Name: simultaneous long-term recordings at two neuronal processing stages in behaving honeybees
Uploaded: 2014-07-21T15:00:00
Duration: 13 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees at JoVE.com

The authors would like to thank Isabelle Reus for establishment of tracing the electrode insertion side, Tobias Rosenbaum for LabView programming, Anneke Meyer for data analyzes and helpful discussions. We thank Randolf Menzel for discussion and practical help during early stage of electrode development. Furthermore we thank Brian Smith for postdoctoral association to MS-B. This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SPP 1392, Ro1177/5-2) to WR.

En. Elektrode Building (Figur 1) <ol><li> Produksjon av en elektrode adapter som passer elektroden grensesnittet styret i kommersielle flerkanals forsterker systemer 1,2,25. <ol><li> Bruk en liten pleksiglass plate limt til en 18-pinners kontakt basen. </li><li> Koble basen med tre korte stykker av isolert ledning til tre separate lödlänkar skrudd på pleksiglass plate (figur 1 A1-A3). </li><li> Sett et spor inn i pleksiglassplate hvor en glass kapillær lett kan bevege seg og bli holdt på plass av en skrue (fig. 1 B1). </li><li> Forlenge glass kapillær om 5 mm ved hjelp av en minutien pin. </li><li> Fest mikroelektrodetråder langs minutien pin og glass capillary å garantere stabilisering og støtte. </li></ol></li><li> Multi-kanals micro wire produksjon (adoptert fra Ryuichy Okada 32,33) <ol><li> Span 3 mikro ledninger (polyuretan belagt kobbertråd, 15mikrometer diameter) på en slik måte at de er plassert ved siden av hverandre (figur 1 B2). </li><li> Bruk av en 12 V lodding nål til å spre en tynn film av lavtsmeltende voks tann (50 ° C) delvis langs ledningene for å lime dem sammen, (elektrodespissen) (figur 1 B3). La noen få centimeter i limingen (elektrode end) som denne delen vil bli brukt senere for å koble mikro ledninger med elektrodeadapteren. </li></ol></li><li> Koble multikanal mikro ledning til elektroden adapter <ol><li> Fjern glass capillary fra holderen og fest den med minutien pin til elektrodetuppen. Bringe den til en stilling parallell med mikro-elektrode (figur 1 B3). </li><li> Lim elektroden spissen til minutien pin hjelp lavt smelte dental voks og kutte mikro elektrode på spissen, utstående 2-3 cm fra minutien pin og ved elektroden slutten (små piler Figur 1 B3). </li><li> Slip kapillær slforsiktig skrå tilbake inn i elektrode adapter. Bruk skruen til å fikse det (Figur 1 B4). </li><li> Lodd de løse ender av de tre ledningene til loddeørene ved hjelp av en loddepistol med en temperatur på rundt 360 ° C for å sikre smelting av isolasjonen (figur 1 B4). Etter lodding, sikre at det er tilstrekkelig elektrisk kontakt (~ 300 kOhm). </li><li> Monter en av elektrodene (master) til elektroden grensesnittet styret i heads og fikse den andre multi-kanal elektrode (slave) på en egen adapter. Forbind-kanaler for slave til master-elektroden (figur 1 C1). I tillegg lodde referanse, så vel som muskel elektroder til hovedelektrodebasen (figur 1 C2). </li></ol></li></ol> 2. Bee Forberedelse (figur 2) I disse eksperimentene er beskrevet, honningbie (Apis mellifera), som er en virvelløse dyrog derfor ikke krever spesifikke etiske tillatelser til bruk, blir brukt. <ol><li> Catch honningbie nitter (A. mellifera) ved bikuben inngangen i morgen som vist av andre 34,35. </li><li> Chill biene på knust is til immobilisering (5 til 10 minutter) og rette en i en standard pleksiglass holder eller metallrøret på en slik måte at hodet er eksponert (figur 2 A). For å minimalisere hodebevegelser bruke lav-smeltende voks tann (~ 50 ° C) og feste hode nøye til holderen rundt basis av de sammensatte øynene og halsen. </li><li> Bruk lavt smeltevoks til fiksere scapi av antennene på hodet kapsel (figur 2 B) uten å berøre flagellen. Flagellen av antennen må være spiss fremover. Kontroller at bee kan fritt flytte sine snabel. </li><li> Barber hodet kapselen å sørge for en uforstyrret visning og tilgang til toppen av hodet. </li><li> Strøm bee med en 30% sukrose løsning inntil saturatifor å sikre en tilstrekkelig fukting av hjernevev og god levedyktighet av dyret (figur 2 C). </li><li> Gjør forsiktig snitt vertikalt langs grensene til de sammensatte øyne og horisontalt over antennal baser samt under Ocelli og fjern løsnet stykke skjellaget (Figur 2 D). </li><li> Nøye sette av hypopharyngeal kjertler og fjerne luftrøret for å sikre et klart syn og tilgang til hjernen før elektroden innsetting (Tall 2E, 2F). </li></ol> Tre. Elektrode Insertion I eksemplet tilfellet vist i figur 2, er en elektrode plassert med sikte på å l-ALT, den andre tar sikte på m-ALT 2. Ved hjelp av spesielle landemerker, øvrige satsingsområdene er mulig også, for eksempel Al-og MB utgang regioner en. <ol><li> Plasser elektrodene hjelp micromanipulators på region av interesse ( <strong&gt; Figur 2G og 3A). For å målrette m-ALT sted elektroden mellom AL og medialt fra den vertikale flik av MB. Sørg innstikkstedet er over forgreningspunktet av de mediolateral ALT PNS. Stikker elektroden inn i hjernen med en dybde på omtrent 180 um (figur 2E). For l-ALT PN opptak elektroden under den laterale protocerebrum (LH) i midten av en tenkt linje mellom den laterale side av vertikal flik og på midten av AL. Sett i elektroden med en dybde på omtrent 300 um (figur 2E) </li><li> Sett referansen (sølv wire, omtrent 25 mikrometer i diameter) i ipsilaterale sammensatt øye gjennom et lite snitt i skjellaget. Sett en annen sølv wire inn i muskelen projeksjon regionen under den laterale Ocelli. MERK: Hvis det er nødvendig for å lære oppførsel av bee kan overvåkes med høy tidsmessig presisjon ved å registrere muskelen M17, som er involvert in snabel forlengelse respons (PER) av bee 36 som beskrevet i 25 år. </li><li> For å solid feste elektrodene i hjernen og hodet kapsel, dekke hele rommet over hjernen med to-komponent silikon (figur 2H), noe som vil hindre hjernen fra å tørke ut. MERK: opptakene kan vare i timer opp til dager, og biene kan for eksempel bli registrert i løpet av et klassisk betinging prosedyre (figur 2H) eller stimulert med et stort panel av forskjellige lukter. </li></ol> 4. Datainnsamling og forhåndsbehandling <ol><li> Bruk riktig oppkjøp programvare som oppfyller følgende krav: samplingsfrekvens på min 25 kHz; 1,25 analog eller digital to tverr differensiering mellom elektrode kanaler; Bandet pass filter fra 300 Hz til 8000 Hz for å trekke pigg hendelser. </li><li> Bruk tilgjengelig pigg sortering programvare for å trekke ut én enhet aktivitet, for eksempel templspiste matchende teknikker som inngår i Spike2 programvare (figur 3). </li><li> For ytterligere analyse bruke tidsangivelser for de utpakkede enheter for å beregne enkelt enhet i gjennomsnitt lukt svar (figur 4), eller å beregne befolknings vektorer for Principal Component Analysis (PCA) (figur 5) ved hjelp av kommersielt tilgjengelig programvare. For ytterligere å analysere enkelt enhet og befolkningen respons latency kan du sammenligne nyere publikasjoner 1,2,25. </li></ol> 5. Visualisering av Relativ elektrode Position (figur 4) <ol><li> Dypp elektroder spissene ned i en oppløsning av enten 5% Alexa hydrazid 568 eller 5% Alexa hydrazid 488 som er oppløst i 0,5 M kaliumklorid-løsning forut for opptakseksperimenter. </li><li> Fjern elektrodene og dekker silisium nøye etter forsøkene, skyll hjernen med bee Ringer løsning, fjerne kjertler og luftrøret og sett små krystaller av tetramethylrhodamin dekstran eller sette inn en 5% løsning løst i 1,0 M kalium acetat inn i AL å merke alts anterogradely. Utfør følgende trinn i mørket. </li><li> Tillat fargestoffet tas opp og transporteres med projeksjon nevroner sammen sine aksonale traktater (30-45 min) (Figur 4A), før du vasker hjernen med bee Ringer løsning tre ganger for en annen 30-45 min. </li><li> Chill bee på is inntil immobilisering og forsiktig fjerne hjernen fra hodet kapsel. Fiksere hjernen ved å skylle den i en 0,1 M PBS-løsning inneholdende 4% formaldehyd og holde den natten over ved 4 ° C. </li><li> Vent i minst 12 timer før vasking hjernen to ganger i 0,1 M PBS (10 min hver). </li><li> Vask hjernen 3 x i 20 min i 0.2% Triton X-100 fortynnet i 0,1 M PBS før dehydratisering den i en stigende alkoholserie (30%, 50%, 70%, 90%, 95%, 3 x 100% etanol, 20 minst hvert trinn). </li><li> Bygg inn dehydrert hjernen i Methylsalicylate på et objektglass og seal det med en cover lysbilde. </li><li> Bruk et konfokal laser scanning mikroskop og skanne hjernen som optiske seksjoner hver 2-5 mikrometer ved hjelp av en Harmonic Compound Plan Apochromat objektiv (10X 0,4 NA nedsenking). Eksitere vev ved hjelp av 568 nm bølgelengde for tetramethylrhodamin dekstran og en bølgelengde på 488 nm for elektrodeposisjon. </li><li> Rekonstruere farget strukturer i hjernen og elektroder stiene fra de bildestakker i 3D med rekonstruksjon programvare (f.eks. AMIRA eller Fiji) (figur 4). </li></ol>

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

Denne artikkelen viser fremstilling og bruk av spesialdesignet multikanalmikrotrådelektroder. De beskrevne elektroder er egnet for opptak både enkelt enhet og befolkningen aktivitet som er spesielt nyttig for latency målinger og andre timelige respons egenskapene til ulike nerveceller og ulike neuropils innenfor et enkelt eksemplar (for detaljer se 1,2,25). I tillegg har vi vist hvordan du permanent implementere mikrotrådelektroder å tillate stabile langsiktige opptak i oppfører honningbier som varer i timer opp til dager. Ekstracellulære multi-unit opptakene ble et gunstig verktøy for å oppnå høy tidsoppløsning kombinert med romlig informasjon. I vårt tilfelle, disse er enten parallelle nevrale traktater to eller to forskjellige neuropils en. Flere neuroner kan bli registrert og analysert på enkelt neuron nivået i parallell og ved høy tidsmessig oppløsning. Multi-unit rekordninger ble først brukt i pattedyr 38 og senere også i insekter 39-41. Betydelig fremgang ble oppnådd med utvikling og forbedring av ekstracellulære flerkanals opptak teknikker 42,43. Dette, for eksempel, omfatter utvikling av nye elektroder 44 eller romanen spike sorterings-og clustering algoritmer 45. Generelle metoder for ekstracellulære multi-enhets opptak teknikker er godt beskrevet 46 - 48. De selv bygget elektrodene som vises i denne videoen i tillegg kan tilpasses ved å legge til flere microwires pr elektrode eller mikro ledninger kan vris til å få målbare konstant avstand mellom spissene. Begge fremgangsmåter vil imidlertid føre til avtagende fleksibilitet og øke tykkelsen av elektroden. Sammenlignet med silisium sonder som vanligvis brukes for ekstracellulære opptak i mye større insekter som hauken møll, gresshoppe og kakerlakk 40,49 - </sup&gt; 51 de beskrevne mikrotrådelektroder er mindre fleksibelt og kan tåle lett med potensielle hjerne bevegelser, og dermed kan bli pålitelig brukes i små sosiale insekter som bier og maur som viser en mye bredere atferdsmessige repertoar. De silikon-sonder har skarpe skaftlignende strukturer skjære axoner og neural vev langs deres innføringskanalen, mens de beskrevne mikro ledninger er runde, fleksibel og mindre, og er derfor mindre skadelige for omgivende vev, som er en klar fordel dersom målet er å studere lang -begrepet plastisitet i en intakt og oppfører dyret. En annen fordel med mikrotrådelektroder er deres lave produksjonskostnader og enkel håndtering. I stedet for å nøye rengjøring en dyr silikon sonde elektrodetråder er nyklipt før hjernen innsetting og derfor mangel problemer med lunger. Videre er det mulig å bruke mer enn ett mikrotrådelektroder i samme preparat, enten satt inn i forskjellige neuropiles 1 or traktene to som vi viser her. Denne tilnærmingen er spesielt gunstig å analysere og sammenligne timelige aspekter som respons ventetider og samhandling på ulike nevrale prosesseringsnivåer. Vi er klar over det faktum at en ekstracellulær innspilte signal ikke reflekterer enkeltcelle-aktivitet per se. Det er alltid en forbindelse av spenningsaktiviteten rundt elektrodespissen. For å lokalisere kilden for signalet differansen av to nabomikrotråd kanaler innenfor en elektrode er alltid beregnet. Således kilde for pigg-signaler som benyttes til å trekke ut én enhet aktivitet var alltid meget nær den ene eller den andre elektroden kanalen resulterer i lett skjelnes pigg bølgeformer. Signaler fra lenger borte, slik som muskel-aktivitet eller aktivitet av nabo neuropils, når begge elektrodene samtidig fremkaller sammenlignbare former og amplituder og vil bli forkastet av denne fremgangsmåten. Bruke malen matchingsteknikk for Spike2,Vi er svært sikre å oppnå enkelt enhet aktivitet, som ikke er den samme, men svært nær én nervecelle-aktivitet. Men, kunne spørsmålet om spike sortering unngås ved hjelp av intracellulære opptak teknikker. Encellete innspillinger med enten skarpe elektroder eller patch pipetter tillate inngående kunnskap om fysiologiske egenskapene til en enkelt nervecelle. Men på grunn av den lille størrelsen på insekt nevroner og deres neurites (f.eks., Mindre enn 1 mikrometer for honningbie PNS 52) bare kortsiktige innspillinger er håndterbare. Videre kan intracellulært opptak være invasiv og kan skade cellen som er muligens en annen grunn for de timelige begrensninger. In vivo intracellulære opptak i insekter sjelden overleve én time. En tidsvindu som var tilstrekkelig for det banebrytende arbeidet til Martin Hammer 53 som spilte intracellulær fra en enkelt identifisert nevron, ventral uparede maxilar nevron nr. 1 (VUMmx1). Han kunne link dens aktivitet direkte til belønning pathway. Juliane Mauelshagen 54 registrerte intracellulært aktiviteten til en identifisert sopp kroppen ytre nervecellen, den pedunculus ytre nevron nr. 1 (PE1) under klassisk betinging. Det samme nevron var i fokus for Menzel og Manz 55 da de fant LTP etter elektrisk stimulering av Kenyon Cells. Men Okada og kolleger 56 kunne bruke intracellulært godt karakterisert spiking mønster (doble og triple pigger) for identifisering av PE1 under ekstracellulære opptak. Tross alt en kombinasjon av begge metodene, kan intracellulære opptak fra identifiserte nevroner og ekstracellulære langsiktige opptak være et kraftig verktøy for fremtidige undersøkelser. Men ved å bruke skarpe elektroder for å spille inn flere celler (enheter) samtidig på forskjellige nivåer gjennom mange timer opp til dager til å analysere sine time respons-forhold og / eller plast endringer ier nesten umulig. Med den første kalsium bildebehandling tilnærminger i honningbien 57,58 hjelp kalsiumfølsomme fargestoffer analyse av romlige mønstre av lukt svar var tilgjengelig 59-62. Men i mange tilfeller kalsiumfølsomme fargestoffer har til å bli innført i hjernevevet via invasive manipulasjoner som igjen begrenser bie levetid og iboende egenskaper av de analyserte celler. Dette problemet er overvunnet i andre modellorganismer som banan bruker genetisk innført kalsium sensorer 63,64. Men generelt kan kalsium sensorer innføre andre begrensninger som de kan opptre som kalsiumbuffere som trolig påvirke tidsmessige egenskaper av lukt responser. Samtidige intracellulære innspillinger kombinert med kalsium bildebehandling eller beregnings tilnærminger kan bevise riktig tidsmessig oppløsning på bildeprosesser 65,66. Men tidsmessig oppløsning på bildeprosessen er Rather begrenset. Optiske oppkjøp systemer vanligvis bruker CCD-bildebehandling med en tidsmessig oppløsning på 5-20 Hz 67, selv om to-foton-Imaging kan være i stand til å tilegne seg raskere sekvenser 68. Imidlertid øker samplingsfrekvensen alltid går sammen med et tap i romlig oppløsning. Videre kalsiumfølsomme fargestoffer som brukes i honningen gjennomgå bleking, noe som også reduserer oppkjøps tid 69. Sammenlignet med andre fysiologiske opptaksteknikker i insekter våre fleksible multikanals mikro-trådelektroder sikre lang tid tilgang til én enhet og befolkning neuronal aktivitet i oppfører bier. Vi demonstrerte å bruke to av disse elektroder ved forskjellige behandlingstrinn i det samme dyr, som muliggjør analyse av temporale koding forhold mellom de forskjellige opptakssteder. Avhengig av den problemstilling og modellen insekt den grunnleggende metode for elektrode bygningen vist her er enkelt utvidestand og / eller kan tilpasses. For eksempel er det mulig å anvende flere enn de tre enkelttråder for å produsere flerkanals elektroder. I tillegg kan antall registrerings områder bli utvidet og observere tidsmessige aspekter ved flere enn to trakter eller neuropils er gjennomførbart. Vårt håp er at denne metoden vil inspirere mange forskere og vil bidra positivt til forståelsen av sofistikerte nevronale behandling i små hjerner.

Honeybees så vel som de fleste andre insekter sterkt avhengige av luktesans. Blant annet de bruker lukte stikkord for orientering, parring, kommunikasjon med conspecifics, og beite. Deres godt utdypet luktsystemet bidrar til et rikt repertoar av lærings atferd knyttet til blomsterluktstimuli. Disse atferd kan lett studert under kontrollerte laboratorieforhold (for gjennomgang se 3 - 5). Deres &quot;mini hjerner&quot; (cp. 6) med sine relativt lite antall nerveceller gjør honningbie en velegnet modellorganisme for å studere lukte koding og læring under overvåking av nevral aktivitet. Den luktsystemet hos insekter så vel som i pattedyr viser analogt organisasjon i stor grad (for gjennomgang se 7,8). I honningbier ca 80000 reseptor nevroner 9 ligger i sensillae langs antennene 10,11 sette miljø lukt stimulans til en neuronal signal. Axoner fra olfactory reseptor neuroner innerverer antennal lobe (AL), som har en glomerulær organisasjon kan sammenlignes med den hos virveldyr luktelappen. Den AL består av ca 164 glomeruli koblet sammen med hverandre etter ca 4000 lokale interneurons (LN) (for gjennomgang se 12). Spesielt i honningbien har det blitt vist nylig at LNS gir flekkvis lateral tilkobling og at ulike subpopulasjoner besitter elementær og configural lukte koding egenskaper 13,14. Den AL ble vist å være inndelt i en ventral og en dorsal hemi lobe som gir opphav til den mediale og laterale antennal lobe kanalen (m-, og l-ALT, tidligere betegnet m-og l-APT for medial-lateral og antennal lobe protocerebral proselyttering 15 - 17). Her en ny kanalen terminologi innført av en nylig innsats for en enhetlig nomenklatur av insekt hjernen vil bli brukt 18. Begge alts (l-og m-ALT) kombinere enten 410 (l-ALAT) eller 510 (m-ALT) uniglomerular projeDette skjer nevroner (PN), henholdsvis 15,16,19. PNS av begge traktater har nylig vist seg å kode lukt i parallell 2 (for gjennomgang se 17,20), og begge traktater postsynaptisk danne avvikende forbindelser med Kenyon Cells (KC), sopp kroppen (MB) viktigste nevroner. Hver MB inneholder ca 172 000 KCs 21-23. MBS er kjent for å være involvert i stimulans integrering, læring og hukommelse formasjon. De AXO dendritter av KCs danne peduncle (sopp er stammen), som har to hovedutganger regioner: den Vertica eller alpha-lapp og den horisontale eller beta-lapp 22,24. Utgangen av MB konvergerer mot bare ca 400 ytre nevroner (EN) 24. ENS er ansvarlig for olfactory informasjonsbehandling for det meste innerverer den ventrale del av den vertikale lobe 22.. Nylig har det blitt vist at ENS registrert på dette området kode lukt belønning foreningen 25. Temporal somutsikter i luktesystemet av insekter samt virveldyr har blitt en viktig og vesentlig aspekt som en potensiell koding prinsipp 26 - 29. For å være i stand til å samtidig ta opp flere nevroner fra ulike områder med høy tidsoppløsning, etablerte vi doble multi enhet opptaksteknikker ved hjelp av tilpassede multikanals trådelektroder introdusert til ulike målgrupper regioner i bee luktesystem. Denne tilnærmingen gjør oss i stand til å analysere og sammenligne tidsmessig behandling i honningbien luktsystemet på nivået av enkeltnerveceller og populasjoner av nerveceller enten mellom parallelle lukte trasé, dual lukte pathway to eller mellom ulike påfølgende neuropils en. Nylig med en lignende eksperimentell tilnærming i locust luktsystemet 30 ved hjelp av en annen konfigurasjon av elektroder var i stand til å analysere tid og rom kodemekanisme for bakgrunn-lukt invariant gjenkjennelse 31.. Thoss, de etablerte dual opptak aktiverer samle romlig informasjon om samtidige nevronale aktivitetsprofiler. Sammenlignet med den bredere romlig sampling hentet fra kalsium bildebehandling denne metoden gjør opptak fra to stedene bare. Imidlertid er fordelen i forhold til kalsiumavbildningsteknikker er den høye time presisjon på aksjonspotensial-opptak, som ikke kan leveres av enten konvensjonell CCD eller to-foton avbildning anskaffelse. De ekstracellulære elektroder som er beskrevet her er permanent implantert og festet i forhold til hjernen og hodekapsel unngå elektrodedrift. Dette er en klar fordel i forhold til bruken av skarpe intracellulære elektroder. En annen fordel i forhold til intracellulære opptak og kalsium bildebehandling er den utvidede nevrale observasjonstid alt fra mange timer opp til dager. Dette er en viktig forutsetning for å undersøke nevrale korrelater for læring og hukommelse formasjon. Ytterligere fordeler av multienhets innspillinger er videre beskrevet i diskusjonskapittelet. I denne metodeoversikten produksjon prosedyren for tilpasset design trådelektroder vil bli vist, tilpasset fra 32,33 og egnet for langsiktig multi unit opptak i honningbien hjernen. I tillegg er et eksempel på hvordan slike elektroder er fast implantert på to forskjellige steder innenfor opptaks honningbie olfaktoriske system for å registrere samtidig, l-og m-ALT over lange tidsperioder for å tillate mange stimuleringsregimer er vist to. For verifisering av de mottatte posisjoner et eksempel og protokoll for farging og etter opptak visualisering av opptakssider er gitt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Paraffin oil</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>76235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odors</td>
			<td>Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Formaldehyde</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Methanol free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X</td>
			<td>BioChemica</td>
			<td>A1388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylsalicylate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4529.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamin dextran, 10,000 MW (Microruby)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D7162</td>
			<td>keep dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488 hydrazide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-10436</td>
			<td>keep dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 568 hydrazide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-10437</td>
			<td>keep dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bee Ringer Solution</td>
			<td>see 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyurethane-coated copper wire</td>
			<td>Elektrisola</td>
			<td>15&#181;m diameter &#38; P155 insulation</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Wax&#160;</td>
			<td>Densply Detrey</td>
			<td>64103015S1</td>
			<td>moderate melting point</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Wax</td>
			<td>Flexaponal&#160;</td>
			<td>124-202-00</td>
			<td>low-melting Wax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KWIK SIl</td>
			<td>WPI</td>
			<td>03L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 Pin Socket</td>
			<td>Conrad Electronic</td>
			<td>189634-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot melting glue</td>
			<td>Conrad Electronic</td>
			<td>827673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>soldering needle</td>
			<td>Conrad Electronics</td>
			<td>830283</td>
			<td>12 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering terminal lug&#160;</td>
			<td>Conrad Electronic</td>
			<td>531901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glaselectrodes</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B100F-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-20</td>
			<td>V2A 0.2 x 12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>switchable headstage</td>
			<td>Tucer Davis Technologies</td>
			<td>SH16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headstage connection module</td>
			<td>NPI</td>
			<td>INT-03M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier Module</td>
			<td>NPI</td>
			<td>PDA-2F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquisition boards</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI-6123, Ni-6143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition Software</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>Lab View 8.2</td>
			<td>custom design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spike-Sorting&#160;</td>
			<td>CED&#160;</td>
			<td>Spike 2 v7.11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>R2008B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Leitz</td>
			<td></td>
			<td>manual</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AG-wires</td>
			<td>WPI</td>
			<td>AGT05100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP2 AOBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMIRA</td>
			<td>Mercury Computer Systems&#160;</td>
			<td>2/5/2000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous long-term recordings at two neuronal processing stages in behaving honeybees

I begge pattedyr og insekter neuronal informasjon bearbeides i forskjellige høyere og lavere orden hjerne sentre. Disse sentrene er koblet via konvergent og avvikende anatomiske tilkoblinger inkludert fôr fram og tilbakemeldinger ledningsnett. Videre blir informasjonen fra den samme opprinnelsen delvis sendt via parallelle veier til forskjellige, og noen ganger i de samme hjerneområdene. For å forstå de evolusjonære fordeler så vel som de beregnings fordelene ved disse ledninger strategier og spesielt deres tidsmessige avhengigheter på hverandre, er det nødvendig å ha samtidig tilgang til enkelt nevroner i forskjellige trakter eller neuropiles i det samme preparatet med høy tidsoppløsning. Her konsentrerer vi oss om honningbier ved å demonstrere en unik ekstracellulære langsiktig tilgang til å spille inn flere enhet aktivitet ved to påfølgende neuropiles 1, antennal lapp (AL), den første lukteprosesstrinn og sjampinjong kroppen (MB), en høyere orden integrering sentrum involved i læring og hukommelse formasjon, eller to parallelle nevrale traktater to forbinder AL med MB. Sistnevnte ble valgt som et eksempel og vil bli beskrevet i sin helhet. I bære video konstruksjonen og permanent innsetting av fleksible flerkanaltrådelektroder er demonstrert. Parvise differensialforsterkning av de mikrotrådelektrode kanaler drastisk reduserer støyen og verifiserer at kilden til signalet er nært knyttet til posisjonen til elektrodespissen. Den mekaniske fleksibiliteten av de brukte trådelektroder gir stabile invasive langtidsopptak i løpet av mange timer til dager, noe som er en klar fordel sammenlignet med konvensjonelle ekstra-og intracellulære in vivo opptaksteknikker.

&quot;Den nåværende protokollen tillater samtidige opptak på to forskjellige prosesstrinn innenfor enkelte honningbier og i tillegg gjør det mulig å teste underliggende mekanismene for læring og hukommelse via f.eks., PER condition innen behersket honningbier.&quot; Dette er en forutsetning for analyse av temporale aspekter av neuronal behandling. Metoden er lett å tilpasse for ulike vitenskapelige tilnærminger til å løse den nevronale nettverk av bienes luktesans. For eksempel er denne metoden benyttes (i) å analysere tidsmessig behandling av PNS innen den doble olfactory vei av honningbie, l-og m-ALT PNS (figur 5). I figur 5A ett eksempel på en l-ALT PN samtidig registreres med en PN av m-ALT er gitt som ti prøve gjennomsnitt og illustrerer deres respons styrke og latens med hensyn til fem forskjellige luktkonsentrasjon som fargekodet varmeflekk. I et gjennomsnitt på sju bier med 11 l-og 13 mALT PNS (figurene 5B, 5C) illustrerer at både svar styrke så vel som respons ventetid, i en viss grad, reflekterer odorant konsentrasjon. Dermed er till i dette eksempelet øke sin respons styrke mens med økende odorant konsentrasjon deres respons latency avvist (figur 5B, 5C). Dette resultatet er ganske begrenset og gjelder kun for den analyserte odorant, men er likevel i tråd med nyere beregningsmodeller av AL 37. Enten lukt konsentrasjon koding i biens AL ligger til grunn for ikke-lineære beregninger eller ligger under andre koding eiendommer fortsatt må analyseres i fremtiden. Videre kan metoden brukes (ii) å sammenligne tidsmessige aspekter i populasjonen aktivitet ved to etterfølgende bearbeidelsestrinn, Al-og MB-produksjon (figur 6). Prinsipal komponent analyse (PCA) illustrerer at lukt beregning er forlenget og overleve hele lukt presentasjon på PN nivå mens i ENs bare lukt og på sett var representert i populasjonen aktivitet (figur 6). Dermed EN befolkning nådde sin maksimale aktivitet allerede på et tidspunkt når PN aktiviteten er fortsatt utvikling (cp. Movie 1). <img alt="Figur 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig1highres.jpg" width="400" /> .. Figur 1 Industri tre-kanals mikrotrådelektroder A1) avslutninger av tre ledninger er loddet til en IC-pinners kontakt i posisjoner 11, 13 og 16 A2) Fire lödöron skrues fast på en pleksiglass plast bunnplate.; en minutien pinne settes inn i spissen av et glasskapillær som så blir festet til plastplaten. A3) Plastplaten er festet på toppen av en IC-polet kontakt, og den frie ende av hver ledning er loddet til en av de øverste lodding kabelsko. &lt;sterke&gt; B1) Å utstyre elektrodeholderen med de fine kobbertråder, har kapillær skal tas ut igjen. B2) Bunnen av holderen er deretter festet i en spesiallaget innrette enheten. Tre kopper mikro ledninger er justert langs sporet og festes med teip i hver ende B3) De parallelle mikro ledninger er limt sammen med dental voks og kapillær er satt tilbake på plass (lange piler).; de limte mikro ledninger er deretter festet til kapillær med tann voks og dens ender er avskåret (korte piler). B4) De tre løse ender av kobberledninger er loddet til de tre loddeører således bringe dem i elektrisk kontakt med den IC-pin-kontakt. C1) To ferdigmonterte elektroder kan kobles til hverandre for bruk med en enkelt heads. C2) For dette formål pinnene i en elektrode (venstre, slave) er forbundet via isolerte ledninger til den andre elektrode (høyre, master), som er koblet til hovedtrinn; den heads koblet elektroden kan også samle innspill fra en muskel (M17) og referanseelektrode (Ref). <img alt="Fig. 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig2highres.jpg" width="500" /> Figur 2. Fremstilling og permanent elektrode innsetting i bie hjernen. A) En bie settes inn i en pleksiglass holderen etter immobilisering på is. Antenner med Flagellum (FL) og Scapus (SC) er indikert. B) Hodet og antenner er løst ved hjelp av dental voks. C) Hodet kapsel er barbert og bee mates med sukkervann. D) Hodet kapsel åpnes. E) etter fjerning kjertler og trachea fra toppen av hjernen, kan de forskjellige neuropiles og større landemerker lett skilles. De baner av Alts angis sammen medet merke, hvor elektrodene er satt inn. (MB: Mushroom body, AL: antennal lapp, OL: Optisk lapp, α: Alpha lapp eller vertikal lapp, ALT: antennal lobe kanalen, E1: elektrode innsetting side for m-ALAT innspillinger, E2: elektrode innsetting side for l-ALT opptak). F) Referanse (Ref) og muskel elektroder (M17) er satt inn i hodet kapselen gjennom små hull i hårstråene eller forbindelsen øyet. G) De trådelektroder er satt inn i hjernen på de riktige steder. H) Etter feste elektrodene på plass ved hjelp av to-komponent silisium, biene fortsatt viser PER og kan være betinget (f.eks., ved hjelp av sukkervann). <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig3highres.jpg" width="500" /> Figur 3. Ekstracellulær opptak på to nevrale traktater og enkelt enhet utvinning (pigg sortering). A </strong&gt;) Skjematisk tegning av det eksperimentelle oppsettet. Den bee er fiksert i et pleksiglass holderen. Lukt stimulering er tilgjengelig via et glassrør. To elektrode Shanks er opptak fra den eksponerte bee hjernen. B) Samtidige opptak fra l-og m-ALT PNS (grønn og lilla spor) viser eksitatoriske svar på begge traktater til en 500 msek lukt stimulering av honning i vann løsning med en konsentrasjon 1:100 ved 33 ° C. Hver plottet linje representerer de differensierte kanaler som etiketten fargekodet fra elektrode lödlänkar i A. Bar:. 50 μV C) Etter pigg sortering prosedyrer enkeltaksjonspotensialer er sortert og fargekodet. Overlapping av de sorterte enheter illustrerer separeringen av bølgeformene. D) Spike intervall histogram viser separasjonskvaliteten av de sorterte enheter som bevis for tilstrekkelig pigg sortering. Merk at det er ingen pigg innenfor enhetens refraktærperiode. E) To visninger (E1, E2) fraen 3D gruppering av den sorterte enhet med prinsipalkomponentanalyse som indikerer avstanden til de sorterte enhetene til hverandre. Sirkler indikerer 2,5 fold Mahalanobis avstand som ligner på SD i verdensrommet, og indikerer en betydelig differensiering av klyngene i den viktigste komponenten plass F) Fargekodede enheter skildrer aksjonspotensialer synlige i en forstørrelse på tre kanaler fra én kanalen opptak. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51750/51750fig3highres.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig4highres.jpg" width="500" /> Figur 4. Post-innspilling visualisering og 3D-rekonstruksjon av opptak. A) Projection visning av orto-skiver langs z-aksen med maksimal intensitet justering av en anteroog retrograd tilbakefylling av de uniglomerular projeksjon nevroner utstikk fra AL til MB og LH. Den intracellulære tracer Microruby (tetramethylrhodamin dekstran) ble satt inn i AL etter opptakseksperimenter. Stained glomeruli inne i AL bevis riktig PN farging. B) Projection visning av orto skiver langs z-aksen med maksimal intensitet justering fra en farging av de to elektroder med Alexa hydrazid 488 indikerer elektrodeplasseringen for m-ALAT (E1, pil ) og l-ALAT (E2, pil). Den tracer Alexa Hydrazid 488 vandrer til elektroden omkringliggende vev og flekker elektroden innstikkstedet. Merk, den fremtredende flekker i AL er en overfladisk artefakt. C) 3D rekonstruksjoner av de fargede målcellene (PNS) og elektrodeinnstikkstedet fra A, B (høyre side) sammen med en skjematisk oversikt over honningbie luktsystemet (venstre side) med angivelse av l-m-og ALAT-baner. Obs, bare uniglomerular PN traktene vises. AN: antennal nerve, AL: antennal lapp, LH: lateral horn, MB: sopp kroppen, E1, E2: elektrodeinnstikk, m-ALT: medial antennal lobe kanalen, l-ALT: lateral antennal lobe-tarmkanalen, c: Caudal, r: rostral, m: medial, l:. lateral <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51750/51750fig4highres.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 5" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig5highres.jpg" width="300" /> Figur 5. Eksempel luktkonsentrasjon koding innenfor den doble olfactory pathway. A) Varme plott illustrerer responsen av en enkelt l-ALT (grønn) og enkelt m-ALT PN (purpur) anskaffet samtidig fra en enkelt honningbie som reaksjon på odorant hexanal ved økende luktkonsentrasjon (fra 1: 10 til 1:100 -6). Hver linje er et gjennomsnitt av ti prøve Stimbefolkningens. Forbrenningsintensiteten er vist som relativ intensitetsendring som er avfyringshastighet i forhold til det subtraheres spontan aktivitet. B) Folke respons ventetid på 11 l, og 13 m-ALT PNS fra 7 innspilte bier. I hvert bee PNS fra begge traktater ble spilt inn samtidig. Responsen befolkningen ventetid viser en avtagende latency med økende lukt konsentrasjon i till fra begge traktater. Lukten respons utbruddet på antennene på 99 ms ble registrert via electroantennograms og trekkes fra PN responsventetider. Legg merke til at på de laveste konsentrasjonene svarene er for svake for latency målinger, og derfor ble ekskludert. C) Befolknings respons avfyring sats fra samme PNS som i B. Med økende lukt konsentrasjon responsstyrken øker. Den l-ALT viser en sterkere respons styrke. I B, er C gjennomsnitt og SD gitt. <img alt="Figur 6" fo:content-width = &quot;5in&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51750/51750fig6highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figur 6. Sammenligning aktivitet befolkning på to påfølgende behandlingen etapper langs honningbie lukte pathway. Data ble registrert i 20 dyr som ble stimulert med en-heksanol og 2-octanone. A) Hver linje representerer den falske fargekodet gjennomsnittlig avfyring hastighet på en projeksjon nevron (PN) beregnet over 10 lukt repetisjoner av en-heksanol. Lukt presentasjon starter på tid 0 og varte i tre sekunder. B) viser det samme som i A), men for sopp kroppens ytre nevroner (EN). Matrisen vist i A) kan ses på som en PN befolkning vektor under lukt stimulering med 1-heksanol. Vi har beregnet den samme type populasjon vektor under lukt stimulering med 2-octanone og brukes begge vektorer i en hovedkomponentanalyse (PCA) å holde tidsdimensjonen. C) De første tre hovedkomponenter (PC1, 2 og 3) varplottes mot hverandre for å illustrere den lukt separasjon i PN-ensemble aktivitet på antennal lobe utgang. Tiden før lukt utbruddet er markert med svart. Aktivitet i løpet av tre sekunder av stimulering med 1-heksanol er vist i blått. Aktiviteten under stimulering med 2-oktanol er vist i rødt. Videre viser vi 1,5 sekunder (legg) av aktivitet etter lukt av settet av 1-heksanol (lys blå) og 2-octanonen (rosa). Merk at ved PN ensemble nivå, både lukt fremkaller svært forskjellige baner bosette seg i et &quot;fast punkt&quot; som outlasts hele lukt stimulering periode. Først etter lukt oppveie baner flytte tilbake til baseline aktivitet uten lukt stimulering. D) Den samme analysen ble gjort på EN ensemble nivå som representerer aktiviteten på sopp kroppen utgang. Sammenlignet med PN aktivitet lukt fremkalle en mindre distinkt bane. Videre et &quot;fast punkt&quot; ikke er observerbare. Den noe lukt induserte baner intermingle med baseline aktivitet selv om lukt er fortsatt til stede. Bare lukt offset fremkalt en ekstra bane. <a href="/files/ftp_upload/51750/Movie_R3_Brill_et_al._JoVE.avi" target="_blank">. Movie 1</a> Tid løst evaluering av en lukt indusert banen etter principal komponent analyse av en PN-befolkningen vektor (til venstre) og en EN befolkning vektor. (høyre;. cp Figur 6) De øvre delene omfatter de første tre hovedkomponenter (PC1, 2 og 3) er plottet mot hverandre. De nedre paneler illustrerer evaluering av PC1, 2 og 3 over tid. Lukt stimulering er preget av det grå feltet. Alle panelene ble synkronisert. Merk at EN befolkningen aktiviteten starter litt før PN befolkningen aktivitet, kan et fenomen som synes å være contraintuitive men forklares ved tilkobling og egenskapene til de involverte lagene, noe som er diskutert tidligere en.

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees at JoVE.com

Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

Samtidige Langsiktige Recordings på To Neuronal Processing Stages i oppfører Honeybees

Samtidige ekstracellulære langsiktige opptak fra to ulike hjerne neuropiles eller to forskjellige anatomiske traktater ble etablert i honningbier. Disse opptakene tillate etterforskningen av timelige aspekter av nevronale behandling på tvers av ulike hjerneområder på enkelt nervecelle samt på ensemble nivå i en oppfører dyret.

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dual Elektrofysiologiske Opptak av Synaptically-fremkalt Astroglial og Neuronal Responses i akutt hippocampus Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

En molekylær Avlesning av Long-term olfactory Tilpasning i<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

En prosedyre for Implanting Organiserte Arrays av Microwires for Single-unit Recordings i Awake, Oppfører Dyr

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Agaroseplater Microchambers for Long-term Kalsium Imaging av<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Samtidig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funksjonell testing av to netthinne etter<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogrammet System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

To-fotonet kalsium Imaging i Neuronal Dendrites i hjernen skiver

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Optogenetic Entrainment av hippocampus Theta svingninger i oppfører seg mus

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Long-term Sensory Conflict in Freely Behaving Mice

Langsiktig sensoriske konflikt i fritt oppfører seg mus

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for ...