Name: flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology
Uploaded: 2014-06-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology at JoVE.com

The authors thank Dr. Amir Rattner for helpful comments on the manuscript. Supported by the Howard Hughes Medical Institute.

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. Todos os animais foram tratados de acordo com cuidados com os animais institucional e uso comitê aprovou (IACUC) protocolo MO11M29 das Instituições Médicas de Johns Hopkins. Consulte as diretrizes do Comitê Animal Care e Use Institucional locais para métodos aprovados de eutanásia. Use luvas, jaleco e óculos de segurança ao manusear fixadores aldeído...

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	<li>Burns, T., Breathnach, S., Cox, N., Griffiths, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Rook's Textbook of Dermatology. 8th ed. , (2010).</li><li>Lee, J., Tumbar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hairy+tale+of+signaling+in+hair+follicle+development+and+cycling.">Hairy tale of signaling in hair follicle development and cycling.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 23, 906-916 (2012).</li><li>Masland, R. 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Cell Biol. 10, 1257-1268 (2008).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+organization+of+cutaneous+low-threshold+mechanosensory+neurons.">The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons.</a> Cell. 147, 1615-1627 (2011).</li><li>Meyers, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lighting+up+the+senses:+FM1-43+loading+of+sensory+cells+through+nonselective+ion+channels.">Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels.</a> J. Neurosci. 23, 4054-4065 (2003).</li><li>Fujiwara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basement+membrane+of+hair+follicle+stem+cells+is+a+muscle+cell+niche.">The basement membrane of hair follicle stem cells is a muscle cell niche.</a> Cell. 144, 577-589 (2011).</li><li>Orsini, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technique+of+preparation,+study+and+photography+of+benzyl-benzoate+cleared+material+for+embryological+studies.">Technique of preparation, study and photography of benzyl-benzoate cleared material for embryological studies.</a> J. Reprod. Fertil. 3, 283-287 (1962).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat. Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li><li>Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearT:+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue.">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140, 1364-1368 (2013).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat. Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li><li>Aal Ert&#252;rk, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+for+mapping+the+nervous+system.">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nat. Methods. 10, 508-513 (2013).</li></ol>

Domínio dos métodos de dissecação descritos acima requer apenas paciência, uma mão firme, e algumas boas ferramentas de dissecação. A pele dissecção dorsal é relativamente fácil, mas a cauda e pele pé dissecações - especialmente em idades pós-natais - são mais exigentes. Em idades precoces pré-natal (por exemplo, antes de E15), a pele é difícil de remover, sem rasgá-la. Convenientemente, para muitos estudos de crescimento e padronização de estruturas da pele em ratos, os eventos de intere...

A pele é um dos maiores órgãos do corpo, com funções importantes no somato-sensação, isolamento / termorregulação e defesa imunológica 1. Compreender a base molecular e celular do desenvolvimento da pele e função tem sido de interesse de longa data por causa da importância fundamental da pele como um sistema biológico e sua relevância para a dermatologia. Pele de mamíferos contém uma variedade de estruturas multicelulares, incluindo camadas estratificadas de queratinócitos, tecido conjuntivo dérmico, vários tipos de folículos capilares, glândulas sebáceas, músculo eretor de pêlos, vasos sanguíneos, e pelo menos uma dúzia de classes distintas de aferentes (sensoriais) e nervo eferente fibras (Figura 1). Diferentes regiões do corpo estão associadas com caracteristicamente diferentes tipos de pele. Na maioria dos mamíferos, quase toda a superfície corporal é coberta com pele que é densamente com folículos pilosos. [Os seres humanos e os ratos-toupeira pelados constituem exceções ao thé padrão.] cabelo está ausente das superfícies palmar das mãos e dos pés, que também estão associados a padrões especializados epidérmico (dermatoglyphs), as glândulas exócrinas, e terminações nervosas sensoriais. Os eventos celulares e moleculares que controlam o crescimento, diferenciação e arranjo espacial das células dentro do folículo piloso são de especial interesse como cada exposições do folículo, em miniatura, muitas das características centrais da organogênese 2. Esses recursos incluem a existência de células-tronco e um nicho de células-tronco, as migrações celulares precisamente coreografadas, ea montagem de estruturas multicelulares a partir de componentes embriologicamente distintas. Este artigo descreve métodos para dissecar, fixação, rotulagem, e pele do rato de imagem como uma folha bidimensional intacto, referido como um &quot;todo monte&quot; ou &quot;flat montar&quot; preparação. Desde que a pele do rato é relativamente fina, é possível para a imagem em toda a espessura de esqui achatadan, usando microscopia confocal convencional. A abordagem plana de montagem para imagiologia pele de mamíferos é tecnicamente vantajosa, pois evita a necessidade de seccionamento físico, permitindo assim que as estruturas de ser reconstruído inteiramente por seccionamento óptico. Uma vez que quase toda a pele é processado como um único objecto, o plano de montagem abordagem também facilita a criação da imagem de várias regiões da superfície do corpo, enquanto preserva as informações sobre a posição e orientação em relação aos eixos do corpo. Finalmente, as estruturas dentro da pele estão tipicamente presentes em padrões que são repetidos em intervalos regulares, facilitando assim a obtenção de imagens a partir de vários representantes de uma dada estrutura. Estas características são familiares para neurobiologists que trabalham na retina, uma peça de duas dimensões do sistema nervoso central, que goza de vantagens análogas para estudos de morfologia neuronal 3. A abordagem plana montar aqui descrito é de utilit especialy para o estudo das estruturas que exibem organização espacial numa escala relativamente grande dentro do plano bidimensional da pele. Um exemplo de organização espacial em larga escala é a polaridade coordenada dos folículos pilosos e as estruturas associadas ao folículo piloso - grupos de células de Merkel, músculos eretor do pêlo, glândulas sebáceas, e terminações nervosas 4. Os folículos do cabelo são orientados com um ângulo em relação ao plano da pele, e o componente do vector de folículo, que se situa dentro do plano da 2-dimensional da pele exibe geralmente uma orientação em relação aos eixos do corpo que é determinada com precisão para cada posição sobre o corpo. Por exemplo, os folículos pilosos no ponto de volta da rostral para caudal e cabelo na superfície dorsal dos pés apontam de proximal para distal. Orientação folículo de cabelo é controlado por planar sinalização polaridade celular (PCP, também chamado de polaridade de tecido 5). Este sistema de sinalização foi descoberto em Drosophila, onde um pequenoconjunto de genes de PCP núcleo foi encontrada para controlar a orientação dos cabelos cuticulares e cerdas. Três ortólogos de genes de mamíferos PCP fundamentais - homólogos frisado 6 (Fzd6, também conhecido como Fz6), caderina EGF LAG sete-pass G-receptor tipo 1 (Celsr1) e burro-like 2 (Vangl2) - exercer funções análogas em mamíferos pele, coordenando as orientações dos folículos pilosos com os eixos do corpo. Os estudos de camundongos knockout Fz6 (Fzd6 tm1Nat, doravante referida como Fz6 - / -) mostram que o defeito primário na ausência de sinalização PCP é uma randomização inicial ou desorganização da orientação folículo piloso, com nenhum efeito sobre a estrutura intrínseca dos folículos 6-8. Um segundo sistema não-PCP age mais tarde para promover alinhamento local de folículos próximos, o que leva à produção de padrões de cabelo em grande escala, tais como espirais e tufos. Um segundo exemplo de grande escalaorganização espacial dentro da pele é visto nas morfologias de mandris axônios sensoriais. Neurônios sensoriais que inervam a pele têm seus corpos celulares na raiz dorsal e gânglios trigeminal. Estes neurônios detectar a temperatura, dor, prurido, e vários tipos de deformações mecânicas que incidem sobre a pele e cabelo 9. Eles podem ser divididos em subtipos baseados nas diâmetro e velocidade de condução axonal, a estrutura final do nervo terminal, e os padrões de expressão dos receptores, canais e outras moléculas. Devido à elevada densidade de inervação dentro da pele, as análises que envolvem a visualização de todos os axónios (por exemplo, a imunocoloração anti-neurofilamento) ou mesmo todos os axónios de uma classe única (como se vê quando um único tipo de célula está marcada pela expressão de um repórter fluorescente) geralmente revela uma sobreposição densa de axônios que faz com que seja impossível definir a morfologia de um mandril individual. Para contornar esse problema, temos utilizado extremamente escassa l geneticamente dirigidoAbeling para produzir amostras de pele dorsal, em que os mandris de axónios individuais bem isoladas são visualizadas através da expressão de um repórter histoquímica, fosfatase alcalina da placenta humana 10. Esta abordagem permite a visualização não ambígua de morfologias axônio mandril individuais e uma definição de tipos de neurônios somatossensorial com base em critérios morfológicos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="824">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:256px;">Company</td>
			<td style="width:145px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-bromo-4-chloro-indolyl phosphate (BCIP)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11383221001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AM1-43</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>70024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AM4-65</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>70039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benzyl alcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>402834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benzyl benzoate</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>B-6630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:256px;">Zeiss</td>
			<td style="width:145px;">LSM700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cy3-alpha smooth muscle actin antibody</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C6198</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytokeratin-8&#160;</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>TROMA-I-c</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection tools&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td></td>
			<td>scissors and forceps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electric razor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluoromount G</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>17984-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formalin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass dishes</td>
			<td>Pyrex&#160;</td>
			<td></td>
			<td>6 cm and 10 cm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass plates</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td>SE202P-10</td>
			<td>10 cm x 8 cm x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hair remover&#160;</td>
			<td>Nair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horizontal rotating platform&#160;</td>
			<td style="width:256px;">Hoefer</td>
			<td style="width:145px;">PR250 Orbital shaker</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insect pins</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketamine/xylazine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nitroblue tetrazolium (NBT)</td>
			<td>Roche&#160;</td>
			<td>11383213001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oil Red O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Razor Blades</td>
			<td style="width:256px;">VWR</td>
			<td style="width:145px;">55411-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Secondary antibodies&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>Alexa-dye conjugated&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sylgard-184</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9020938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture plastic dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 cm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6- and 12-well&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology

A pele é um tecido altamente heterogêneo. Estruturas intra-dérmica incluem folículos pilosos, músculo eretor de pêlos, especializações epidérmicas (como aglomerados de células de Merkel), glândulas sebáceas, nervos e terminações nervosas e capilares. O arranjo espacial destas estruturas é rigidamente controlado numa escala microscópica - como pode ser visto, por exemplo, no arranjo ordenado de tipos de células dentro de um único folículo de cabelo - e numa escala macroscópica - como pode ser visto pelas orientações quase idênticas de milhares de cabelo folículos dentro de uma região local de pele. A visualização destas estruturas, sem seccionamento fisicamente a pele é possível por causa da geometria 2-dimensional deste órgão. Neste protocolo, que mostram que a pele do rato pode ser dissecado, fixo, permeabilizadas, manchado, e esclareceu como um objeto dimensional dois intactos, uma montagem plana. O protocolo permite a fácil visualização das estruturas da pele na sua totalidade, através de toda a espessura de grandes áreas da pele por optseccionamento iCal e reconstrução. Imagens dessas estruturas também podem ser integrados com a informação sobre a posição e orientação em relação aos eixos do corpo.

Brightfield imagiologia de flatmounts de pele pode ser utilizado para imagem aferentes sensoriais cutâneas (Figura 3A) e 10 padrões de folículos de cabelo com base na pigmentação de melanina (Figura 4). Imagem confocal de flatmounts pele pode ser utilizada para definir a geometria da (1) de agregados de células de Merkel, visualizadas com anticorpos anti-citoqueratina-6 ou com a absorção do corante AM (Figuras 3I-l), (2) os músculos arrector pili, vi...

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Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology

Pele de mamíferos contém um diversificado leque de estruturas - como os folículos capilares e terminações nervosas - que apresentam padrões distintos de organização espacial. Analisando a pele como uma montagem plana aproveita a geometria 2-dimensional deste tecido para produzir de espessura total imagens de alta resolução de estruturas da pele.

Plano Monte imagem de Rato pele e sua aplicação à análise do folículo piloso Padronização e Sensorial Axon Morfologia

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

Múltiplas mouse-Imagem por Ressonância Magnética neuroanatômicos

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Neurociência

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Preparação do tecido e imunocoloração de Fibras nervosas sensoriais que inervam rato da Pele e Ossos Limb

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Monte todo imunomarcação de Neurônios Receptores Olfatórios no<em&gt; Drosophila</em&gt; Antena

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

Todo-mount imagem de embrião de rato Projeções Sensorial Axon

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imagem Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamics nos terminais Cone fotorreceptores Axon do mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Monte todo Dissecção e Imunofluorescência do mouse cóclea Adulto

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings

Gravação combinado de saída Mecanicamente Stimulated aferentes e Nerve Terminal Rotulagem no mouse do folículo piloso Lanceolate Endings

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The ...

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Monitoramento óptico do nervo Viver Terminal Etiquetagem na folículo piloso Lanceolate Endings da<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse pele da orelha

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina

Patch-clamp gravação de células Starburst Amácrinas em um monte de Luxo Preparação de Deafferentated mouse Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic ...