Name: simultaneous long-term recordings at two neuronal processing stages in behaving honeybees
Uploaded: 2014-07-21T15:00:00
Duration: 13 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees at JoVE.com

The authors would like to thank Isabelle Reus for establishment of tracing the electrode insertion side, Tobias Rosenbaum for LabView programming, Anneke Meyer for data analyzes and helpful discussions. We thank Randolf Menzel for discussion and practical help during early stage of electrode development. Furthermore we thank Brian Smith for postdoctoral association to MS-B. This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SPP 1392, Ro1177/5-2) to WR.

1. Elektrod Building (figur 1) <ol><li> Produktion av en elektrod adapter som passar elektroden gränssnittskort av kommersiella flerkanalsförstärkare system 1,2,25. <ol><li> Använd en liten plexiglasplatta limmas på en 18 Pin kontakt bas. </li><li> Anslut basen med 3 korta bitar av isolerad tråd till 3 separata lödöron skruvas på plexiglasplattan (Figur 1 A1-A3). </li><li> Sätt i ett spår in i plexiglasplattan vid vilken en glaskapillär lätt kan röra sig och hållas på plats av en skruv (Figur 1 R1). </li><li> Förläng glaskapillär ca 5 mm med användning av en minutien pin. </li><li> Fäst mikroelektrodtrådar längs minutien stiftet och glaskapillär att garantera stabilitet och stöd. </li></ol></li><li> Flerkanals micro tråd produktion (adopterad från Ryuichy Okada 32,33) <ol><li> Span 3 mikrotrådar (polyuretanbelagd koppartråd, 15um i diameter) på ett sätt som de är placerade bredvid varandra (figur 1 B2). </li><li> Använd en 12 V lödning nål för att sprida en tunn film av låg smält dentala vax (50 ° C) delvis längs trådarna att limma ihop dem (elektrodspetsen) (Figur 1 B3). Lämna några centimeter Olimmad (elektrod slut) eftersom detta avsnitt kommer att användas senare för att ansluta mikrotrådar med elektrodadaptern. </li></ol></li><li> Anslut flerkanals mikro tråd till elektrodadaptern <ol><li> Avlägsna glaskapillär från hållaren och fäst den med minutien stift till elektrodspetsen. Bringa den i ett läge parallellt med den mikro-elektrod (Figur 1 B3). </li><li> Lim av elektrodspetsen till minutien stift använder lågsmältande dentalvax och skär mikroelektrod vid spetsen, som skjuter ut 2-3 cm från minutien tappen och vid elektrodänden (små pilar Figur 1 B3). </li><li> Slip kapillär slightly tillbaka in i elektrodadaptern. Använd skruven för att fixa det (figur 1 B4). </li><li> Löd de lösa ändarna av de tre ledningarna till lödöron med hjälp av en lödning pistol med en temperatur på omkring 360 ° C för att säkerställa smältning av isoleringen (figur 1 R4). Efter lödning, se till att det finns tillräcklig elektrisk kontakt (~ 300 kOhm). </li><li> Montera en av elektroderna (master) till elektroden gränssnittskortet för huvudsteg och fixa den andra multikanalselektrod (slav) på en separat adapter. Anslut kanalerna i slaven till mastern elektroden (Figur 1 C1). Dessutom löda referens samt muskelelektroder till masterelektrodbasen (figur 1 C2). </li></ol></li></ol> 2. Bee Förberedelser (figur 2) I dessa beskrivna experimenten, honungsbiet (Apis mellifera), vilket är ett ryggradslöst djuroch därmed inte kräver några särskilda etiska tillstånd för användning, används. <ol><li> Fånga honungshackar (A. mellifera) på kupan ingången på morgonen så som visas av andra 34,35. </li><li> Chill bina på krossad is tills immobilisering (5 till 10 min) och fixera en i en standard plexiglashållare eller metallröret på ett sätt som huvudet utsätts (figur 2 A). För att minimera huvudrörelser använder lågsmältande dentalvax (~ 50 ° C) och fixera huvudet försiktigt till innehavaren runt grundval av sammansatta ögon och hals. </li><li> Använd låg smältande vax för att fixera scapi av antenner på huvudet kapseln (Figur 2 B) utan att röra flagellen. Den flagellum av antennen behöver påpekas framåt. Se till att biet fritt kan flytta sin snabel. </li><li> Raka huvudet kapsel för att garantera en ostörd vy och tillgång till den övre delen av huvudet. </li><li> Mata biet med en 30% sackaros lösning tills saturatiför att säkerställa en tillräcklig fuktning av hjärnvävnad och god lönsamhet för djur (figur 2 C). </li><li> Gör noggranna snitt vertikalt längs gränserna för sammansatta ögon och horisontellt ovanför antenn baser samt under ocelli och ta bort det lossade bit nagelband (figur 2 D). </li><li> Noggrant avsätta hypopharyngeal körtlar och ta bort luftstrupen för att säkerställa en klar bild och tillgång till hjärnan innan elektrod insättning (figur 2E, 2F). </li></ol> 3. Elektrodinser I exemplet fallet illustreras i figur 2, är en elektrod placerad som syftar till att L-ALT, den andra siktar på m-ALT 2. Med hjälp av speciella landmärken, andra målområden är möjliga också, t ex AL och MB utgångsområden 1. <ol><li> Placera elektroderna med användning av micromanipulators på regionen av intresse ( <strong&gt; Figur 2G och 3A). Om du vill rikta den m-ALT plats elektroden mellan AL och medialt från den vertikala lob i MB. Se till insättningsstället är över förgreningspunkten för de mediolateral ALT PNS. Skjuter elektroden in i hjärnan med ett djup av ca 180 | im (figur 2E). För L-ALT PN inspelning plats elektroden under den laterala protocerebrum (LH) i mitten av en tänkt linje mellan den laterala sidan av vertikala lob och mitt i AL. För in elektroden med ett djup av ca 300 | im (figur 2E) </li><li> Sätt i referens (silvertråd, ca 25 nm i diameter) i den ipsilaterala förening ögat genom ett litet snitt i nagelbanden. Sätt i en annan silvertråd i muskeln projektionsområdet nedanför sido ocelli. OBS: Om det är nödvändigt att lära sig beteende biet kan övervakas med hög tidsmässig precision genom att spela in muskeln M17, som är involverat in snabel förlängning svar (PER) i bee 36 som beskrivs i 25. </li><li> För att fast förankra elektroder i hjärnan och huvudet kapsel, täcka hela utrymmet ovanför hjärnan med tvåkomponents silikon (Figur 2H), som kommer att förhindra hjärnan från att torka ut. OBSERVERA: inspelningarna kan pågå i timmar upp till dagar, och bina kan exempelvis registreras under en klassisk konditioneringsförfarande (Figur 2H) eller stimulerades med en stor panel av olika lukter. </li></ol> 4. Datainsamling och Förbearbetning <ol><li> Använd lämplig förvärvs programvara som uppfyller följande krav: samplingshastighet på minst 25 kHz; analog 1,25 eller digital 2 kors differentiering mellan elektrodkanalerna; bandpassfilter från 300 Hz till 8000 Hz för att extrahera spik händelser. </li><li> Använd tillgängliga spik sortering programvara för att extrahera enhet aktivitet, till exempel templåt matchande tekniker som ingår i Spike2 programvaran (Figur 3). </li><li> För vidare analys använder tidsstämplar av de extraherade enheter för att beräkna enhet genomsnitt luktsvar (Figur 4) eller att beräkna befolknings vektorer för Principal Component Analysis (PCA) (Figur 5) med hjälp av kommersiellt tillgängliga program. För att ytterligare analysera enhet och befolknings responslatens jämför gärna senaste publikationer 1,2,25. </li></ol> 5. Visualisering av relativ Elektrod Position (Figur 4) <ol><li> Doppa elektrod tips in i en lösning av antingen 5% Alexa hydrazid 568 eller 5% Alexa hydrazid 488, som löses i 0,5 M kaliumkloridlösning före inspelnings experiment. </li><li> Ta bort elektroderna och täck kisel noggrant efter experimenten, skölj hjärnan med bee Ringer-lösning, ta bort körtlar och luftstrupe och infoga små kristaller av tetramethylrhodamin dextran eller sätt en 5% lösning löst i 1,0 M kaliumacetat i AL för att märka alts anterogradely. Utför följande steg i mörker. </li><li> Tillåt färgämnet tas upp och transporteras av utsprångs neuroner längs sina axonala områden (30-45 min) (Figur 4A), före tvätt hjärnan med bi Ringer-lösning tre gånger för ytterligare 30-45 min. </li><li> Chill biet på is tills immobilisering och försiktigt bort hjärnan från huvudet kapseln. Fixera hjärnan genom att skölja den i en 0,1 M PBS-lösning innehållande 4% formaldehyd och hålla den över natten vid 4 ° C. </li><li> Vänta minst 12 timmar innan du tvättar hjärnan två gånger i 0,1 M PBS (10 minuter vardera). </li><li> Tvätta hjärnan 3x under 20 min i 0,2% Triton X-100 späddes i 0,1 M PBS innan dehydratisering det i en stigande alkoholserie (30%, 50%, 70%, 90%, 95%, 3 x 100% etanol, 20 min varje steg). </li><li> Bädda in den uttorkad hjärna i metylsalicylat på ett objektglas och sEAL den med ett täckglas. </li><li> Använd en konfokala laserskanning mikroskop och skanna hjärnan som optiska sektioner var 2-5 pm med en harmonisk förening Plan Apochromat mål (10X 0,4 NA nedsänkning). Excite vävnaden med hjälp av 568 nm våglängd för tetramethylrhodamin dextran och en våglängd på 488 nm för elektrodläget. </li><li> Rekonstruera de färgade hjärnstrukturer och elektrodvägar från bildstaplar i 3D med återuppbyggnadsprogram (t ex. AMIRA eller Fiji) (Figur 4). </li></ol>

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Denna artikel visar att produktion och användning av kundanpassade flerkanalmikrotrådelektroder. De beskrivna elektroderna kan användas för att spela in både enhet och befolkningsfrågor, som är speciellt användbart för latency mätningar och andra temporala respons egenskaper hos olika nervceller och olika neuropils inom ett enda exemplar (för detaljer se 1,2,25). Vi har dessutom visat hur permanent att genomföra mikrotrådelektroder för att möjliggöra stabila långsiktiga inspelningar i beter honungsbin som varar i flera timmar upp till dagar. Cellulära flera enheter inspelningar blev positivt verktyg för att uppnå hög tidsupplösning i kombination med geografisk information. I vårt fall, dessa är antingen parallella neuronala trakter 2 eller två olika neuropils 1. Flera nervceller kan spelas in och analyseras på den enda neuron nivån parallellt och med hög tidsupplösning. Flerenhetens registerningar tillämpades först i däggdjur 38 och senare även i insekter 39-41. Betydande framsteg har gjorts med att utveckla och förbättra cellulära flerkanalsinspelningstekniker 42,43. Detta, till exempel, omfattar utveckling av nya elektroder 44 eller nya spik sorterings-och klusteralgoritmer 45. Generella metoder för cellulära multi-unit inspelningstekniker är väl beskrivna 46-48. De själv byggt elektroderna som visas i denna video dessutom kan anpassas genom att lägga till fler microwires per elektrod eller mikrotrådarna kan tvinnas för att få mätbara konstant avstånd mellan spetsarna. Båda förfarandena skulle emellertid leda till minskande flexibilitet och ökar tjockleken på elektroden. Jämfört med kisel sonder som vanligen används för extracellulära inspelningar i mycket större insekter som höken mal, gräshoppor och kackerlacka 40,49 - </sup&gt; 51 de beskrivna mikrotrådelektroder är mindre, flexibla och klarar lätt med potentiella hjärnrörelser och därmed kan användas på ett tillförlitligt sätt i små sociala insekter som bin och myror som visar en mycket bredare beteenderepertoar. De flesta silikon sonder har skarpa skaft liknande strukturer skär axoner och nervvävnad längs deras insättningskanalen, medan de beskrivna mikrotrådarna är runda, flexibla och mindre och är därmed mindre skadliga för den omgivande vävnaden vilket är en klar fördel om målet är att studera lång variga plasticitet i en intakt och beter djur. En annan fördel med mikrotrådelektroder är deras låga tillverkningskostnad och enkel hantering. Istället för att noggrant rengöra en dyr silikon sond elektrodkablar är nyklippt före hjärn insättning och därmed saknar problemen med trafikstockningar. Vidare är det möjligt att använda mer än en mikro trådelektroden i samma beredning antingen införas i olika neuropiles 1 or kontrakt 2 som vi visar här. Detta tillvägagångssätt är särskilt gynnsamt att analysera och jämföra tidsmässiga aspekter som respons latenser och interaktioner på olika neurala behandlingsnivåer. Vi är medvetna om det faktum att en extracellulär inspelade signalen inte återspeglar enda cell aktivitet per se. Det är alltid en förening med spännings aktivitet runt elektrodspetsen. För att lokalisera källan till signalen skillnaden mellan två intilliggande mikrokabelkanaler inom en elektrod är alltid beräknas. Således källan för spik signaler som används för att extrahera enda enhet aktivitet var alltid mycket nära till antingen ett eller det andra elektrodkanal vilket resulterar i lätt urskiljbara spik vågformer. Signaler från längre bort, liksom muskelaktivitet eller aktivitet av grann neuropils, når båda elektroderna samtidigt frammana jämförbara former och amplituder och kommer att förkastas av detta förfarande. Använda mallmatchningsteknik i Spike2,Vi är övertygade om att erhålla enhet aktivitet, vilket inte är samma sak, men mycket nära enda neuron aktivitet. Däremot kan frågan om spik sortering undvikas genom att använda intracellulära inspelningsteknik. Encelliga inspelningar med antingen vassa elektroder eller patch pipetter tillåter fördjupad kunskap om fysiologiska egenskaperna hos ett enda neuron. Men på grund av den begränsade storleken på insekts nervceller och deras neurites (t ex., Mindre än 1 mikrometer för honungsbinas PN 52) endast kortsiktiga inspelningar är hanterbara. Dessutom kan intra cellulära inspelningar vara invasiva och kan skada cellen som är möjligen en annan orsak till de tidsmässiga begränsningar. In vivo intracellulära inspelningar i insekter sällan överleva en timme. Ett tidsfönster som var tillräcklig för det banbrytande arbetet av Martin Hammer 53 som spelade in intracellulär från ett enda identifierat neuron, den ventrala oparade maxilar neuron # 1 (VUMmx1). Han kunde lbläck sin verksamhet direkt till belöningen vägen. Juliane Mauelshagen 54 registrerade intracellulärt aktiviteten hos en identifierad svampkroppen extrinsic neuron, den pedunculus extrinsic neuron # 1 (PE1) under klassisk betingning. Samma neuron var i fokus för Menzel och Manz 55 när de hittade LTP efter elektrisk stimulering av Kenyon celler. Men Okada och kollegor 56 kunde använda intracellulärt väl karakteriserade tillsatta mönster (dubbla och tredubbla spikar) för identifiering av PE1 under extracellulära inspelningar. När allt en kombination av båda metoderna, kan intracellulära inspelningar från identifierade nervceller och extracellulära långsiktiga inspelningar vara ett kraftfullt verktyg för framtida undersökningar. Men med hjälp av vassa elektroder för att spela in flera celler (enheter) samtidigt på olika förädlingsnivåer under flera timmar upp till dagar att analysera sina tidsresponssamband och / eller till och med plast förändringar iär nästan omöjligt. Med den första kalcium avbildning i den honungsbinas 57,58 med hjälp av kalciumkänsliga färgämnen analys av rumsliga mönster av lukt svar var tillgänglig 59-62. Men i många fall kalciumkänsliga färgämnena måste införas för att hjärnvävnaden via invasiva manipulationer som återigen begränsar biets livslängd och inneboende egenskaper hos de analyserade cellerna. Denna fråga övervinns i andra modellorganismer som den fruktflugan använda genetiskt införda kalciumsensorer 63,64. Men i allmänhet kan kalcium sensorer införa andra begränsningar, eftersom de kan fungera som kalcium buffertar som sannolikt påverkar den tidsmässiga egenskaper luktsvar. Samtidiga intracellulära inspelningar i kombination med kalcium avbildning eller computational metoder kan visa den rätta tidsupplösning av avbildning processer 65,66. Emellertid är den temporala upplösningen av avbildningsprocessen rather begränsad. Optiska förvärvs system använder oftast CCD-avbildning med en tidsupplösning av 5-20 Hz 67, även om 2-Photon-Imaging skulle kunna skaffa snabbare sekvenser 68. Dock går ökar samplingshastigheten alltid tillsammans med en förlust i rumslig upplösning. Dessutom kalciumkänsliga färgämnen som används i honungsbinas genomgår blekning, vilket också minskar anskaffningstiden 69. Jämfört med andra fysiologiska inspelningstekniker i insekter våra flexibla flerkanals mikrotrådelektroder säkerställa lång tid tillgång till enhet och befolkning neuronal aktivitet i beter bin. Vi visade hur man använder två av dessa elektroder i olika skeden bearbetning i samma djur, vilket underlättar analysen av tidskodnings aspekter mellan de olika inspelningsplatser. Beroende på forskningsproblem och modellen insekt den grundläggande metoden för elektrod byggnad visade här är enkelt utökastånd och / eller kan anpassas. Till exempel är det tänkbart att använda fler än de tre separata ledare för att producera flerkanalelektroderna. Dessutom kan antalet inspelningsplatser förlängas och observera timliga aspekter av mer än två områden eller neuropils är genomförbart. Vår förhoppning är att denna metod kommer att inspirera många forskare och kommer att bidra positivt till förståelsen av avancerade neuronal bearbetning i små hjärnor.

Honungsbin liksom de flesta andra insekter är starkt beroende av luktsystemet. Bland annat de använder lukt ledtrådar för orientering, parning, kommunikation med artfränder, och födosök. Deras väl utarbetade luktsystem bidrar till en rik repertoar av inlärnings beteenden relaterade till blomster lukt stimuli. Dessa beteenden kan enkelt studeras under kontrollerade laboratorieförhållanden (för en översikt se 3 - 5). Deras &quot;mini hjärnor&quot; (jämför 6) med deras relativt litet antal nervceller gör att honungsbinas en väl anpassad modell organism för att studera lukt kodning och lärande under övervakning av neural aktivitet. Luktsinnet hos insekter och i däggdjur visar motsvarande organisation i stor utsträckning (för översikt se 7,8). I honungsbin omkring 80.000 receptor nervceller 9 belägna i sensillae längs antenner 10,11 översätter miljö lukt stimulans till ett neuronal signal. Axoner från luktreceptor nervceller innerverar Antenn lob (AL), som har en glomerulär organisation jämförbar med den vertebrat luktloben. AL omfattar cirka 164 glomeruli är sammankopplade med varandra med ca 4.000 lokala intern (LN) (för översikt se 12). Särskilt i honeybee det har visats nyligen att LNS åstadkomma fläckvis lateral anslutning och att olika subpopulationer besitter grundämnen och configural olfactory kodningsegenskaper 13,14. AL visade sig delas upp i en ventrala och dorsala hemi lob som ger upphov till den mediala och den laterala Antenn lob-tarmkanalen (m-och l-ALT, tidigare benämnt m-och l-APT för medial-och lateral Antenn lob protocerebral skriftar 15 - 17). Här en ny vägarna terminologi införs genom en ny insats för en enhetlig nomenklatur för insekten hjärnan kommer att användas 18. Båda alts (l-och m-ALAT) kombinera antingen 410 (l-ALAT) eller 510 (m-ALT) uniglomerular projection neuroner (PN), respektive 15,16,19. PNS i båda områden har nyligen visats kod lukter parallellt 2 (för översikt se 17,20), och båda skrifter synaptically bilda olika anslutningar med Kenyon Cells (KC), svamp kropp (MB) huvudsakliga nervceller. Varje MB innehåller ca 172.000 KCS 21-23. MBS är kända för att vara inblandade i stimulans integration, inlärning och minnesbildning. AXO dendriter av KCS bildar stjälk (svamp stäv), som har två huvudsakliga utgångs regioner: Vertica eller alfa-loben och den horisontella eller beta-lob 22,24. Utsignalen från MB konvergerar till endast cirka 400 yttre neuroner (SV) 24. ENS ansvarig för luktinformationsbehandling oftast innerverar den ventrala aspekten av vertikala loben 22. Nyligen har det visats att undersköterskor inspelade på detta område koda lukten belöning föreningen 25. Temporal somaspekter inom luktsinnet av insekter samt ryggradsdjur har blivit en viktig och betydelsefull aspekt som en potentiell princip kodning 26 - 29. För att samtidigt spela in flera nervceller från olika platser med hög tidsupplösning, etablerade vi dubbla multi enhet inspelningsteknik i kundanpassade flerkanalstrådelektroder infördes till olika målområden i biets luktsystemet. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt för oss att analysera och jämföra temporal behandling i honungsbinas luktsystemet i nivå med enskilda nervceller och populationer av nervceller, antingen mellan parallella lukt vägar, den dubbla luktvägen 2 eller mellan olika efterföljande neuropils 1. Nyligen med en liknande experimentell metod i gräshoppor luktsystemet 30 med en annan utformning av elektroder kunde analysera spatiotemporal kodningsmekanism för bakgrund-invariant luktigenkänning 31. Thoss, de etablerade dubbla inspelningar möjliggör insamling av geografisk information om samtidiga neuronala aktivitetsprofiler. Jämfört med den bredare rumsliga provtagning erhålls från kalcium avbildning denna metod medger inspelning från endast två fläckar. Dock är fördelen jämfört med kalcium avbildningstekniker för hög tidsprecision åtgärds potentiella inspelningar som inte kan tillhandahållas av antingen konventionell CCD-avbildning eller 2-photon imaging förvärv. De extracellulära elektroder som beskrivs här är permanent implanterade och fast förhållande till hjärnan och huvudet kapsel undvika elektrodglidning. Detta är en klar fördel jämfört med användningen av skarpa intracellulära elektroder. En annan fördel jämfört med intracellulära inspelningar och kalcium avbildning är den förlängda tiden neurala observation allt från flera timmar upp till dagar. Detta är en viktig förutsättning för att undersöka neurala korrelat till inlärning och minnesbildning. Ytterligare fördelar med multienhets inspelningar vidare beskrivs i diskussionsavsnittet. I denna metod översikt tillverkningsförfarandet av egen design trådelektroder kommer att visas, anpassad från 32,33 och lämpade för långsiktiga multi enhet inspelningar i honungsbinas hjärnan. Dessutom, ett exempel på hur dessa typer av elektroder är permanent implanteras vid två olika inspelningsplatser inom honungsbinas luktsinne för att spela in samtidigt på l-och m-ALT under lång tid så att många stimuleringsprotokoll visas 2. För kontroll av inspelningspositioner ett exempel och protokoll för färgning och efterinspelning visualisering av inspelningsplatser finns.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Paraffin oil</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>76235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odors</td>
			<td>Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Formaldehyde</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Methanol free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X</td>
			<td>BioChemica</td>
			<td>A1388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylsalicylate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4529.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamin dextran, 10,000 MW (Microruby)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D7162</td>
			<td>keep dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488 hydrazide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-10436</td>
			<td>keep dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 568 hydrazide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-10437</td>
			<td>keep dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bee Ringer Solution</td>
			<td>see 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyurethane-coated copper wire</td>
			<td>Elektrisola</td>
			<td>15&#181;m diameter &#38; P155 insulation</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Wax&#160;</td>
			<td>Densply Detrey</td>
			<td>64103015S1</td>
			<td>moderate melting point</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Wax</td>
			<td>Flexaponal&#160;</td>
			<td>124-202-00</td>
			<td>low-melting Wax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KWIK SIl</td>
			<td>WPI</td>
			<td>03L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 Pin Socket</td>
			<td>Conrad Electronic</td>
			<td>189634-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot melting glue</td>
			<td>Conrad Electronic</td>
			<td>827673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>soldering needle</td>
			<td>Conrad Electronics</td>
			<td>830283</td>
			<td>12 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering terminal lug&#160;</td>
			<td>Conrad Electronic</td>
			<td>531901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glaselectrodes</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B100F-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-20</td>
			<td>V2A 0.2 x 12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>switchable headstage</td>
			<td>Tucer Davis Technologies</td>
			<td>SH16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headstage connection module</td>
			<td>NPI</td>
			<td>INT-03M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier Module</td>
			<td>NPI</td>
			<td>PDA-2F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquisition boards</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI-6123, Ni-6143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition Software</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>Lab View 8.2</td>
			<td>custom design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spike-Sorting&#160;</td>
			<td>CED&#160;</td>
			<td>Spike 2 v7.11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>R2008B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Leitz</td>
			<td></td>
			<td>manual</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AG-wires</td>
			<td>WPI</td>
			<td>AGT05100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP2 AOBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMIRA</td>
			<td>Mercury Computer Systems&#160;</td>
			<td>2/5/2000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous long-term recordings at two neuronal processing stages in behaving honeybees

I både däggdjur och insekter neuronal information bearbetas i olika högre och lägre ordning centra i hjärnan. Dessa centra är kopplade via konvergerande och divergerande anatomiska anslutningar inklusive foder framåt och feedback ledningar. Vidare information av samma ursprung delvis skickas via parallella vägar till olika och ibland i samma områden i hjärnan. För att förstå de evolutionära fördelar och de beräknings fördelarna med dessa ledningsstrategier och särskilt deras tidsmässiga beroenden av varandra, är det nödvändigt att ha samtidig tillgång till enstaka nervceller i olika skrifter eller neuropiles i samma beredning med hög tidsupplösning. Här koncentrerar vi oss på honungsbin genom att visa en unik cellulära långsiktig tillgång för att spela in flera enheter aktivitet vid två efterföljande neuropiles 1, den Antenn lob (AL), den första luktbehandlingssteg och svampkroppen (MB), en högre ordning integrationscenter ofrilved i inlärning och minnesbildning, eller två parallella neuronala trakter 2 anslut AL med MB. Det senare valdes som ett exempel och kommer att beskrivas i sin helhet. I stöd video bygg och permanent införande av flexibla flerkanaltrådelektroder demonstreras. Parvis differentiell amplifiering av mikro trådelektroden kanaler drastiskt reducerar bruset och verifierar att källan för den signal som är nära relaterad till läget för elektrodspetsen. Den mekaniska flexibilitet de använda trådelektroder medger stabila invasiva långsiktiga inspelningar under flera timmar upp till dagar, vilket är en klar fördel jämfört med konventionella extra-och intracellulära in vivo inspelningsteknik.

&quot;Det nuvarande protokollet medger samtidiga inspelningar på två olika behandlingssteg inom enskilda honungsbin och dessutom gör det möjligt att testa underliggande mekanismerna för inlärning och minne via t ex., PER konditionering i återhållsamma honungsbin.&quot; Detta är en förutsättning för att analysera tidsmässiga aspekter av neuronal bearbetning. Metoden är lätt att anpassa för olika vetenskapliga metoder för att reda ut det neuronala nätverk av biets luktsystemet. Till exempel använder denna metod (i) att analysera tidsmässig bearbetning av PNS inom den dubbla olfactory pathway av honeybee, L-och m-ALT PNS (Figur 5). I fig 5A ett exempel på en l-ALT PN samtidigt registrerade med en PN-av de m-ALT ges som tio provgenomsnittet och illustrerar deras svar styrka och latens med avseende på fem olika luktkoncentrationer som färgkodade värme plot. I genomsnitt sju bin med 11 liter-och 13 mALT PNS (figurerna 5B, 5C) illustrerar att både svars styrka samt responsen latens, till en viss del återspeglar odorant koncentration. Därmed PNS i detta exempel öka svarsstyrka samtidigt med ökande luktämnen koncentration deras svar latens minskat (figur 5B, 5C). Detta resultat är ganska begränsade och endast giltig för den analyserade luktämnen, men är fortfarande i linje med de senaste beräkningsmodeller för AL 37. Oavsett om luktkoncentration kodning i biets AL ligger bakom icke-linjära beräkningar eller ligger bakom andra kodnings egenskaper fortfarande behöver analyseras i framtiden. Dessutom kan användas metoden (ii) att jämföra temporala aspekter i befolkningsfrågor vid två efterföljande stegen bearbetning, AL-och MB-utgång (Figur 6). Principalkomponentanalys (PCA) visar att lukt beräkning är förlängd och överleva hela lukt presentation vid PN-nivå medan det i ENs bara lukten av och på uppsättningen var representerade i befolkningen aktiviteten (Figur 6). Därmed SV befolkning nådde sin maximala aktivitet redan vid en tidpunkt då PN aktiviteten är fortfarande under utveckling (jfr Movie 1). <img alt="Figur 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig1highres.jpg" width="400" /> .. Figur 1 Tillverknings tre-kanals mikrotrådelektroder A1) De ändelser av tre kablar är lödda till en IC-stiftskontakt i positioner 11, 13 och 16 A2) Fyra lödöron skruvas på en plexiglas plast bottenplatta.; en minutien stift sätts in i spetsen på en kapillärkolonn av glas, som sedan är fäst vid plastplattan. A3) Den plastplatta är limmad på toppen av ett IC-polig kontakt och den fria änden av varje tråd är lödd till en av den övre lödnings klackarna. &lt;strong&gt; B1) Att förse elektrodhållaren med de fina koppartrådar, har kapillär tas ut en gång till. B2) Basen i hållaren sedan fast i en skräddarsydd anpassning enhet. Tre koppar mikrotrådar ligger på rad längs spåret och fixeras med tejp vid varje ände B3) De parallella mikro trådar limmas ihop med dentala vax och kapillär sätts på plats igen (långa pilar).; de limmade mikrotrådarna är sedan fäst vid kapillären med dentalvax och dess ändar är avskurna (korta pilarna). B4) De tre lösa ändarna av koppartrådarna är lödda till de tre bästa lödöron sålunda föra dem in i elektrisk kontakt med den IC-stiftskontakt. C1) Två helt monterade elektroder kan anslutas till varandra för att användas med en enda huvudsteg. C2) För detta ändamål stiften i en elektrod (vänster, slav) är anslutna via isolerade ledningar till den andra elektroden (höger, master), vilket är anslutet till huvudet scenen; headstage anslutna elektroden kan också samla in synpunkter från en muskel (M17) och referenselektrod (Ref). <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig2highres.jpg" width="500" /> Figur 2. Framställning och permanent elektrod införing i bee hjärnan. A) Ett bi är införd i en plexiglashållare efter immobilisering på is. Antenner med Flagellum (FL) och Scapus (SC) anges. B) Huvudet och antenner fixeras med dentala vax. C) Huvudet kapseln rakat och biet matas med sockervatten. D) Huvudet kapseln öppnas. E) Efter avlägsnande av körtlarna och trakea från toppen av hjärnan kan de olika neuropiles och större landmärken lätt urskiljas. De banor alts anges, tillsammans medett märke där elektroderna är insatt. (MB: Mushroom kropp, AL: Antenn lob, OL: Optisk lob, α: Alpha lob eller vertikal lob, ALT: Antenn lob-tarmkanalen, E1: elektrodinsättningssidan för m-ALT-inspelningar, E2: elektrodinsättningssidan för l-ALT inspelningar). F) Referens (Ref) och muskelelektroder (M17) sätts in i huvudet kapseln genom små hål i nagelbanden eller föreningen ögat. G) Tråd elektroder in i hjärnan på lämpliga platser. H) Efter fastställande av elektroder på plats med hjälp av två komponenter kisel, visar biet fortfarande PER och kan konditioneras (t ex., med hjälp av sockervatten). <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig3highres.jpg" width="500" /> Figur 3. Extracellulär inspelning på två neurala skrifter och enkel extraktion (spik sortering). A </strong&gt;) Schematisk bild av experimentuppställning. Biet är fixerad i en plexiglashållare. Lukt stimulering ges via ett glasrör. Två elektrodskaft spelar in från den utsatta bee hjärnan. B) samtidiga inspelningar från l-och m-ALT PNS (grön och lila spår) visar excitatoriska svar på båda skrifter till en 500 msek lukt stimulering av honung i vattenlösning med en koncentration av 1:100 vid 33 ° C. Varje plottade linjen representerar de differentierade kanaler som färgkodade etiketten från elektrod lödöron i A. Bar:. 50 μV C) Efter spik sortering förfaranden enskilda aktionspotentialer sorteras och färgkodade. Överlagring av de sorterade enheterna illustrerar separationen av vågformerna. D) Spike intervall histogrammet indikerar separationskvaliteten de sorterade enheterna som bevis på adekvat spik sortering. Observera att det inte finns någon spik i enhetens refraktärperiod. E) Två visningar (E1, E2) frånett 3D-klustring av den sorterade enhet med huvudkomponentanalys, som indikerar avståndet för de sorterade enheterna till varandra. Cirklar anger 2,5-faldig Mahalanobis avstånd som liknar SD i rymden och tyder på en betydande differentiering av kluster i huvudkomponentutrymmet F) Färgkodade enheter skildra de aktionspotentialer synliga i en förstoring av tre kanaler från en tarmkanalen inspelning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51750/51750fig3highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig4highres.jpg" width="500" /> Figur 4. Post-inspelning visualisering och 3D-rekonstruktion av inspelningsläge. A) Projektions bild av orto-skivor längs z-axlar med maximal intensitet inriktning av en anterooch bakåtsträvande återfyllning av de uniglomerular projektion nervceller som skjuter ut från AL till MB och LH. Den intracellulära spårämne Microruby (tetramethylrhodamin dextran) sattes in i AL efter inspelningsförsök. Stained glomeruli inuti AL bevis korrekta PN-färgning. B) Projektions vy av orto skivor längs z-axlar med maximal intensitet anpassningen från en färgning av två elektroder med Alexa hydrazid 488 indikerar elektrodplaceringen för den m: ALT (E1, pil ) och L-ALAT (E2, pil). Spårämnet Alexa Hydrazide 488 migrerar till elektroden omgivande vävnad och fläckar elektrodinsättningsstället. Notera den framträdande färgning i AL är en ytlig artefakt. C) 3D-rekonstruktion av de färgade målceller (PNS) och elektroden ingsstället från A, B (höger sida) tillsammans med en schematisk översikt av honeybee olfaktoriska systemet (vänster sidan) med angivande av l-och m-ALAT banor. Obs, endast uniglomerular PN skrifter visas. AN: antennal nerv, AL: Antenn lob, LH: lateral horn, MB: svampkroppen, E1, E2: elektrodinsticksställen, m-ALT: medial Antenn lob-tarmkanalen, l-ALT: lateral Antenn lob-tarmkanalen, c: stjärtfenan, r: rostral, m: medial, l:. lateral <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51750/51750fig4highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Figur 5" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig5highres.jpg" width="300" /> Figur 5. Exempel på luktkoncentration kodning inom den dubbla lukt vägen. A) Värme tomter redovisas svaren på en enda l-ALAT (grön) och enda m-ALT PN (lila) förvärvade samtidigt från en enskild honeybee som svar på luktämnen hexanal öka luktkoncentrationer (från 1: 10 -6 till 1:100). Varje linje är ett genomsnitt av tio försöks Stimulation. Den eldhastighet visas som relativ intensitet förändring som är avfyrningstakt i förhållande till det subtraherade spontan aktivitet. B) Population responslatens av 11 l-och 13 m-ALT PNS från 7 inspelade bin. I varje bee PNS från båda skrifter registrerades samtidigt. Befolkningen responslatens visar en minskande latens med ökande luktkoncentration i PNS från båda skrifter. Lukten svars debut på antennerna på 99 msek registrerades via electroantennograms och subtraheras från PN svars latenser. Observera att vid de lägsta koncentrationerna svaren är för svaga för latens mätningar och därför var, uteslutna. C) Befolknings svar eldhastighet från samma PNS som i B. Med ökande luktkoncentrationen svarsstyrkan ökar. Den l-ALT visar en starkare reaktion styrka. I B är C medelvärde och SD ges. <img alt="Figur 6" fo:content-width = &quot;5in&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51750/51750fig6highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figur 6. Jämföra befolkningsfrågor vid två senare bearbetningsleden längs honungsbiet är lukt väg. Uppgifter har registrerats i 20 djur som stimulerades med 1-hexanol och 2-oktanon. A) Varje rad representerar den falska färgkodade medel eldhastighet av en projektion neuron (PN) beräknas över 10 lukt upprepningar av 1-hexanol. Lukt presentation startar vid tiden 0 och varade i tre sekunder. B) visar samma som i A) men för svamp kropp yttre neuroner (EN). Matrisen visas i A) kan ses som en PN population vektor under lukt stimulering med 1-hexanol. Vi räknade samma typ av befolknings vektor under lukt stimulering med 2-oktanon och använt både vektorer i en principalkomponentanalys (PCA) håller tidsdimensionen. C) De första tre huvudkomponenter (PC1, 2 och 3) varplottas mot varandra för att illustrera den lukt separation i PN ensemble aktivitet vid Antenn lob utgång. Tiden innan lukt debut med svart. Aktivitet under tre sekunders stimulering med 1-hexanol visas i blått. Aktiviteten under stimulering med 2-oktanol visas i rött. Dessutom visar vi 1,5 sekunder (post) av verksamheten efter lukten av uppsättningen av 1-hexanol (ljusblå) och 2-octanonen (rosa). Observera att vid PN ensemble nivå, både lukter som frammanar mycket distinkta banor bosätta sig i en &quot;fast punkt&quot;, som outlasts hela luktstimulering period. Först efter lukt kompensera de banor flytta tillbaka till baslinjen aktivitet utan luktstimulering. D) Samma analys gjordes på SV ensemble nivå representerar aktiviteten vid svampkroppen utgång. Jämfört med PN aktivitet lukter framkalla en mindre distinkt bana. Dessutom en &quot;fast punkt&quot; inte är observerbara. De initialt lukt framkallade banor integrerarmingle med baslinjen aktivitet även om lukten är fortfarande närvarande. Bara lukten offset frammanade en extra bana. <a href="/files/ftp_upload/51750/Movie_R3_Brill_et_al._JoVE.avi" target="_blank">. Film 1</a> Tid beslutade utvärderingen av en lukt framkallad bana efter huvudkomponentanalys av en PN-population vektor (vänster) och en SV befolkning vektor. (höger;. cp Figur 6) De övre delarna omfattar de första tre huvudkomponenter (PC1, 2 och 3) plottas mot varandra. De lägre panelerna visar utvärderingen av PC1, 2 och 3 över tiden. Lukt stimulering präglas av det grå fältet. Alla paneler synkroniserades. Notera att EN befolkningen aktiviteten startar något innan PN befolkningsfrågor, kan ett fenomen som tycks vara contraintuitive men förklaras av anslutningsmöjligheter och egenskaper hos de involverade lager, vilket diskuterats tidigare 1.

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees at JoVE.com

Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

Samtidiga Långfristiga Inspelningar på två Neuronal Processing Stadier i Agera Honeybees

Samtidiga cellulära långsiktiga inspelningar från två olika hjärn neuropiles eller två olika anatomiska områden etablerades honungsbin. Dessa inspelningar tillåter undersökning av tidsmässiga aspekter av neuronal bearbetning i olika områden i hjärnan på den enda neuron samt på ensemblen nivå i en beter djur.

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Automatiserad Sholl Analys av digitaliserade Neuronal Morfologi på flera skalor

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

Multi-elektrod Array Inspelningar av neuronala laviner i Organotypic kulturer

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dubbla Elektrofysiologiska Inspelningar av synaptiskt-framkallade astrogliala och neuronala svar i akut hippocampus skivor

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

En molekylär Avläsning av långsiktigt Olfactory anpassning i<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

Ett förfarande för Implantation Organized arrayer av Microwires för Single-enhet Inspelningar i Awake, uppför djur

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Agarose Microchambers för Långsiktig Kalcium Imaging av<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Samtidig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funktionstest av två näthinnor efter<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Två-foton kalcium Imaging i nervcellernas dendriter i hjärnan skivor

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Optogenetic ångan av hippocampus Theta svängningar i beter sig möss

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Long-term Sensory Conflict in Freely Behaving Mice

Långsiktiga sensorisk konflikt i fritt bete möss

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for ...