Name: simultaneous long-term recordings at two neuronal processing stages in behaving honeybees
Uploaded: 2014-07-21T15:00:00
Duration: 13 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees at JoVE.com

The authors would like to thank Isabelle Reus for establishment of tracing the electrode insertion side, Tobias Rosenbaum for LabView programming, Anneke Meyer for data analyzes and helpful discussions. We thank Randolf Menzel for discussion and practical help during early stage of electrode development. Furthermore we thank Brian Smith for postdoctoral association to MS-B. This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SPP 1392, Ro1177/5-2) to WR.

1.. Elektrode Building (figur 1) <ol><li> Produktion af en elektrode-adapter, der passer til elektrode-interface bestyrelsen for kommerciel multi kanals forstærker systemer 1,2,25. <ol><li> Brug en lille plexiglas plade limet til et 18 pin stik base. </li><li> Forbind basestationen med 3 korte stykker af isolerede ledninger til 3 separate loddeører skruet på plexiglas plade (Figur 1 A1-A3). </li><li> Indsæt en rille i plexiglas plade, hvor et glas kapillar nemt kan flytte og holdes på plads af en skrue (figur 1 B1). </li><li> Forlæng glaskapillar omkring 5 mm ved hjælp af en minutien stift. </li><li> Fastgør mikro elektrodetrådene langs minutien pin og glaskapillar at garantere stabilisering og støtte. </li></ol></li><li> Multi-kanals mikro wire produktion (adopteret fra Ryuichy Okada 32,33) <ol><li> Span 3 mikro ledninger (polyurethan belagt kobbertråd, 15um diameter) på en sådan måde at de er placeret ved siden af hinanden (fig. 1 B2). </li><li> Brug en 12 V lodning nål til at sprede en tynd film af lavtsmeltende dental voks (50 ° C) delvist langs ledningerne til at lime dem sammen (elektrode spids) (Figur 1 B3). Lad et par centimeter op i sømmene (elektrode slut), da dette afsnit senere vil blive brugt til at forbinde mikro ledninger med elektroden adapter. </li></ol></li><li> Tilslut multi kanals mikro ledning til elektroden adapter <ol><li> Fjern glaskapillar fra holderen, og fastgør den med minutien pin til elektroden spids. Bring det i en position parallel til mikro-elektrode (Figur 1 B3). </li><li> Lim elektrode spids til minutien pin hjælp lavtsmeltende dentalvoks og skære mikro elektrode på spidsen, udstående 2-3 cm fra minutien stift og ved elektroden ende (små pile Figur 1 B3). </li><li> Slip kapillarrøret slightly tilbage ind i elektroden adapter. Brug skruen til at ordne det (Figur 1 B4). </li><li> Lod de løse ender af de tre tråde til loddeører ved hjælp af en lodning pistol med en temperatur på omkring 360 ° C for at sikre smeltning af isolering (figur 1 B4). Efter lodning, sikre, at der er tilstrækkelig elektrisk kontakt (~ 300 kOhm). </li><li> Monter en af ​​elektroderne (master) til elektroden grænsefladen bestyrelsen for hovedtrin og løse andre multikanals elektrode (slave) på en separat adapter. Forbind kanaler slave til master elektrode (figur 1 C1). Derudover lodde referencen samt muskel elektroder til master elektrodebase (figur 1 C2). </li></ol></li></ol> 2.. Bee Fremstilling (figur 2) I disse beskrevne eksperimenterne honningbi (Apis mellifera), som er et hvirvelløse dyrog kræver derfor ikke særlige etiske tilladelser til brug, anvendes. <ol><li> Catch honningbi finsnittere (A. mellifera) på bikuben indgangen i morgen, som vist af andre 34,35. </li><li> Chill bierne på knust is indtil immobilisering (5 til 10 min) og fastsætte en i en standard plexiglas indehaver eller metalrør på en måde, at hovedet er udsat for (Figur 2 A). For at minimere hoved bevægelser bruger lavtsmeltende dentalvoks (~ 50 ° C) og fikseres hovedet forsigtigt til indehaveren omkring basis af de sammensatte øjne og hals. </li><li> Brug lavt smeltende voks til fiksere scapi af antenner på hovedet kapsel (Figur 2 B), uden at røre flagellum. Flagellen af ​​antennen skal bemærkes fremad. Sørg for, at bi frit kan bevæge sine snabel. </li><li> Barbere hovedet kapsel for at sikre en uforstyrret udsigt og adgang til toppen af ​​hovedet. </li><li> Foder bi med en 30% rørsukkeropløsning indtil saturatipå at sikre tilstrækkelig befugtning af hjernevæv og god levedygtighed af dyret (figur 2 C). </li><li> Foretag omhyggelige indsnit lodret langs grænserne for sammensatte øjne og vandret over de antennal baser samt under ocelli og fjern det løsnede stykke neglebånd (figur 2 D). </li><li> Læg forsigtigt bort hypopharyngeal kirtler og fjerne luftrøret for at sikre et klart overblik og adgang til hjernen forud for indføring af elektroder (figur 2E, 2F). </li></ol> 3.. Indføring af elektroder I eksemplet tilfælde illustreret i figur 2 er en elektrode placeret sigte på l-ALT, den anden sigte på m-ALT 2. Ved hjælp af særlige vartegn, er andre målområder muligt så godt, for eksempel AL og MB output region 1. <ol><li> Placer elektroderne hjælp mikromanipulatorer på området af interesse ( <strong&gt; Figur 2G og 3A). At målrette m-ALT sted elektroden mellem AL og medialt fra lodret lap af MB. Sørg insertionsstedet værende over den afgreningspunkt af mediolateral ALT PNS. Rager elektroden i hjernen med en dybde på omkring 180 um (figur 2E). For L-ALT PN indspilning sted elektroden under den laterale protocerebrum (LH) i midten af ​​en imaginær linie mellem den laterale side af lodrette lap og midten af ​​AL. Sæt elektrode med en dybde på omkring 300 um (Figur 2E) </li><li> Indsæt reference (sølvtråd, omkring 25 um diameter) ind i den ipsilaterale sammensatte øjet gennem et lille snit i hårstrået. Indsæt en anden sølvtråd ind i musklen projektion region under den laterale ocelli. BEMÆRK: Hvis det er nødvendigt kan overvåges lære opførsel af bi med høj tidslig præcision ved at optage musklen M17, som er involveret in snabel forlængelse respons (PER) af bi 36, som beskrevet i 25.. </li><li> Til solidt forankre elektroderne i hjernen og hovedet kapsel, dække hele rummet over hjernen med tokomponent silicium (figur 2H), hvilket vil forhindre hjernen tørrer ud. BEMÆRK: optagelserne kan vare i flere timer op til dage, og bierne kan for eksempel konstateret i en klassisk konditionering procedure (figur 2H) eller stimuleret med et stort panel af forskellige lugte. </li></ol> 4.. Dataopsamling og forbehandling <ol><li> Brug korrekt erhvervelse software, der opfylder følgende krav: samplingfrekvens på min 25 kHz; analog 1,25 eller digital 2 kryds differentiering mellem elektrode-kanaler; band pass filter fra 300 Hz til 8000 Hz til at udvinde spike begivenheder. </li><li> Brug tilgængelig spike sortering software til at udtrække enkelt enhed aktivitet, for eksempel templspiste matchende teknikker, som indgår i Spike2 software (Figur 3). </li><li> For yderligere analyse bruger tidsstempler af de udtrukne enheder til at beregne enkelt enhed i gennemsnit lugt reaktioner (figur 4), eller til at beregne befolkningsgrupper vektorer til Principal Component Analysis (PCA) (figur 5) ved hjælp af kommercielt tilgængelige software. For yderligere at analysere en enkelt enhed og befolkning svar latency du sammenligner de seneste publikationer 1,2,25. </li></ol> 5.. Visualisering af relativ Elektrode position (figur 4) <ol><li> Dyp elektroderne tips i en opløsning af enten 5% Alexa hydrazid 568 eller 5% Alexa hydrazid 488, som opløses i 0,5 M kaliumchloridopløsning før optagelsen eksperimenter. </li><li> Fjern elektroderne og dækker silicium omhyggeligt efter forsøgene, skylles hjernen med bi Ringer-opløsning, fjerne kirtler og luftrøret og indsætte små krystaller af tetramethylrhodamin dextran eller indsætte en 5% opløsning løst i 1,0 M kaliumacetat i AL at mærke de ALT&#39;er anterogradely. Udfør følgende trin i mørke. </li><li> Lad farvestoffet tages op og transporteres af projektionsskærme neuroner langs deres axonale skrifter (30-45 min) (fig. 4A) før vask hjernen med bi Ringer-opløsning tre gange for en anden 30-45 min. </li><li> Chill bien på is indtil immobilisering og fjern forsigtigt hjernen fra hovedet kapsel. Fiksere hjernen ved at skylle den i en 0,1 M PBS-opløsning indeholdende 4% formaldehyd og holde det natten over ved 4 ° C. </li><li> Vent mindst 12 timer før vask hjernen to gange i 0,1 M PBS (10 minutter hver). </li><li> Vask hjernen 3x i 20 minutter i 0,2% Triton X-100 fortyndet i 0,1 M PBS før dehydratisering det i en stigende serie af alkohol (30%, 50%, 70%, 90%, 95%, 3x 100% ethanol, 20 min hvert trin). </li><li> Integrer dehydreret hjernen i methylsalicylat på et objektglas og seal det med en dækning dias. </li><li> Brug en konfokal laser scanning mikroskop og scanne hjernen som optiske sektioner hver 2-5 um ved hjælp af en Harmonisk Compound Plan Apochromat målsætning (10X 0.4 NA fordybelse). Excite vævet med 568 nm bølgelængde for tetramethylrhodamin dextran og en bølgelængde på 488 nm for elektroden position. </li><li> Rekonstruere de farvede hjernens strukturer og elektrode stier fra billedstakke i 3D med genopbygning software (f.eks. AMIRA eller Fiji) (Figur 4). </li></ol>

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Denne artikel viser produktion og anvendelse af special designet multi kanals mikro wire-elektroder. De beskrevne elektroder er velegnet til optagelse både enkelt enhed og befolkning aktivitet, som er specielt velegnet til latency målinger og andre tidsmæssige respons egenskaber af forskellige neuroner og forskellige neuropils inden for et enkelt eksemplar (for detaljer se 1,2,25). Derudover har vi vist, hvordan man permanent gennemføre de mikro trådelektroder at give stabile langsigtede optagelser i opfører honningbier, der holder i timer op til dage. Ekstracellulære multi-unit optagelser blev et gunstigt middel til at opnå høj tidsmæssig opløsning kombineret med geografisk information. I vores tilfælde er disse enten parallelle neuronale skrifter 2 eller to forskellige neuropils 1. Flere neuroner kan registreres og analyseres på enkelt neuron niveau parallelt og i høj tidslig opløsning. Multi-enhed rekordheder blev først anvendt i pattedyr 38 og senere også i insekter 39-41. Betydelige fremskridt blev opnået med udvikling og forbedring af ekstracellulære multi-kanal optagelse teknikker 42,43. Dette, for eksempel, omfatter udvikling af nye elektroder 44 eller nye spike sortering og klyngedannelse algoritmer 45. Almindelige metoder til ekstracellulære multi-unit optagelse teknikker er velbeskrevne 46-48. De selvstændige bygget elektroderne vist i denne video derudover kan tilpasses ved at tilføje flere microwires pr elektroden eller mikro ledninger kan vrides for at opnå målbare konstante afstande mellem spidserne. Begge procedurer vil dog føre til mindre fleksibilitet og øget tykkelse af elektroden. I forhold til silicium sonder, der almindeligvis anvendes til ekstracellulære optagelser i meget større insekter som den høg møl, johannesbrødkernemel og kakerlak 40,49 - </sup&gt; 51 de beskrevne mikroorganismer wire elektroder er mindre fleksibel og kan klare let med potentielle hjerne bevægelser og dermed pålideligt kan anvendes i små sociale insekter som bier og myrer, der viser en meget bredere adfærdsrepertoire. De fleste silikone sonder har skarpe skaft lignende strukturer skære axoner og neuralt væv langs deres indsættelse kanal, mens de beskrevne mikro ledninger er runde, fleksibel og mindre og er derfor mindre skadelige for det omgivende væv, hvilket er en klar fordel, hvis målet er at studere lang sigt plasticitet i en intakt og opfører dyr. En anden fordel af mikro trådelektroder er deres lave produktionsomkostninger og nem håndtering. I stedet for omhyggeligt at rense et dyrt silikone sonde elektrodetrådene er frisk skåret før hjernen isætning og mangler derfor problemer med overbelastning. Det er endvidere muligt at anvende mere end én mikro wire elektrode i samme præparat enten indsat i forskellige neuropiles 1 or skrifter 2 som vi viser her. Denne fremgangsmåde er særligt gunstige at analysere og sammenligne tidsmæssige aspekter som respons latenstider og interaktioner på forskellige neurale behandling niveauer. Vi er klar over, at et ekstracellulært optagede signal ikke afspejler enkelt celle aktivitet per se. Det er altid en forbindelse spænding aktivitet omkring elektroden spids. At lokalisere kilden til signalet forskellen mellem to tilstødende mikro wire kanaler inden en elektrode er altid beregnet. Således kilden til spike signaler, der anvendes til at udvinde enkelt enhed aktivitet var altid meget tæt på enten den ene eller den anden elektrode kanal resulterer i let at skelne spike kurver. Signaler fra længere væk, ligesom muskel aktivitet eller aktivitet af tilstødende neuropils, nå begge elektroder på samme tid fremmane sammenlignelige former og amplituder og vil blive kasseret ved denne procedure. Ved hjælp af skabelonen matching teknik Spike2,Vi er meget overbeviste om at opnå enkelt enhed aktivitet, hvilket ikke er det samme, men meget tæt på enkelt neuron aktivitet. Dog kunne spørgsmålet om spike sortering undgås ved hjælp af intracellulære optagelse teknikker. Encellede optagelser med enten skarpe elektroder eller patch pipetter tillader tilbundsgående viden om fysiologiske egenskaber for en enkelt neuron. Men på grund af den lille størrelse af insekt neuroner og deres neurites (f.eks. Mindre end 1 um for honningbi PNS 52) kun kortsigtede optagelser er håndterbare. Desuden kan intra cellulære optagelser være invasiv og kan skade den celle, der er muligvis en anden årsag til de tidsmæssige begrænsninger. In vivo intracellulære optagelser i insekter sjældent overleve en time. Et tidsvindue der var tilstrækkeligt for pionerarbejde Martin Hammer 53, der har indspillet intracellulære fra et enkelt identificeret neuron, den ventrale uparrede maxilar neuron # 1 (VUMmx1). Han kunne lblæk dens aktivitet direkte til belønning vej. Juliane Mauelshagen 54 registrerede intracellulært aktiviteten af et identificeret champignon krop extrinsic neuron, den pedunculus ydre neuron # 1 (PE1) under klassisk condition. Det samme neuron var i fokus i Menzel og Manz 55 når de fandt LTP efter elektrisk stimulering af Kenyon Cells. Okada og kolleger 56 kunne imidlertid bruge intracellulært velkarakteriserede spiking mønster (dobbelt og tredobbelt pigge) til identifikation af PE1 under ekstracellulære optagelser. Efter alle en kombination af begge metoder, kan intracellulære optagelser fra identificerede neuroner og ekstracellulære langsigtede optagelser være et effektivt redskab til fremtidige undersøgelser. Men ved hjælp af skarpe elektroder til at optage flere celler (enheder) samtidigt ved forskellige forarbejdningsmetoder niveauer over mange timer op til dage at analysere deres timelige respons forholdet og / eller endda plastik ændringer, jegs næsten umuligt. Med den første calcium imaging tilgange i honningbien 57,58 hjælp calcium-følsomme farvestoffer analyse af rumlige mønstre af lugt svar var tilgængelige 59-62. Men i mange tilfælde calciumsensitiv farvestoffer skal blive introduceret til hjernevæv via invasive manipulationer, der igen begrænser biens levetid og iboende egenskaber de analyserede celler. Dette problem er overvundet i andre modelorganismer som bananflue med genetisk indført calcium sensorer 63,64. Men generelt kan calcium sensorer indføre andre begrænsninger, som de kan virke som calcium buffere, der sandsynligvis påvirker den tidsmæssige egenskaber lugt svar. Samtidige intracellulære optagelser kombineret med calcium imaging eller beregningsmæssige metoder kan bevise den rette tidsmæssige opløsning af billeddiagnostik 65,66. Men den tidsmæssige opløsning af den billeddannende proces i sig selv er rather begrænset. Optiske indkøbssystemer normalt bruger CCD-billeddannelse med en tidsmæssig opløsning på 5-20 Hz 67, selv om 2-Photon-Imaging kan være i stand til at erhverve hurtigere sekvenser 68. Men stigende samplingfrekvens altid går sammen med et tab i rumlig opløsning. Endvidere calcium-følsomme farvestoffer, der anvendes i honningbi undergår blegning, hvilket også reducerer akkvisitionstid 69. Sammenlignet med andre fysiologiske optagelse teknikker i insekter vores fleksible multi-kanal mikro-wire-elektroder sikrer lang tid adgang til én enhed og befolkning neuronal aktivitet i opfører bier. Vi viste, hvordan at bruge to af disse elektroder på forskellige stadier behandling i det samme dyr, hvilket letter analysen af ​​tidsmæssige kodning aspekter mellem de forskellige optagelse steder. Afhængig af problemstilling og modellen insekt den grundlæggende metode til elektrode bygning demonstreret her er nemt udvidei stand til og / eller kan tilpasses. For eksempel er det tænkeligt at anvende mere end tre enkelte ledninger til at producere multi-kanal elektroder. Desuden kan antallet af optagelse steder forlænges og observere tidsmæssige aspekter af mere end to skrifter eller neuropils er muligt. Vores håb er, at denne metode vil inspirere mange forskere og vil bidrage positivt til forståelsen af ​​sofistikerede neuronal bearbejdning i små hjerner.

Honningbier såvel som de fleste andre insekter er stærkt afhængige af lugtesansen. Blandt andet bruger de olfaktoriske tidskoder til orientering, parring, kommunikation med artsfæller, og fouragering. Deres godt udarbejdet olfaktoriske system bidrager til et rigt repertoire af læring adfærd i tilknytning til blomstermotiver lugt stimuli. Disse adfærdsmønstre kan nemt studeres under kontrollerede laboratorieforhold (til gennemgang se 3 - 5). Deres &quot;mini hjerner&quot; (sml. 6) med deres relativt lille antal neuroner gør honningbien en velegnet model organisme for at studere olfaktoriske kodning og læring under overvågning af neurale aktivitet. Den olfaktoriske system i insekter samt i pattedyr viser analog organisation i stor udstrækning (for en oversigt, se 7,8). I honningbier omkring 80.000 receptor neuroner 9 beliggende i sensillae langs antenner 10,11 oversætte den miljømæssige lugt stimulus i en NEUROnal signal. Axoner fra olfaktoriske receptor neuroner innerverer antennal lap (AL), som har en glomerulær organisation sammenlignes med hvirveldyr lugtekolben. Den AL består af omkring 164 glomeruli sammenkoblet med hinanden ved omkring 4.000 lokale interneuroner (LN) (for en oversigt, se 12). Især i honningbi det blevet vist for nylig, at LN giver pletvis lateral tilslutning og at forskellige subpopulationer besidder grundstoffer og configural olfaktoriske kodende egenskaber 13,14. AL blev vist til at blive opdelt i en ventral og en dorsal hemi lap giver anledning til den mediale og den laterale antennal lap tarmkanalen (m-og l-ALT, tidligere betegnet m-og L-APT for medial-og lateral antennal lap protocerebral tarmkanalen 15-17). Her er en ny tarmkanalen terminologi indført ved en nylig indsats for en fælles nomenklatur for insekt hjerne vil blive brugt 18 år. Begge ALT&#39;er (L-og M-ALT) kombinere enten 410 (l-ALT) eller 510 (m-ALT) uniglomerular ProjeIndsatsen neuroner (PN), henholdsvis 15,16,19. PNS begge skrifter er for nylig blevet vist at kode lugte parallelt 2 (for en gennemgang se 17,20), og begge skrifter synaptisk danne divergerende forbindelser med Kenyon celler (KC), svampe krop (MB) primære neuroner. Hver MB indeholder omkring 172.000 KCS 21 - 23. MBS er kendt for at være involveret i stimulus integration, læring og hukommelse dannelse. De AXO dendritter af KCS danne Skaftet (svampens stilk), som har to primære output regioner: den Vertica eller alfa-lap og den vandrette eller beta-lap 22,24. Udgangen af MB konvergerer mod kun omkring 400 ydre neuroner (EN) 24. Ens ansvarlig for olfaktoriske informationsbehandling meste innerverer den ventrale aspekt af den lodrette lap 22. For nylig er det blevet påvist, at EN&#39;erne optaget på dette område indkode lugt belønning forening 25. Temporal sompects inden for det olfaktoriske system af insekter samt hvirveldyr er blevet et vigtigt og væsentligt aspekt som en potentiel kodning princip 26 - 29. At være i stand til samtidigt at optage flere neuroner fra forskellige steder med høj tidslig opløsning, vi etableret dobbelt multi enhed optagelse teknikker hjælp Customized multikanal trådelektroder introduceret til forskellige målgrupper regioner i biens olfaktoriske system. Denne tilgang gør det muligt for os at analysere og sammenligne tidsmæssig forarbejdning i honningbien olfaktoriske system på niveauet af enkelte neuroner og populationer af neuroner enten mellem parallelle olfaktoriske veje, den dobbelte olfaktoriske vej 2 eller mellem forskellige efterfølgende neuropils 1. For nylig med en tilsvarende eksperimentel tilgang i Græshoppen olfaktoriske system 30 ved hjælp af en anden konfiguration af elektroder var i stand til at analysere Spatiotemporal kodning mekanisme til background-invariant lugt anerkendelse 31. Thos, skal du aktivere de etablerede dobbelte optagelser indsamling geografisk information om samtidige neuronal aktivitet profiler. I forhold til den bredere rumlige prøvetagning fås fra calcium imaging denne metode giver mulighed for optagelse fra kun to pletter. Men den fordel i forhold til calcium imaging teknikker er høj tidslig præcision af action potentielle optagelser, som ikke kan leveres af enten konventionel CCD imaging eller 2-foton imaging erhvervelse. De ekstracellulære elektroder beskrevet her er permanent implanteret og fastgjort i forhold til hjernen og hovedet kapsel undgå elektrode afdrift. Dette er en klar fordel i forhold til brugen af ​​skarpe intracellulære elektroder. En anden fordel i forhold til intracellulære optagelser og calcium billeddannelse er den udvidede neurale observationstid spænder fra mange timer til dage. Dette er en vigtig forudsætning for at undersøge neurale korrelater for indlæring og hukommelse dannelse. Yderligere fordele ved multiunit optagelser er yderligere skitseret i diskussionen afsnit. I denne metodiske overblik fremstillingssektoren for brugerdefineret design trådelektroder vil blive vist, tilpasset fra 32,33 og velegnet til langsigtede multi unit optagelser i honningbien hjernen. Derudover et eksempel hvordan disse typer af elektroder er permanent implanteret på to forskellige kontrolapparater sites inden honningbien olfaktoriske system til at registrere samtidigt L-og m-ALT over lange perioder af tid til at tillade mange stimulationsregimer er vist 2. Til verifikation af optagelsen positioner et eksempel og protokol til farvning og post-optagelse visualisering af optagelsen sites er forudsat.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Paraffin oil</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>76235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odors</td>
			<td>Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Formaldehyde</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Methanol free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X</td>
			<td>BioChemica</td>
			<td>A1388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylsalicylate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4529.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamin dextran, 10,000 MW (Microruby)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D7162</td>
			<td>keep dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488 hydrazide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-10436</td>
			<td>keep dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 568 hydrazide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-10437</td>
			<td>keep dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bee Ringer Solution</td>
			<td>see 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyurethane-coated copper wire</td>
			<td>Elektrisola</td>
			<td>15&#181;m diameter &#38; P155 insulation</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Wax&#160;</td>
			<td>Densply Detrey</td>
			<td>64103015S1</td>
			<td>moderate melting point</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Wax</td>
			<td>Flexaponal&#160;</td>
			<td>124-202-00</td>
			<td>low-melting Wax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KWIK SIl</td>
			<td>WPI</td>
			<td>03L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 Pin Socket</td>
			<td>Conrad Electronic</td>
			<td>189634-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot melting glue</td>
			<td>Conrad Electronic</td>
			<td>827673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>soldering needle</td>
			<td>Conrad Electronics</td>
			<td>830283</td>
			<td>12 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering terminal lug&#160;</td>
			<td>Conrad Electronic</td>
			<td>531901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glaselectrodes</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B100F-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-20</td>
			<td>V2A 0.2 x 12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>switchable headstage</td>
			<td>Tucer Davis Technologies</td>
			<td>SH16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headstage connection module</td>
			<td>NPI</td>
			<td>INT-03M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier Module</td>
			<td>NPI</td>
			<td>PDA-2F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquisition boards</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI-6123, Ni-6143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition Software</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>Lab View 8.2</td>
			<td>custom design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spike-Sorting&#160;</td>
			<td>CED&#160;</td>
			<td>Spike 2 v7.11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>R2008B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Leitz</td>
			<td></td>
			<td>manual</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AG-wires</td>
			<td>WPI</td>
			<td>AGT05100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP2 AOBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMIRA</td>
			<td>Mercury Computer Systems&#160;</td>
			<td>2/5/2000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous long-term recordings at two neuronal processing stages in behaving honeybees

I begge pattedyr og insekter neuronal oplysningerne behandles i forskellige højere og lavere orden centre i hjernen. Disse centre er koblet via konvergerende og divergerende anatomiske forbindelser, herunder til foder frem og feedback ledninger. Desuden er oplysningerne af samme oprindelse delvist sendes via parallelle veje til forskellige og undertiden i de samme områder i hjernen. For at forstå de evolutionære fordele samt de beregningsmæssige fordele af disse ledninger strategier og især deres timelige afhængigheder på hinanden, er det nødvendigt at have samtidig adgang til enkelte neuroner i forskellige skrifter eller neuropiles i samme forberedelse med høj tidsmæssig opløsning. Her koncentrerer vi på honningbier ved at demonstrere en unik ekstracellulært langsigtet adgang til at optage flere enheds aktivitet ved to efterfølgende neuropiles 1, den antennal lap (AL), den første olfaktoriske forarbejdningstrin og champignon krop (MB), en højere orden integration center INVOlved i indlæring og hukommelse dannelse, eller to parallelle neuronale skrifter 2 sammenhængende AL med MB. Sidstnævnte blev valgt som et eksempel og vil blive beskrevet fuldt ud. I den bærende video konstruktion og permanent indføring af fleksible multi kanal trådelektroder demonstreres. Parvis differentialforstærkning de mikroorganismer trådelektrode kanaler drastisk reducerer støj og kontrollerer, at signalkilden er tæt knyttet til positionen af ​​elektrodespidsen. Den mekaniske fleksibilitet af de anvendte trådelektroder giver stabile invasive langsigtede optagelser over mange timer til dage, hvilket er en klar fordel i forhold til konventionelle ekstra og intracellulære in vivo optagelse teknikker.

&quot;Den nuværende protokol tillader samtidige optagelser på to forskellige forarbejdningstrin inden for de enkelte honningbier og derudover gør det muligt at teste underliggende mekanismer for indlæring og hukommelse via f.eks., PER konditionering inden tilbageholdende honningbier.&quot; Dette er en forudsætning for analyse af tidsmæssige aspekter af neuronal forarbejdning. Metoden er let at tilpasse til forskellige videnskabelige tilgange til at optrævle den neuronale netværk af biens olfaktoriske system. For eksempel denne metode anvendes (i) til at analysere tidsmæssig behandling af PNS i dobbelt olfaktoriske pathway af honningbi, l-og m-ALT PNS (figur 5). I figur 5A er givet et eksempel på en l-ALT PN samtidig registreres med en PN af m-ALT som ti forsøg gennemsnit og illustrerer deres reaktion styrke og latenstid med hensyn til fem forskellige lugtkoncentrationer som farvekodet varme plot. I gennemsnitligt syv bier med 11 l-og 13 mALT PNS (figur 5B, 5C) illustrerer, at både reaktion styrke såvel som svar latenstid, til en vis grad afspejler lugtstof koncentration. Derved PNS i dette eksempel øge deres svar styrke, mens med stigende lugtstof koncentration deres svar latenstid faldet (figur 5B, 5C). Dette resultat er temmelig begrænset og gælder kun for den analyserede lugtstof, men er stadig i overensstemmelse med de seneste beregningsmæssige modeller af AL 37. Hvorvidt lugt koncentration kodning i biens AL ligger bag ikke-lineære beregninger eller ligger til grund for andre kodning egenskaber stadig behov for at blive analyseret i fremtiden. Desuden kan bruges metoden (ii) at sammenligne tidsmæssige aspekter i befolkningen aktivitet ved to efterfølgende forarbejdningstrin, Al-og MB-output (figur 6). Principal komponent analyse (PCA) illustrerer, at lugt beregning er forlænget og overleve hele lugt præsentation på PN niveau hvorimod i ENr kun lugt og slukker sæt var repræsenteret i populationen aktivitet (figur 6). Dermed EN befolkning nåede deres maksimale aktivitet allerede på et tidspunkt, hvor PN aktiviteten er stadig under udvikling (sml. Movie 1). <img alt="Figur 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig1highres.jpg" width="400" /> .. Figur 1. Fremstillingsvirksomhed tre-kanals mikro-wire-elektroder A1) endelser tre ledninger er loddet til en IC pin stik i positioner 11, 13 og 16 A2) Fire loddeører skrues på en plexiglas plastik bundpladen.; en minutien stift indsættes i spidsen af en glaskapillær, som derefter fastgøres til plastpladen. A3) Plastpladen er limet oven på en IC-polet stik, og den frie ende af hver ledning er loddet til en af de øverste lodning kabelsko. &lt;strong&gt; B1) At udstyre elektrode holder med de fine kobbertråde, kapillarrøret skal tages ud igen. B2) Bunden af holderen er så fikseret i et skræddersyet tilpasse enheden. Tre kobber mikro ledninger er rettet ind langs rillen og fastgøres med tape i hver ende B3) De parallelle mikro tråde er limet sammen med dentalvoks og kapillarrøret er sat tilbage på plads (lange pile).; limede mikro ledninger er så knyttet til kapillarrøret med dentalvoks og dens enderne skæres af (korte pile). B4) De tre løse ender af kobbertråde er loddet til de tre øverste loddeører dermed bringe dem i elektrisk kontakt med IC bens stik. C1) To færdigsamlede elektroder kan forbindes med hinanden til brug med en enkelt hovedtrin. C2) Til dette formål stifter af en elektrode (venstre, slave) er forbundet via isolerede ledninger til den anden elektrode (højre, mastis), som er forbundet til hovedet fase; hovedtrin tilsluttet elektrode kan også indsamle input fra en muskel (M17) og reference elektrode (Ref). <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig2highres.jpg" width="500" /> Figur 2. Fremstilling og permanent elektrode indsættelse i bi hjernen. A) En bi indsættes i en plexiglas holderen efter immobilisering på is. Antenner med Svoben (FL) og Scapus (SC) er angivet. B) Hovedet og antenner er fastsat ved hjælp af dental voks. C) Hovedet kapsel er barberet og bien er fodret med sukker vand. D) Hovedet kapsel åbnes. E) Efter at have fjernet kirtler og luftrør fra toppen af hjernen, der nemt kan skelnes de forskellige neuropiles og store vartegn. Banerne af ALT&#39;er er angivet sammen medet varemærke, hvor elektroderne er indsat. (MB: Mushroom krop, AL: Antennal lap, OL: Optisk lap, α: Alpha lap eller lodret lap, ALT: antennal lap-tarmkanalen, E1: elektrode indsættelse side til m-ALT-optagelser, E2: elektrode indsættelse side til l-ALT optagelser). F) Reference (Ref) og muskel elektroder (M17) er indsat i hoved kapslen gennem små huller i kutikula eller forbindelsen øjet. G) De trådelektroder indsættes i hjernen på de relevante steder. H) Efter fastsættelse af elektroderne på plads ved hjælp af to-komponent silicium, bien viser stadig PER og kan være betinget (f.eks., ved hjælp af sukker vand). <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig3highres.jpg" width="500" /> Figur 3.. Ekstracellulært optagelse på to neurale skrifter og enkelt enhed ekstraktion (spike sortering). A </strong&gt;) Skematisk tegning af forsøgsopstillingen. Bien er fikseret i en plexiglas holder. Lugt stimulation leveres via et glasrør. To elektrode skafter optager fra den eksponerede bi hjernen. B) Samtidige optagelser fra L-og M-ALT PNS (grøn og lilla spor), der viser excitatoriske reaktioner på begge skrifter til en 500 msek lugt stimulering af honning i vand ved en koncentration 1:100 ved 33 ° C. Hver plottet linie repræsenterer de differentierede kanaler som farvekodede etiket fra elektroden loddeører i A. Bar:. 50 μV C) Efter spike sortering procedurer enkelt handling potentialer sorteres og farvekodet. Overlejring af de sorterede enheder illustrerer adskillelsen af bølgeformer. D) Spike interval Histogrammet viser adskillelsen kvaliteten af de sorterede enheder beviser på tilstrækkelig spike sortering. Bemærk der er ingen spike indenfor enhedens refraktær periode. E) To visninger (E1, E2) fraet 3D-gruppering af det sorterede enhed med principal komponent analyse, som angiver afstanden for de sorterede enheder til hinanden. Cirkler angiver 2,5 gange Mahalanobis afstand, som ligner SD i rummet og indikerer en betydelig differentiering af klynger i hovedbestanddelen plads F) Farvekodede enheder skildrer virkningspotentialer synlige i en forstørrelse på tre kanaler fra et tarmkanalen optagelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51750/51750fig3highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig4highres.jpg" width="500" /> Figur 4.. Post-optagelse visualisering og 3D-rekonstruktion af optagelsen position. A) Fremskrivning udsigt Ortho-skiver langs z-akser med maksimal intensitet tilpasning af en anteroog retrograd opfyldning af de uniglomerular projektion neuroner rager ud fra AL til MB og LH. Den intracellulære sporstof Microruby (tetramethylrhodamin dextran) blev indsat i AL når optagelsen eksperimenter. Farvede glomeruli inde i AL bevis ordentlig PN farvning. B) Projektion visning af ortho skiver langs z-akser med maksimal intensitet justering fra en farvning af de to elektroder med Alexa hydrazide 488 indikerer elektrodeplacering for m-ALT (E1, pil ) og l-ALT (E2, pil). Sporstof Alexa Hydrazide 488 migrerer til elektroden omgivende væv og pletter elektroden insertionsstedet. Bemærk, den fremtrædende farvning i AL er en overfladisk artefakt. C) 3D rekonstruktioner af de farvede målceller (PNS) og elektroden insertionssted fra A, B (højre side) sammen med en skematisk oversigt over honningbien olfaktoriske system (venstre side) med angivelse af L-og M-ALT-baner. Bemærk, kun uniglomerular PN skrifter vises. AN: antennal nerve, AL: antennal lap, LH: lateral horn, MB: champignon krop, E1, E2: elektrode indsættelse sites, m-ALT: mediale antennal lap tarmkanalen, L-ALT: lateral antennal lap tarmkanalen, c: caudale, r: rostral, m: mediale, l:. lateral <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51750/51750fig4highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 5" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig5highres.jpg" width="300" /> Fig. 5. Eksempel på lugt koncentration kodning i dobbelt olfaktoriske pathway. A) Heat plots illustrerer reaktionen fra en indre l-ALT (grøn) og en enkelt m-ALT PN (lilla) erhvervet samtidigt fra en individuel honningbi reaktion på lugtstof hexanal på at øge lugtkoncentrationer (fra 1: 10 -6 til 1:100). Hver linje er et gennemsnit på ti forsøg STIMfolkning. Fyringsgraden er vist som relativ intensitet ændring, som er skudhastighed i forhold til det subtraherede spontane aktivitet. B) Population respons latenstid på 11 l-og 13 m-ALT PNS fra 7 optaget bier. I hvert bi PNS fra begge skrifter blev registreret samtidigt. Befolkningen svar latenstid viser en faldende ventetid med stigende lugt koncentration i PNS fra begge skrifter. Lugten reaktion debut på antennerne på 99 msek blev registreret via electroantennograms og trækkes fra PN respons ventetid. Bemærk, at ved de laveste koncentrationer svarene er for svagt til latency målinger, og derfor blev udelukket. C) Befolkning svar fyring sats fra samme PNS som i B. Med stigende lugt koncentration svaret styrken er stigende. L-ALT viser en stærkere reaktion styrke. I B, C middelværdien og SD givet. <img alt="Figur 6" fo:content-width = &quot;5in&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51750/51750fig6highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figur 6.. Sammenligning befolkning aktivitet ved to efterfølgende forarbejdningstrin langs honningbien olfaktoriske vej. Data blev registreret i 20 dyr, der blev stimuleret med 1-hexanol og 2-octanon. A) Hver linje repræsenterer den falske farvekodede gennemsnitlig fyring sats på en fremskrivning neuron (PN) beregnet på tværs af 10 lugt gentagelser af 1-hexanol. Lugt præsentation starter til tiden 0 og varede i tre sekunder. B) viser det samme som i A), men for champignon krop ydre neuroner (EN). Kan ses vist i en matrix) som et PN befolkning vektor under lugt stimulering med 1-hexanol. Vi beregnede den samme slags befolkning vektor under lugt stimulation med 2-octanon og brugt både vektorer i en principal komponent analyse (PCA) holde den tidsmæssige dimension. C) De første tre hovedkomponenter (PC1, 2 og 3) varplottet mod hinanden for at illustrere lugt separation i PN ensemble aktivitet på antennal lap output. Tiden før lugt debut er markeret med sort. Aktivitet i tre sekunder af stimulering med 1-hexanol er vist i blåt. Aktiviteten under stimulation med 2-octanol er vist med rødt. Desuden viser vi 1,5 sekunder (post) af aktiviteten efter lugt af sæt 1-hexanol (lyseblå) og 2-octanonen (lyserød). Bemærk, at på PN ensemble niveau begge lugte fremmane meget forskellige baner bosætte sig i et &quot;fast punkt&quot;, som outlasts hele lugt stimulation periode. Først efter lugt opveje de baner flytte tilbage til baseline aktivitet uden lugt stimulation. D) Den samme analyse blev udført på EN ensemble niveau repræsenterer aktivitet på champignon krop output. Sammenlignet med PN aktivitet lugte fremkalde en mindre tydelig bane. Desuden en &quot;fast punkt&quot; ikke observerbare. Den oprindeligt lugt inducerede baner intermingle med baseline aktivitet selvom lugt er stadig til stede. Kun lugt offset fremkaldte en ekstra bane. <a href="/files/ftp_upload/51750/Movie_R3_Brill_et_al._JoVE.avi" target="_blank">. Movie 1</a> Time løst evaluering af en lugt induceret bane efter principal komponent analyse af en PN-population vektor (til venstre) og en en befolkning vektor. (højre. Figur 6 cp) De øvre dele omfatter første tre hovedkomponenter (PC1, 2 og 3) plottet mod hinanden. De nederste paneler viser evalueringen af ​​PC1, 2 og 3 over tid. Lugt stimulation er præget af den grå bar. Alle paneler blev synkroniseret. Bemærk, at EN befolkning aktiviteten starter lidt før PN befolkning aktivitet, kan et fænomen, der synes at være contraintuitive men forklares ved tilslutning og egenskaberne af de involverede lag, som er diskuteret tidligere 1.

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees at JoVE.com

Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

Samtidige Langsigtede optagelser To Neuronal Processing Stadier i Behaving Honningbier

Samtidige ekstracellulære langsigtede optagelser fra to forskellige hjerne neuropiles eller to forskellige anatomiske skrifter blev etableret i honningbier. Disse optagelser tillader undersøgelse af tidsmæssige aspekter af neuronal behandling på tværs af forskellige områder i hjernen på enkelt neuron samt på ensemblet niveau i en opfører dyr.

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dobbelte Elektrofysiologiske Optagelser af synaptisk-evoked astrogliale og Neuronal respons i Akut hippocampusskiver

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

En Molekylær Udlæsning af Langsigtet olfaktorisk Adaptation in<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

A Procedure til implantering Organized Arrays af Microwires for Single-unit optagelser i Vågn op, fungerende dyr

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Agarose Microchambers for Langsigtet Calcium Imaging af<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Samtidige<em&gt; Ex vivo</em&gt; Functional Test af to nethinder af<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogrammet System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

To-foton Calcium Imaging i Neuronal dendritter i hjernen skiver

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Optogenetic medrivning af hippocampus Theta svingninger i opfører sig mus

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Long-term Sensory Conflict in Freely Behaving Mice

Langsigtet sensoriske konflikt i frit opfører mus

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for ...