Name: flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology
Uploaded: 2014-06-25T15:00:00
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The authors thank Dr. Amir Rattner for helpful comments on the manuscript. Supported by the Howard Hughes Medical Institute.

Questo studio è stato eseguito in stretta conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health. Tutti gli animali sono stati trattati secondo approvata la cura degli animali istituzionale e l&#39;uso comitato (IACUC) protocollo MO11M29 delle istituzioni mediche del Johns Hopkins. Consultare le linee guida Istituzionale cura degli animali e uso comitato per i metodi approvati di eutanasia locali. Indossare guanti, camice da laborator...

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	<li>Burns, T., Breathnach, S., Cox, N., Griffiths, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Rook's Textbook of Dermatology. 8th ed. , (2010).</li><li>Lee, J., Tumbar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hairy+tale+of+signaling+in+hair+follicle+development+and+cycling.">Hairy tale of signaling in hair follicle development and cycling.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 23, 906-916 (2012).</li><li>Masland, R. 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Cell Biol. 10, 1257-1268 (2008).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+organization+of+cutaneous+low-threshold+mechanosensory+neurons.">The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons.</a> Cell. 147, 1615-1627 (2011).</li><li>Meyers, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lighting+up+the+senses:+FM1-43+loading+of+sensory+cells+through+nonselective+ion+channels.">Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels.</a> J. Neurosci. 23, 4054-4065 (2003).</li><li>Fujiwara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basement+membrane+of+hair+follicle+stem+cells+is+a+muscle+cell+niche.">The basement membrane of hair follicle stem cells is a muscle cell niche.</a> Cell. 144, 577-589 (2011).</li><li>Orsini, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technique+of+preparation,+study+and+photography+of+benzyl-benzoate+cleared+material+for+embryological+studies.">Technique of preparation, study and photography of benzyl-benzoate cleared material for embryological studies.</a> J. Reprod. Fertil. 3, 283-287 (1962).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat. Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li><li>Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearT:+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue.">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140, 1364-1368 (2013).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat. Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li><li>Aal Ert&#252;rk, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+for+mapping+the+nervous+system.">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nat. Methods. 10, 508-513 (2013).</li></ol>

Padronanza dei metodi di dissezione sopra descritti richiede solo pazienza, una mano ferma e un paio di buoni strumenti di dissezione. La pelle dissezione dorsale è relativamente facile, ma la coda e la pelle del piede dissezioni - soprattutto in età precoce postnatale - sono più impegnativo. In età precoce prenatale (ad esempio, prima di E15), la pelle è difficile da rimuovere senza strapparla. Opportunamente, per molti studi di crescita e patterning di strutture della pelle nei topi, gli eventi di intere...

La pelle è uno dei più grandi organi del corpo, con importanti funzioni somato-sensazione, isolamento / termoregolazione e difesa immunitaria 1. Comprensione delle basi molecolari e cellulari della pelle sviluppo e la funzione è stata di interesse di lunga data per l&#39;importanza fondamentale della pelle come un sistema biologico e la sua rilevanza per dermatologia. Pelle dei mammiferi contiene una varietà di strutture multicellulari, tra cui stratificazioni di cheratinociti, il tessuto connettivo dermico, diversi tipi di follicoli piliferi, le ghiandole sebacee, muscoli erettore del pelo, vasi sanguigni, e almeno una dozzina di classi distinte di afferenti (sensoriali) ed efferenti del nervo fibre (Figura 1). Diverse regioni del corpo sono associate caratteristicamente diversi tipi di pelle. Nella maggior parte dei mammiferi, quasi tutta la superficie corporea è coperto con la pelle che è densamente compresso con follicoli piliferi. [Gli esseri umani e talpe nude costituiscono deroghe al secoloè modello.] Capelli manca dalle superfici palmari delle mani e dei piedi, che sono anche associati con modelli specializzati epidermiche (dermatoglifi), ghiandole esocrine, e le terminazioni nervose sensoriali. Gli eventi cellulari e molecolari che controllano la crescita, la differenziazione e la disposizione spaziale delle cellule all&#39;interno del follicolo pilifero sono di particolare interesse in quanto ogni follicolo mostre, in miniatura, molte delle caratteristiche centrali della organogenesi 2. Queste funzionalità includono l&#39;esistenza delle cellule staminali e una nicchia di cellule staminali, le migrazioni cellulari coreografati con precisione, e il montaggio di strutture multicellulari dai componenti embriologicamente distinte. Questo articolo descrive i metodi per la dissezione, il fissaggio, l&#39;etichettatura, e la pelle del mouse di imaging come un foglio bidimensionale intatta, indicato come un &quot;tutto il monte&quot; o &quot;flat mount&quot; di preparazione. Poiché la pelle mouse è relativamente sottile, è possibile immagine attraverso l&#39;intero spessore di sci appiattitan usando la microscopia confocale convenzionale. L&#39;approccio piatta monte all&#39;imaging pelle del mammifero è tecnicamente vantaggioso perché evita il bisogno di sezionamento fisico, consentendo in tal modo strutture da ricostruire interamente sezionamento ottico. Poiché quasi tutta la pelle viene elaborato come un singolo oggetto, il piatto di montaggio approccio facilita anche l&#39;imaging di più regioni della superficie del corpo, preservando informazioni sulla posizione e l&#39;orientamento rispetto agli assi del corpo. Infine, le strutture all&#39;interno della pelle sono tipicamente presenti nei modelli che si ripetono a intervalli regolari, facilitando così la raccolta di immagini da più rappresentanti di una data struttura. Queste caratteristiche sono familiari a neurobiologi che lavorano sulla retina, una parte bidimensionale del sistema nervoso centrale che gode di vantaggi analoghi per studi di morfologia neuronale 3. L&#39;approccio montare piatto qui descritto è di utilit specialey per lo studio delle strutture che presentano organizzazione spaziale su scala relativamente grande sul piano bidimensionale della pelle. Un esempio di grande organizzazione spaziale è la polarità coordinata dei follicoli piliferi e delle strutture follicolo-associato capelli - gruppi di cellule di Merkel, muscoli muscolo piloerettore, ghiandole sebacee, e le terminazioni nervose 4. Follicoli piliferi sono orientate ad un angolo rispetto al piano della pelle, e la componente del vettore follicolo che sia situato sul piano 2-dimensionale della pelle generalmente esibisce un orientamento rispetto agli assi del corpo che è preciso per ciascun posizione sul corpo. Ad esempio, i follicoli dei capelli sul punto di ritorno da rostrale a caudale e capelli sulla superficie dorsale dei piedi puntano da prossimale a distale. Capelli orientamento follicolo è controllato da segnali di polarità planare delle cellule (PCP, chiamato anche la polarità del tessuto 5). Questo sistema di segnalazione è stato scoperto in Drosophila dove un piccoloinsieme di geni essenziali PCP è stata trovata per controllare l&#39;orientamento di peli e cuticolare setole. Tre orthologues mammiferi di geni fondamentali PCP - omologhi frizzled 6 (Fzd6, noto anche come FZ6), caderina EGF LAG sette-pass G-recettore tipo 1 (Celsr1), e vang-like 2 (Vangl2) - svolgono ruoli analoghi in mammiferi pelle, coordinando gli orientamenti dei follicoli dei capelli con gli assi del corpo. Studi di FZ6 topi knockout (Fzd6 tm1Nat, di seguito denominato FZ6 - / -) mostrano che il difetto primario in assenza di segnalazione PCP è una randomizzazione iniziale o disorganizzazione dell&#39;orientamento follicolo pilifero, senza alcun effetto sulla struttura intrinseca dei follicoli 6-8. Un secondo sistema non-PCP agisce successivamente per favorire l&#39;allineamento locale di follicoli vicini, che porta alla produzione di grandi schemi per capelli come spirali e ciuffi. Un secondo esempio di grande scalaorganizzazione spaziale all&#39;interno della pelle è visto nelle morfologie di pergole assoni sensoriali. Neuroni sensoriali che innervano la pelle hanno i loro corpi cellulari nella radice dorsale e gangli del trigemino. Questi neuroni rilevano temperatura, dolore, prurito, e vari tipi di deformazioni meccaniche che influiscono sulla pelle e capelli 9. Essi possono essere suddivisi in sottotipi in base diametro dell&#39;assone e velocità di conduzione, struttura terminale del nervo finale, e gli schemi di espressione dei recettori, canali e altre molecole. A causa della elevata densità di innervazione all&#39;interno della pelle, analisi che coinvolgono visualizzare tutti assoni (ad esempio, immunocolorazione anti-neurofilamenti) o anche tutti assoni di una singola classe (come visto quando un singolo tipo di cellula è marcata mediante espressione di un reporter fluorescente) generalmente rivela una fitta sovrapposizione di assoni che rende impossibile definire la morfologia di un individuo Arbor. Per aggirare questo problema, abbiamo utilizzato molto radi geneticamente diretto lAbeling per produrre campioni di pelle dorsali in cui i singoli pergole assone ben isolate sono visualizzabili da espressione di un giornalista istochimica, fosfatasi alcalina placentare umano 10. Questo approccio permette la visualizzazione inequivocabile delle singole morfologie assone pergolato e una definizione dei tipi di neuroni somatosensoriali sulla base di criteri morfologici.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="824">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:256px;">Company</td>
			<td style="width:145px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-bromo-4-chloro-indolyl phosphate (BCIP)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11383221001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AM1-43</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>70024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AM4-65</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>70039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benzyl alcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>402834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benzyl benzoate</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>B-6630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:256px;">Zeiss</td>
			<td style="width:145px;">LSM700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cy3-alpha smooth muscle actin antibody</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C6198</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytokeratin-8&#160;</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>TROMA-I-c</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection tools&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td></td>
			<td>scissors and forceps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electric razor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluoromount G</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>17984-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formalin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass dishes</td>
			<td>Pyrex&#160;</td>
			<td></td>
			<td>6 cm and 10 cm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass plates</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td>SE202P-10</td>
			<td>10 cm x 8 cm x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hair remover&#160;</td>
			<td>Nair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horizontal rotating platform&#160;</td>
			<td style="width:256px;">Hoefer</td>
			<td style="width:145px;">PR250 Orbital shaker</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insect pins</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketamine/xylazine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nitroblue tetrazolium (NBT)</td>
			<td>Roche&#160;</td>
			<td>11383213001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oil Red O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Razor Blades</td>
			<td style="width:256px;">VWR</td>
			<td style="width:145px;">55411-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Secondary antibodies&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>Alexa-dye conjugated&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sylgard-184</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9020938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture plastic dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 cm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6- and 12-well&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology

La pelle è un tessuto altamente eterogeneo. Strutture intra-dermiche includono follicoli piliferi, i muscoli erettore del pelo, specializzazioni epidermiche (come gruppi di cellule di Merkel), ghiandole sebacee, nervi e terminazioni nervose e capillari. La disposizione spaziale di queste strutture è strettamente controllata su scala microscopica - come si è visto, ad esempio, nella disposizione ordinata di tipi cellulari all&#39;interno di un singolo follicolo pilifero - e su scala macroscopica - come visto dagli orientamenti quasi identiche di migliaia di capelli follicoli in una regione locale di pelle. Visualizzazione queste strutture senza sezionare fisicamente la pelle è possibile a causa della geometria 2-dimensionale di questo organo. In questo protocollo, dimostriamo che la pelle del mouse può essere sezionato, fisso, permeabilizzate, macchiato, e ha chiarito come un oggetto a due dimensioni intatte, un monte piatto. Il protocollo consente una facile visualizzazione delle strutture cutanee nella loro interezza attraverso l&#39;intero spessore di grandi aree di pelle optsezionamento iCal e ricostruzione. Immagini di queste strutture possono essere integrate con le informazioni sulla posizione e l&#39;orientamento rispetto agli assi del corpo.

Brightfield imaging flatmounts pelle può essere utilizzato per immagine afferenze cutanee sensoriali (Figura 3A 10) e modelli follicolo basato su melanina pigmentazione (Figura 4). Confocale di flatmounts pelle può essere utilizzato per definire la geometria di (1) gruppi di cellule Merkel, visualizzati con anti-citocheratina-6 o con AM colorante assorbimento (figure 3I-L), (2) i muscoli erettore del pelo, visualizzati con anti- actina muscolo liscio <stron...

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Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology

Pelle dei mammiferi contiene una gamma diversificata di strutture - come i follicoli piliferi e le terminazioni nervose - che presentano modelli distintivi di organizzazione spaziale. Analizzando pelle come cavalcatura piatto approfitta della geometria 2-dimensionale di questo tessuto per produrre tutto spessore immagini ad alta risoluzione delle strutture cutanee.

Appartamento Monte Imaging di pelle di topo e la sua applicazione alla analisi del follicolo pilifero patterning e sensoriale Axon Morfologia

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel ...

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Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

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The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

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Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Preparazione del tessuto e immunocolorazione di fibre nervose che innervano il mouse sensoriali della pelle e ossa degli arti

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Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Tutta Monte immunomarcatura di recettore olfattivo neuroni nel<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenna

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Whole-mount Imaging di embrione di topo Sensory Axon Proiezioni

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dinamica a cono fotorecettore Axon Terminali della retina di topo

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Tutta Monte dissezione e immunofluorescenza del topo adulto Coclea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings

Registrazione combinata di uscita meccanicamente stimolata afferenti ed nervo terminale Etichettatura in mouse follicolo pilifero lanceolate Endings

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The ...

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Il monitoraggio ottico di Living nervo terminale Etichettatura nel follicolo pilifero lanceolate Endings del<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse Ear pelle

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina

Patch clamp di celle Starburst amacrine in un appartamento di montaggio Preparazione di Deafferentated mouse Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic ...