sont également associés avec des motifs spécialisées de l&#39;épiderme (les dermatoglyphes), les glandes exocrines, et les terminaisons nerveuses sensorielles. Les événements cellulaires et moléculaires qui contrôlent la croissance, la différenciation et la disposition spatiale des cellules dans le follicule pileux sont d&#39;un intérêt particulier que chaque follicule expositions, en miniature, un grand nombre des caractéristiques centrales de l&#39;organogenèse 2. Ces caractéristiques comprennent l&#39;existence de cellules souches et une niche de cellules souches, les migrations cellulaires précisément chorégraphiés, et l&#39;ensemble des structures multicellulaires de composants embryologiquement distinctes. Cet article décrit les méthodes de dissection, la fixation, l&#39;étiquetage et la peau imagerie de la souris comme une feuille bidimensionnelle intact, dénommé un «tout support» ou «plat monter&quot; préparation. Comme la peau de la souris est relativement mince, il est possible d&#39;image à travers toute l&#39;épaisseur de ski aplatin en utilisant la microscopie confocale classiques. L&#39;approche plat de montage à l&#39;imagerie peau de mammifère est techniquement avantageuse car elle contourne la nécessité de sectionnement physique, permettant ainsi des structures à reconstruire entièrement par sectionnement optique. Etant donné que la presque totalité de la peau est traité comme un seul objet, la monture plate approche facilite également la formation d&#39;image de plusieurs régions de la surface du corps tout en conservant des informations sur la position et l&#39;orientation par rapport aux axes du corps. Enfin, les structures à l&#39;intérieur de la peau sont généralement présents dans des motifs qui se répètent à intervalles réguliers, ce qui facilite le recueil d&#39;images à partir de plusieurs représentants d&#39;une structure donnée. Ces caractéristiques sont familiers aux neurobiologistes qui travaillent sur ​​la rétine, une partie en deux dimensions du système nerveux central qui bénéficie des avantages analogues pour les études de morphologie neuronale 3. L&#39;approche plat monter décrit ici est de utilit spécialey pour l&#39;étude des structures qui présentent une organisation spatiale sur une échelle relativement grande dans le plan en deux dimensions de la peau. Un exemple d&#39;organisation à grande échelle spatiale est la polarité coordonnée des follicules pileux et des structures du follicule associée cheveux - amas de cellules de Merkel, arrecteur muscles de pili, les glandes sébacées, et les terminaisons nerveuses 4. Les follicules pileux sont orientées selon un angle par rapport au plan de la peau, et la composante du vecteur du follicule qui se trouve dans le plan 2-dimensionnel de la peau présente généralement une orientation par rapport aux axes du corps qui est déterminée avec précision pour chaque position sur le corps. Par exemple, les follicules pileux sur le point de rostrale de retour à caudale et les cheveux sur la surface dorsale des pieds font de proximal en distal. Follicule pileux orientation est commandée par la signalisation de la polarité planaire cellulaire (PCP; également appelé polarité tissulaire 5). Ce système de signalisation a été découvert chez la drosophile, où un petitensemble de gènes de PCP de base a été trouvé pour contrôler l&#39;orientation des poils et des poils cuticulaires. Trois orthologues mammifères de gènes PCP de base - homologues crépus 6 (Fzd6, aussi appelé Fz6), cadhérine FEM LAG sept-pass récepteur de type G 1 (Celsr1), et vang-like 2 (Vangl2) - jouent des rôles analogues à des mammifères peau, de coordonner les orientations de follicules pileux avec les axes du corps. Les études de FZ6 knockout souris (Fzd6 tm1Nat, ci-après dénommé Fz6 - / -) montrent que le défaut primaire en l&#39;absence de signalisation de PCP est une randomisation initiale ou la désorganisation de l&#39;orientation du follicule pileux, sans effet sur ​​la structure intrinsèque des follicules 6-8. Un deuxième système non-PCP agit plus tard à promouvoir alignement local de follicules à proximité, ce qui conduit à la production de modèles de cheveux à grande échelle tels que tours et des touffes. Un deuxième exemple de grande échelleorganisation spatiale dans la peau est vu dans les morphologies des tonnelles axonales sensorielles. Les neurones sensoriels qui innervent la peau ont leurs corps cellulaires dans la racine dorsale et les ganglions de Gasser. Ces neurones détectent la température, la douleur, les démangeaisons, et divers types de déformations mécaniques incidentes sur la peau et les cheveux 9. Ils peuvent être divisés en sous-types basés sur le diamètre de l&#39;axone et la vitesse de conduction, de la structure de terminaison du nerf terminal, et les profils d&#39;expression de récepteurs, de canaux et d&#39;autres molécules. En raison de la forte densité d&#39;innervation à l&#39;intérieur de la peau, des analyses qui impliquent la visualisation de l&#39;ensemble des axones (par exemple, l&#39;immunomarquage anti-neurofilaments) ou même tous les axones d&#39;une seule classe (comme on le voit lorsque un seul type cellulaire est caractérisée par l&#39;expression d&#39;un rapporteur fluorescent) révèle généralement une superposition dense des axones qui rend impossible de définir la morphologie d&#39;un arbre individuel. Pour contourner ce problème, nous avons utilisé très clairsemée l génétiquement dirigéeAbeling pour produire des échantillons de peau dorsale dans laquelle chaque tonnelles axonales bien isolées sont visualisés par l&#39;expression d&#39;un journaliste histochimique, la phosphatase alcaline placentaire humaine 10. Cette approche permet la visualisation sans ambiguïté des différents morphologies axone tonnelle et une définition des types de neurones somato-sensoriel basé sur des critères morphologiques.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="824">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:256px;">Company</td>
			<td style="width:145px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-bromo-4-chloro-indolyl phosphate (BCIP)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11383221001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AM1-43</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>70024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AM4-65</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>70039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benzyl alcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>402834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benzyl benzoate</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>B-6630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:256px;">Zeiss</td>
			<td style="width:145px;">LSM700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cy3-alpha smooth muscle actin antibody</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C6198</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytokeratin-8&#160;</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>TROMA-I-c</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection tools&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td></td>
			<td>scissors and forceps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electric razor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluoromount G</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>17984-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formalin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass dishes</td>
			<td>Pyrex&#160;</td>
			<td></td>
			<td>6 cm and 10 cm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass plates</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td>SE202P-10</td>
			<td>10 cm x 8 cm x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hair remover&#160;</td>
			<td>Nair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horizontal rotating platform&#160;</td>
			<td style="width:256px;">Hoefer</td>
			<td style="width:145px;">PR250 Orbital shaker</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insect pins</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketamine/xylazine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nitroblue tetrazolium (NBT)</td>
			<td>Roche&#160;</td>
			<td>11383213001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oil Red O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Razor Blades</td>
			<td style="width:256px;">VWR</td>
			<td style="width:145px;">55411-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Secondary antibodies&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>Alexa-dye conjugated&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sylgard-184</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9020938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture plastic dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 cm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6- and 12-well&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology

La peau est un tissu très hétérogène. Structures intra-dermiques comprennent les follicules pileux, les muscles arrector de pili, spécialisations épidermiques (tels que des amas de cellules de Merkel), les glandes sébacées, les nerfs et les terminaisons nerveuses, et des capillaires. La disposition spatiale de ces structures est étroitement contrôlée à l&#39;échelle microscopique - comme on le voit, par exemple, dans l&#39;agencement ordonné des types de cellules au sein d&#39;un seul follicule de cheveux - et à l&#39;échelle macroscopique - comme on le voit par les orientations presque identiques de milliers de cheveux follicules au sein d&#39;une région locale de la peau. Visualiser ces structures sans sectionnement physiquement la peau est possible en raison de la géométrie à 2 dimensions de cet organe. Dans ce protocole, nous montrons que la peau de la souris peut être disséqué, fixées, perméabilisées, coloré, et a précisé que l&#39;objet de deux dimensions intact, un montage plat. Le protocole permet de visualiser facilement les structures de la peau dans leur totalité à travers toute l&#39;épaisseur de grandes surfaces de peau par optsectionnement ical et la reconstruction. Les images de ces structures peuvent également être intégrés avec des informations sur la position et l&#39;orientation par rapport aux axes du corps.

imagerie de fond clair de flatmounts de la peau peut être utilisée pour l&#39;image afférences sensorielles cutanées (figure 3A) et 10 modèles de follicules pileux sur la base de pigmentation mélanique (Figure 4). L&#39;imagerie confocale d&#39;flatmounts de la peau peut être utilisée pour définir la géométrie de (1) des agrégats de cellules Merkel, visualisées avec un anticorps anti-cytokératine-6 ​​ou à l&#39;absorption AM de teinture (figures 3I-...

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Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology

La peau des mammifères contient un large éventail de structures - comme les follicules pileux et les terminaisons nerveuses - qui présentent des modèles distinctifs de l&#39;organisation spatiale. Analyser la peau comme un support plat profite de la géométrie à 2 dimensions de ce tissu pour produire toute l&#39;épaisseur des images haute résolution des structures de la peau.

Appartement Mont imagerie de la peau de souris et son application à l&#39;analyse des follicules pileux Modélisation et sensorielle Axon Morphologie

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Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Tout le mont immunomarquage des récepteurs olfactifs neurones dans le<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenne

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

Whole-monter imagerie de l&#39;embryon de souris projections sensorielles Axon

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imagerie Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamics dans les terminaux cône photorécepteur Axon de la rétine de souris

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Mont entiers Dissection et immunofluorescence de la cochlée de souris adultes

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings

Enregistrement combiné de Mécaniquement Stimulé Afférent Sortie et Nerve Terminal Etiquetage Souris follicule pileux lancéolées Endings

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The ...

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Surveillance optique de Living Nerve Terminal Marquer follicule pileux lancéolées Endings du<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Souris oreille peau

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina

Patch Clamp Enregistrement de cellules amacrines Starburst dans un plat de montage Préparation de Deafferentated Souris Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic ...