Name: flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology
Uploaded: 2014-06-25T15:00:00
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The authors thank Dr. Amir Rattner for helpful comments on the manuscript. Supported by the Howard Hughes Medical Institute.

この研究は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドの推奨事項に厳密に従って実施された。動物のすべてが承認された制度的動物管理使用委員会ジョンズホプキンス医療機関（IACUC）プロトコルMO11M29に従って取り扱った。安楽死の承認された方法については、地域機関動物実験委員会のガイドラインを参照してください。アルデヒド固定剤や有機溶剤を取り扱う際は手袋、?...

<ol>
	<li>Burns, T., Breathnach, S., Cox, N., Griffiths, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Rook's Textbook of Dermatology. 8th ed. , (2010).</li><li>Lee, J., Tumbar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hairy+tale+of+signaling+in+hair+follicle+development+and+cycling.">Hairy tale of signaling in hair follicle development and cycling.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 23, 906-916 (2012).</li><li>Masland, R. 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T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat. Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li><li>Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearT:+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue.">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140, 1364-1368 (2013).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat. Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li><li>Aal Ert&#252;rk, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+for+mapping+the+nervous+system.">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nat. Methods. 10, 508-513 (2013).</li></ol>

上記の解剖​​方法の習得だけ忍耐、着実に手を必要とし、いくつかの良い解剖ツール。背部皮膚切開は比較的簡単ですが、尾や足の皮膚切開 - 特に生後初期の年齢では、 - より困難である。 （E15前など ）の早期出生前年齢で、皮膚はそれを引き裂くことなく除去することは困難である。立毛筋19の成長の研究に見られるように、例えば、好都合なことに、マウスにおける皮?...

皮膚は体性感覚、断熱材/体温調節、および免疫防御1で重要な機能と体内で最も大きな臓器の一つである。肌の発生と機能の分子細胞基盤を理解することがあるため、生体系および皮膚科学との関連性などの皮膚の基本的に重要で長年注目されています。哺乳類の皮膚は、ケラチノサイトの層状の層、真皮結合組織、毛嚢のいくつかのタイプ、皮脂腺、立毛筋、血管、および求心性の少なくともダースの異なるクラス（感覚）と遠心性神経を含む多細胞構造物の様々な含まれている繊維（ 図1）。身体の異なる領域は、皮膚の特徴的に異なったタイプに関連付けられています。ほとんどの哺乳類では、ほぼ全体表面が密に毛包が充填されている皮膚で覆われている。 [人間と裸のモルラットは番目の例外を構成するパターンです。]髪はまた特殊な表皮パターン（dermatoglyphs）、外分泌腺、および感覚神経終末に関連している手と足の掌表面から欠落しています。増殖、分化、および毛包内の細胞の空間配置を制御する細胞および分子事象は、器官2の中心機能の多くは、小型で、各卵胞の展示として特に興味深い。これらの機能は、幹細胞の存在と幹細胞ニッチ、正確振り付け細胞の移行、および発生学の異なるコンポーネントから多細胞構造のアセンブリを含む。 この記事では、完全な2次元のシートとして、定着、ラベル付け、およびイメージングマウスの皮膚を切開するための方法を説明し、「全体のマウント」または「マウントフラット」の準備と呼ばれる。マウスの皮膚が比較的薄いので、平坦化されたスキー板の全厚を通って画像化することが可能であるnは、従来の共焦点顕微鏡を用いて。哺乳動物の皮膚を撮像するためのフラットマウントアプローチ、それによって構造が光学セクショニングによって完全に再構成することができるように、物理的なセクショニングの必要性をバイパスするため、技術的に有利である。皮膚のほぼ全体が単一のオブジェクトとして処理されるため、本体の軸に相対的な位置姿勢についての情報を保存しながら、フラットマウントアプローチは、体表面の複数の領域の画像化を容易にする。最後に、皮膚内の構造は、典型的には、このように所定の構造の複数の代表者からの画像の収集を容易にする、一定の間隔で繰り返されるパターンで存在する。これらの特性は、網膜ニューロンの形態3の研究のために類似の利点を享受し、中枢神経系の二次元部分で動作神経生物学者にはよく知られている。 ここで説明するフラットマウントのアプローチは、特別なUTILITある皮膚の二次元平面内の比較的大規模に空間的構成を示す構造を研究するためのy。メルケル細胞クラスター、立毛筋、皮脂腺、および神経終末4 -大規模空間的構成の一例としては、毛包や毛包関連構造の協調極性である。毛包、皮膚の平面に対してある角度で配向され、皮膚の2次元平面内にある毛包ベクトルの成分は、一般に、正確に決定されるごとに、本体軸に対して配向を呈するている身体上の位置。例えば、足の背側表面に尾する吻側および毛髪からのバックポイントの毛包は、近位から遠位を指す。毛嚢の向きは、平面細胞極性シグナル伝達によって制御される（PCP;とも呼ばれる組織極性5）。この信号システムは、小さなショウジョウバエで発見されましたコアPCP遺伝子のセットは、クチクラの毛と毛の向きを制御することが見出された。三つの哺乳類コアPCP遺伝子のオルソログ- （もFZ6とも呼ばFZD6、）のfrizzledホモログ6、のEGF LAG 7パスGタイプ受容体1（CELSR1を ）カドヘリン、およびバング様2（Vangl2は ） -哺乳類に類似した役割を果たしている皮膚、身体の軸を毛嚢の向きを調整する。 FZ6ノックアウトマウス（ - / - FZD6 tm1Nat、以下FZ6と称する）の研究は、PCPシグナル伝達の非存在下で一次欠陥は、卵胞の固有の構造に影響を与えず、毛包の向きの初期ランダム化又は無秩序であることを示す6-8。第二の非PCPシステムは、渦巻きや房のような大規模なヘアパターンの生成をもたらす近くの卵胞のローカルアラインメントを促進するために後で役割を果たします。 大規模の第二の例皮膚内の空間的構成は、感覚軸索アーバーの形態を見られます。皮膚を支配する感覚ニューロンは、脊髄後根および三叉神経節に細胞体を持っている。これらのニューロンは、温度、疼痛、かゆみ、皮膚や毛髪9に衝突する機械的変形の様々なタイプを検出する。これらは、軸索の直径および伝導速度、末端神経終末の構造、および受容体、チャネル、および他の分子の発現のパターンに基づいて亜型に分けることができる。そのため皮膚内神経支配の高密度のため、（単一の細胞型は蛍光レポーターの発現によってマークされているときに見られるように）それはすべての軸索（ 例えば 、抗ニューロフィラメント免疫染色）、または単一のクラスであっても、すべての軸索を可視伴う分析する一般的には不可能個々のアーバの形態を定義することが軸索の密な重ね合わせが明らかになった。この問題を回避するために、我々は非常に疎な遺伝的突然変異リットルを使用しているabelingは、個々の十分に単離された軸索アーバは組織化学的レポーター、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ10の発現によって可視化された背部皮膚サンプルを作製した。このアプローチは、個々の軸索アーバの形態を明確に可視化し、形態学的基準に基づいて、体性感覚ニューロンの種類を定義できます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="824">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:256px;">Company</td>
			<td style="width:145px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-bromo-4-chloro-indolyl phosphate (BCIP)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11383221001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AM1-43</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>70024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AM4-65</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>70039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benzyl alcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>402834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benzyl benzoate</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>B-6630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:256px;">Zeiss</td>
			<td style="width:145px;">LSM700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cy3-alpha smooth muscle actin antibody</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C6198</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytokeratin-8&#160;</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>TROMA-I-c</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection tools&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td></td>
			<td>scissors and forceps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electric razor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluoromount G</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>17984-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formalin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass dishes</td>
			<td>Pyrex&#160;</td>
			<td></td>
			<td>6 cm and 10 cm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass plates</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td>SE202P-10</td>
			<td>10 cm x 8 cm x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hair remover&#160;</td>
			<td>Nair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horizontal rotating platform&#160;</td>
			<td style="width:256px;">Hoefer</td>
			<td style="width:145px;">PR250 Orbital shaker</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insect pins</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketamine/xylazine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nitroblue tetrazolium (NBT)</td>
			<td>Roche&#160;</td>
			<td>11383213001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oil Red O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Razor Blades</td>
			<td style="width:256px;">VWR</td>
			<td style="width:145px;">55411-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Secondary antibodies&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>Alexa-dye conjugated&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sylgard-184</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9020938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture plastic dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 cm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6- and 12-well&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology

皮膚は非常に不均質な組織である。皮内構造は、毛包、立毛筋（例えばメルケル細胞クラスターなど）の表皮の専門分野、皮脂腺、神経や神経終末、および毛細血管が含まれる。これらの構造の空間的配置を密に顕微鏡スケールで制御されている - と巨視的スケールで - - 、例えば、単一の毛包内の細胞型の整然とした配置に見られるように、毛髪の数千のほぼ同一の向きに見られるように皮膚の局所的領域内の卵胞。物理的に肌を区画することなく、これらの構造を視覚化するため、この器官の2次元ジオメトリに可能である。このプロトコルでは、マウスの皮膚を切開し、固定し、透過処理し、染色し、インタクトな二次元の物体、平坦なマウントとして明確にすることができることを示している。プロトコルは、OPTによる皮膚の広い領域の全厚さを貫通して、その全体が皮膚構造を簡単に可視化を可能にするiCalの切片と復興。これらの構造の画像は、また、体軸に位置及び向きに関する情報と統合することができる。

皮膚のフラットマウントの明視野イメージングは、メラニン色素沈着（ 図4）に基づいて画像の皮膚感覚求心性神経（ 図3A 10）及び毛包パターンに使用することができる。皮膚のフラットマウントの共焦点イメージングは、抗サイトケラチン6、または有する抗可視化AM色素取り込み（3I-Lフィギュア ）、（2）立毛筋、で可視化（1）メルケル細胞?...

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Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology

このような毛包と神経終末など - - 空間構成の特徴的なパターンを示す哺乳動物の皮膚は、構造体の多様な配列が含まれています。フラットマウントとして皮膚を分析して皮膚構造の全層の高解像度画像を生成するためにこの組織の2次元形状を利用する。

マウス皮膚や毛包パターニングおよび感覚軸索形態の解析への応用のフラットマウントイメージング

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

複数のマウスの神経解剖学的磁気共鳴イメージング

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

スキンと四肢骨の神経支配マウス感覚神経線維の組織の調製と免疫染色

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

における嗅覚受容ニューロンのホールマウント免疫標識<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;アンテナ

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

マウスの胚感覚軸索投影のホールマウントイメージング

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

イメージングカルシウム<sup&gt; 2+</supマウス網膜の光受容コーン軸索末端で&gt;ダイナミクス

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

成体マウス蝸牛のホールマウント解剖および免疫蛍光

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings

マウスの毛包披針形エンディングで機械的に刺激された求心性の出力および神経ターミナルラベリングの複合記録

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The ...

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

の毛包披針形語尾に神経末端標識リビングの光監視<em&gt; ex vivoで</em&gt;マウスの耳皮膚

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina

Deafferentatedマウス網膜のフラットマウントの準備中のスターバーストアマクリン細胞のパッチクランプ記録

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic ...