Name: live imaging of drosophila larval neuroblasts
Uploaded: 2014-07-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts at JoVE.com

Detta arbete stöddes av uppdelningen av intramural forskning vid National Institutes of Health / NHLBI (1ZIAHL006126) och en Lenfant biomedicinsk postdoktorsstipendium tilldelas DAL.

1. Beredning av Material som behövs till explantation Tredje Instar Larvernas hjärnor <ol><li> Förbered verktyg som krävs för microdissection. <ol><li> Forge två dissekera verktyg (en skalpell och en krok) genom att först placera ett enda dissekera stift i varje stift hållaren. Säkra stiften tätt för hand eller med en tång (Figur 1C). </li><li> Använd ett par gamla tång för att böja en dissekera stift till en cirka 120 ° vinkel. Gör detta under ett dissektionsmikroskop för att se ti...

<ol>
	<li>Truman, J. W., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+patterns+of+neurogenesis+in+the+central+nervous+system+of+Drosophila+melanogaster.">Spatial and temporal patterns of neurogenesis in the central nervous system of Drosophila melanogaster.</a> Developmental Biology. 125, 145-157 (1988).</li><li>Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+markers+for+identified+neuroblasts+and+ganglion+mother+cells+in+the+Drosophila+central+nervous+system.">Molecular markers for identified neuroblasts and ganglion mother cells in the Drosophila central nervous system.</a> Development. 116, 855-863 (1992).</li><li>Lerit, D. A., Smyth, J. T., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+asymmetry+for+proper+fitness,+function,+and+fate.">Organelle asymmetry for proper fitness, function, and fate.</a> Chromosome research. 21, 271-286 (2013).</li><li>Bello, B. C., Izergina, N., Caussinus, E., Reichert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+neural+stem+cell+proliferation+by+intermediate+progenitor+cells+in+Drosophila+brain+development.">Amplification of neural stem cell proliferation by intermediate progenitor cells in Drosophila brain development.</a> Neural development. 3, 5 (2008).</li><li>Bowman, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+suppressors+Brat+and+Numb+regulate+transit-amplifying+neuroblast+lineages+in+Drosophila.">The tumor suppressors Brat and Numb regulate transit-amplifying neuroblast lineages in Drosophila.</a> Developmental Cell. 14, 535-546 (2008).</li><li>Boone, J. Q., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Drosophila+type+II+neuroblast+lineages+containing+transit+amplifying+ganglion+mother+cells.">Identification of Drosophila type II neuroblast lineages containing transit amplifying ganglion mother cells.</a> Dev Neurobiol. 68, 1185-1195 (2008).</li><li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuroblasts:+a+model+for+stem+cell+biology.">Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139, 4297-4310 (2012).</li><li>Savoian, M. S., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis+in+primary+cultures+of+Drosophila+melanogaster+larval+neuroblasts.">Mitosis in primary cultures of Drosophila melanogaster larval neuroblasts.</a> Journal of Cell Science. 115, 3061-3072 (2002).</li><li>Fleming, S. L., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flattening+Drosophila+cells+for+high-resolution+light+microscopic+studies+of+mitosis+in+vitro.">Flattening Drosophila cells for high-resolution light microscopic studies of mitosis in vitro.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 56, 141-146 (2003).</li><li>Buffin, E., Lefebvre, C., Huang, J., Gagou, M. E., Karess, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+Mad2+to+the+kinetochore+requires+the+Rod/Zw10+complex.">Recruitment of Mad2 to the kinetochore requires the Rod/Zw10 complex.</a> Current biology. 15, 856-861 (2005).</li><li>Basto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flies+without+centrioles.">Flies without centrioles.</a> Cell. 125, 1375-1386 (2006).</li><li>Lucas, E. P., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+the+proper+connection+between+the+centrioles+and+the+pericentriolar+matrix+requires+Drosophila+centrosomin.">Maintaining the proper connection between the centrioles and the pericentriolar matrix requires Drosophila centrosomin.</a> J. Cell Biol. 178, 725-732 (2007).</li><li>Basto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+amplification+can+initiate+tumorigenesis+in+flies.">Centrosome amplification can initiate tumorigenesis in flies.</a> Cell. 133, 1032-1042 (2008).</li><li>Conduit, P. T., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cnn+dynamics+drive+centrosome+size+asymmetry+to+ensure+daughter+centriole+retention+in+Drosophila+neuroblasts.">Cnn dynamics drive centrosome size asymmetry to ensure daughter centriole retention in Drosophila neuroblasts.</a> Curr. Biol. 20, 2187-2192 (2010).</li><li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochalasin+D+and+latrunculin+affect+chromosome+behaviour+during+meiosis+in+crane-fly+spermatocytes.">Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes.</a> Chromosome research. 6, 533-549 (1998).</li><li>Rebollo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+unequal+centrosomes+drive+spindle+orientation+in+asymmetrically+dividing+Drosophila+neural+stem+cells.">Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing Drosophila neural stem cells.</a> Dev. Cell. 12, 467-474 (2007).</li><li>Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuroblasts+retain+the+daughter+centrosome.">Drosophila neuroblasts retain the daughter centrosome.</a> Nat. Commun. 2, 243 (2011).</li><li>Januschke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrobin+controls+mother-daughter+centriole+asymmetry+in+Drosophila+neuroblasts.">Centrobin controls mother-daughter centriole asymmetry in Drosophila neuroblasts.</a> Nat Cell Biol. 15, 241-248 (2013).</li><li>Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Live+Cell+Imaging+and+Automated+4D+Analysis+of+Drosophila+Neuroblast+Lineages.">Long-Term Live Cell Imaging and Automated 4D Analysis of Drosophila Neuroblast Lineages.</a> PLoS One. 8, (2013).</li><li>Neumuller, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+self-renewal+in+Drosophila+neural+stem+cells+by+transgenic+RNAi.">Genome-wide analysis of self-renewal in Drosophila neural stem cells by transgenic RNAi.</a> Cell Stem Cell. 8, 580-593 (2011).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Siegrist, S. E., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrinsic+cues+orient+the+cell+division+axis+in+Drosophila+embryonic+neuroblasts.">Extrinsic cues orient the cell division axis in Drosophila embryonic neuroblasts.</a> Development. 133, 529-536 (2006).</li><li>Broadus, J., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrinsic+cues,+intrinsic+cues+and+microfilaments+regulate+asymmetric+protein+localization+in+Drosophila+neuroblasts.">Extrinsic cues, intrinsic cues and microfilaments regulate asymmetric protein localization in Drosophila neuroblasts.</a> Curr. Biol. 7, 827-835 (1997).</li><li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1/dynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control.">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Molecular biology of the cell. 16, 5127-5140 (2005).</li><li>Britton, J. S., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+control+of+the+cell+cycle+in+Drosophila:+nutrition+activates+mitotic+and+endoreplicative+cells+by+distinct+mechanisms.">Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms.</a> Development. 125, 2149-2158 (1998).</li><li>Siller, K. H., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lis1/dynactin+regulates+metaphase+spindle+orientation+in+Drosophila+neuroblasts.">Lis1/dynactin regulates metaphase spindle orientation in Drosophila neuroblasts.</a> Developmental Biology. 319, 1-9 (2008).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical/basal+spindle+orientation+is+required+for+neuroblast+homeostasis+and+neuronal+differentiation+in+Drosophila.">Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila.</a> Dev. Cell. 17, 134-141 (2009).</li><li>Januschke, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interphase+microtubule+aster+is+a+determinant+of+asymmetric+division+orientation+in+Drosophila+neuroblasts.">The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts.</a> J. Cell Biol. 188, 693-706 (2010).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila.">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, 970-977 (2013).</li><li>Rusan, N. M., Akong, K., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+the+model+to+the+test:+are+APC+proteins+essential+for+neuronal+polarity,+axon+outgrowth,+and+axon+targeting.">Putting the model to the test: are APC proteins essential for neuronal polarity, axon outgrowth, and axon targeting.</a> J. Cell Biol. 183, 203-212 (2008).</li><li>Lerit, D. A., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLP+inhibits+the+activity+of+interphase+centrosomes+to+ensure+their+proper+segregation+in+stem+cells.">PLP inhibits the activity of interphase centrosomes to ensure their proper segregation in stem cells.</a> J. Cell Biol. 202, 1013-1022 (2013).</li><li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary.">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138, 2207-2215 (2011).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).</li><li>Rusan, N. M., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+a+novel+centrosome+cycle+in+asymmetric+cell+division.">A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division.</a> J. Cell Biol. 177, 13-20 (2007).</li><li>Martinez-Campos, M., Basto, R., Baker, J., Kernan, M., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+pericentrin-like+protein+is+essential+for+cilia/flagella+function,+but+appears+to+be+dispensable+for+mitosis.">The Drosophila pericentrin-like protein is essential for cilia/flagella function, but appears to be dispensable for mitosis.</a> J. Cell Biol. 165, 673-683 (2004).</li><li>Dix, C. I., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Spd-2+recruits+PCM+to+the+sperm+centriole,+but+is+dispensable+for+centriole+duplication.">Drosophila Spd-2 recruits PCM to the sperm centriole, but is dispensable for centriole duplication.</a> Curr. Biol. 17, 1759-1764 (2007).</li><li>Moutinho-Santos, T., Sampaio, P., Amorim, I., Costa, M., Sunkel, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+localisation+of+the+mitotic+POLO+kinase+shows+a+highly+dynamic+association+with+the+mitotic+apparatus+during+early+embryogenesis+in+Drosophila.">In vivo localisation of the mitotic POLO kinase shows a highly dynamic association with the mitotic apparatus during early embryogenesis in Drosophila.</a> Biol. Cell. 91, 585-596 (1999).</li><li>Megraw, T. L., Kilaru, S., Turner, F. R., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrosome+is+a+dynamic+structure+that+ejects+PCM+flares.">The centrosome is a dynamic structure that ejects PCM flares.</a> J. Cell Sci. 115, 4707-4718 (2002).</li></ol>

Levande cell imaging är en ovärderlig metod för att studera de mekanismer som reglerar ACD av stamceller, differentiering av cellinjer, och morfogenes av komplexa vävnader. Även forskargrupper har historiskt sett används en mängd olika tekniker för att visualisera NB ACD, kan dessa metoder vara generellt delas in i två kategorier som främst skiljer sig åt med avseende på om hjärnvävnaden lämnas intakt eller dissocierade. Imaging dissocierade NBs har sina fördelar. För en, di...

Stamceller upprätthålla en balans av differentiering och självförnyelse för att generera cellulära mångfald under tidig utveckling och ersätta skadade celler i vuxna vävnader. Reglering av denna homeostas bygger både förlust och överexpansion av stamceller befolkningen, vilket kan leda till skadlig vävnadsdegeneration eller tumörbildning. Neuroblaster (NBS) är de i stor utsträckning studerats neurala stamceller av Drosophila centrala nervsystemet (Figur 1A) som första formen under embryonala stadier 1, 2. NBs genomgå upprepade omgångar av asymmetrisk celldelning (ACD) för att producera två ojämnt ödesbestämda celler: en självförnyande stamceller och ett differentierande celler. ACD styrs av centrosomes, icke-membranorganeller som fungerar som de mikrotubuli-organiseringscentrum flesta celler 3. Under mitos, NB centrosomes organisera och orientera den bipolära mitotiska spindeln längs apikal-basala polartetsaxeln. Vid klyvning av dela NB, apikala öde bestämningsfaktorer som anger stamceller öde, och basala öde bestämningsfaktorer som anger differentiering, är uppdelade i de ojämlika dottercellerna. I larver centrala hjärnan, kan två typer av NBs särskiljas genom sitt antal, placering, transkriptionsfaktor uttryck, och cellinje (Figur 1A) 4-6. Typ I NBs är de mest förekommande och cirka 90 av dem befolka de främre och bakre sidorna av varje optik loben av hjärnan 7. Dessa NBs uttrycker transkriptionsfaktor aSENSE (ASE), och de karakteristiskt dela in i en självförnyande NB och en mindre ganglion modercellen (GMC, Figur 1B). Varje GMC genomgår en enda terminal division för att generera två nervceller eller glia (Figur 1B). Däremot har de åtta typ II NBs som befolkar den bakre sidan av varje optisk lob saknar Ase uttryck 5. De genomgår ACDatt tillverka en själv förnya NB och en mellanliggande neurala progenitorceller (INP). Den INP i sin tur delar asymmetriskt tre till fem gånger. Var och en av dessa divisioner leder till regenerering av INP och produktionen av ett enda GMC 4. Kollektivt ger de specifika NB identitet och den tidsmässiga ordningen GMC födelse upphov till den häpnadsväckande neuronal mångfald av den vuxna centrala nervsystemet. Förstå cellbiologi som ligger bakom NB ACD har kraftigt förbättrats genom användning av levande cellavbildningstekniker. Publicerade protokoll som används av forskare till bild levande NBs varierar kraftigt. Totalt sett är dock dessa metoder kan delas in i två allmänna kategorier kännetecknas av huruvida larv hjärnan lämnas intakt eller mekaniskt dissocierade. Båda teknikerna har olika fördelar och nackdelar beroende på forskarens ansökan. Tidiga rapporter avslöjar levande NB celler diviserna inbegriper en viss grad av manuell dissociation av larv hjärnan. Dessa protokoll detalj smetar 8 eller retas isär 9 hjärnan för att växa kortsiktiga primära kulturer av NBS på täckglas. För att förbättra avbildning, är de runda NBs vanligen tillplattad på täckglas med antingen glasskivor 8 eller agaros kuddar 9. Även om tillplattade celler har förbättrad optik, är dessa tekniker ofta leda till NB mitotiska defekter, inklusive regression av klyvnings fåra och oförmågan att fördela mer än en gång. Därför är protokoll som innebär både manuell dissociation och fysisk snedvridning av larver hjärnvävnad i allmänhet endast lämpar sig för mycket kortfristiga (dvs., En cellcykel eller mindre) tillämpningar. Likaså semi-squash eller helt plattas intakta hjärnor mellan objektglas och täck begränsar den tid man kan spendera avbildning ett givet exemplar till en ca 30 min period 10. Trots denna begränsning, this tillvägagångssätt har använts med framgång 11-14. Nya insatser för bild levande dissocierade NBs gräns fysisk snedvridning av de isolerade cellerna. Dessa tekniker är särskilt användbara för applikationer där det är nödvändigt för att upprätthålla cellkulturer för flera celldelningscykler. Exempelvis kan dispergerade celler från manuellt dissocierade hjärnor vara delvis inbäddade i en propp framställd av en blandning av fibrinogen och trombin 15 för långvarig avbildning 16. Alternativt kan explanterade hjärnor vara första kemiskt dissocierade med enzymet kollagenas, nästa manuellt sönder genom upprepad passage genom en pipettspets och därefter ströks ut på poly-L-lysin-belagda glas botten rätter 17, 18. Beläggning glas rätter med antingen fibrinogen eller poly-L-lysin främjar kvarstad och liten spridning av runda celler, föra dem så nära täckglaset som möjligt utan stora fysiska distorsion. I additiom dessa metoder innebär odling NBS i medium som lätt kan bytas ut mot farmakologiska störningsförsök 18. Sammantaget direkt plätering spridda NBs förbättrar avbildningsoptik utan att offra långsiktiga bildhanteringsfunktioner. Nyligen har ett protokoll som beskriver den långsiktiga odling av dissocierade NBs blivit närmare 19. Emellertid är detta tillvägagångssätt inte utan begränsningar. Det finns flera varningar för avbildning levande dissocierade NBs. I ett fält av spridda celler, till exempel, är det svårt att identifiera specifika NB härstamningar som rumsligt är organiserade i den intakta hjärnan 1. Likaså skilja typ I kontra typ II NBs inom dissocierade vävnaden är också en utmaning utan ett uttryck för härstamning spårämnen eller subtyp-specifika transgener, såsom worniu-GAL4, aSENSE-GAL80 20. Även om dessa transgener är ganska bra för vissa tillämpningar, de begränsar forskare till dem transgener expressas under kontroll av UAS förstärkarelement 21 och kräver mer komplexa genetiska system. Studier som rör rumslig eller tidsmässig utveckling av NBs därför kräva in vivo imaging i samband med en intakt vävnad. Vidare studier av dissocierade embryonala NBs indikera att den fysiska kontakten mellan angränsande celler är kritisk för interfas lokalisering av nyckel polaritet faktorer 22, 23. Dessa studier visar helt isolerade NBs upprätthålla inte längre den invarianta mitotiska spindelaxeln. Istället visar dessa celler en mer randomiserade spindelaxeln och breda vinklar av separation mellan successiva GMC knoppar, kanske på grund av förlusten av apikala centro placering 22. Även förhållandet mellan larv NBs och deras angränsande celler inte har studerats, är det värt att överväga att larvstamcellsmikromiljö kan träffa cellpolaritet eller annanbeteenden. För att bibehålla den fysiologiska sammanhang larver NBs, vi bild ACD från hela hjärnor. Med tanke på de begränsningar i samband med bildbehandling dissocierade NBs, har vårt labb och andra etablerade protokoll för bild successiva NB ACD från hela larver hjärnor. Teknik för bild intakta hjärnor ersätta ofta den stela ytan av glaset på ena sidan av odlingskammare med ett flexibelt membran för att förhindra vävnad distorsion eller skada och medger gasutbyte. Vissa metoder innefattar montering explanterade hjärnor i en blandning av insektsodlingsmedium, serum och askorbinsyra med fett kroppar som isolerats från tio larver 24. De isolerade fett organ läggs till, eftersom de utsöndrar en mitogen känd för att stimulera NB celldelning 25. Detta protokoll bevarar integriteten av vävnaden i över 3 timmar och är därför mottaglig för långsiktig avbildning 24, 26-28. Nyligen, ett protokoll som beskriver long sikt avbildning av intakta larv hjärnor i närvaro av askorbinsyra, serum och fett organ har närmare 29. Viktigt, eftersom vävnaden är varken utsatt eller immobiliserade, är detta tillvägagångssätt är mindre användbart för applikationer där odlingsmediet är utbytta (t.ex. läkemedelsstudier, immunotömning osv.). Vårt labb har förenklat hela berget beredningen av levande larver hjärnor för långsiktig avbildning 30, 31. Den största fördelen med våra protokoll över andra är dess enkelhet: våra observationer indikerar varken serum, askorbinsyra, insulin, eller fett organ är nödvändiga tillsatser till bild successiva rundor av NB ACD. Även tillsatser, såsom insulin, har varit till nytta för långvarig avbildning av stamceller divisioner 32 och kollektiv cell migration i Drosophila äggstockarna 33, de verkar vara umbärliga för NB ACD, som vår bildalstringsmedium består av en enkel blandning av standard insektscellodlingsmedium kompletterat med antibiotisk-antimykotisk att förhindra förorening. Genom att använda återanvändningsbara gas-permeabla eller glas botten kultur rätter, har vi kunnat upprätthålla flera omgångar av varandra NB ACDs. Samma explanterade prov kan lätt användas för immunofluorescens och andra förfaranden med fast vävnad. I detta protokoll, vi detalj dissektion av intakta larv hjärnor, liksom beredningen av hjärnor för både live och fast analys.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="851">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Lumox Tissue Culture Dish 50X12 mm</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">94.6077.410</td>
			<td style="width:167px;">A reusable culture dish with a gas-permeable and optically clear film base.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Schneider&#39;s S2 Medium</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15240-062</td>
			<td>A supplement containing penicillin (10,000 U/mL), streptomycin (10,000 mg/mL), and amphotericin B (25 mg/mL) that is added to Schneider&#39;s S2 media to prevent bacterial and fungal contamination.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Glass coverslips, #1.5 22X22 mm</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-541-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Halocarbon oil 700</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H8898</td>
			<td>A high viscosity inert oil that is clear and colorless.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">pair of nickel-plated pin holders, 17 cm long</td>
			<td style="width:185px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">26018-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Minutien dissecting pins</td>
			<td style="width:185px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">pair of Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:185px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Dissecting needle/probe with plastic handle</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-965-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Syringe filter, 0.22 mm pore size</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">09-719A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Syringe 5 mL&#160;</td>
			<td style="width:185px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">plastic transfer pipet</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S30467-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:380px;">paraformaldehyde, 32% EM-grade</td>
			<td style="width:185px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">15714</td>
			<td>CAUTION: Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood. Follow MSDS guidelines for safe handling.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">DAPI (4&#39;, 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td>A dye that labels DNA and is excited by UV light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Aqua/PolyMount; Polysciences, Inc.</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">18606-20</td>
			<td>A water-soluble mounting medium.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of drosophila larval neuroblasts

Stamceller delar asymmetriskt för att generera två avkomma celler med olika öde potential: en självförnyande stamceller och ett differentierande celler. Med tanke på deras betydelse för utveckling och sjukdom, att förstå de mekanismer som styr asymmetriska stamcells division har en robust område av studien. Eftersom de är genetiskt lätthanterlig och genomgår successiva celldelning ungefär en gång i timmen, stamcellerna i Drosophila centrala nervsystemet, eller neuroblaster, är oumbärliga modeller för studier av stamceller division. Om 100 neurala stamceller är placerade nära ytan av vardera av de två larvhjärnlober, vilket gör detta modellsystem särskilt användbara för levande avbildning mikroskopiska studier. I detta arbete, granskar vi flera metoder som ofta används för att visualisera stamcells divisioner, och vi itu med de relativa fördelarna och nackdelarna med de tekniker som anställer dissocieras kontra intakta hjärnvävnader. Vi också detalj vår simplifIED protokoll som används för att explantera hela hjärnor från tredje stadiet larver för levande cell imaging och fasta applikationer analys.

Live avbildning har belyst ett antal mekanismer som reglerar NB ACD. Före bild förvärv, är det nödvändigt att bestämma de optimala avbildningsförhållanden. Det är nödvändigt att balansera ram fånga takt med längden på levande cell imaging. För fina cellulär analys, till exempel ökad tids och optisk upplösning kan krävas. När visualisera ett enda NB cellcykeln (Figur 4A), kan den takt som bilderna tas ökas utan att införa fotoskador. Vanligtvis kan enstaka celldelningshändelser ö...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts at JoVE.com

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Live avbildning av<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvneuroblaster

Detta protokoll detaljer en strömlinjeformad metod som används för att utföra levande cell imaging i samband med en intakt larver hjärna. Levande cell imaging metoder är ovärderlig för studier av asymmetriska neurala stamcells divisioner samt andra neurogena och utvecklingsprocesser, konsekvent avslöja mekanismer som tidigare förbisetts.

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

Resonansspektroskopi av levande Drosophila melanogaster Med hjälp av Magic Angle Spinning

High-Resolution Magic Angle Spinning (HRMAS) proton magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS) is a novel non-destructive technique that improves spectral ...

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Visualisering av Larvernas segment nerver i 3 RD Instar Drosophila Larvernas Förberedelser

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

In vivo Visualisering av Synaptic Blåsor Inom Drosophila Larvernas segment Axoner

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell imaging av sensoriska celler orgel Precursor i intakt Drosophila Puppor

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Dissektion och Immunohistokemi av larver, pupal och vuxna<em&gt; Drosophila</em&gt; Näthinnor

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

Funktionell analys av Larv Feeding Circuit i Drosophila</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Varför kvantifiering Matters: karakterisering av fenotyper vid<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvernas Neuromuskulära förbindelsen

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Använda Linear Agarose kanaler att studera<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvernas Genomsökning Behavior

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

Single-cell Resolution fluorescens lever avbildning av Drosophila dygnsrytm klockor i Larval hjärnan kultur

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

Spåra Drosophila Larval beteende som svar på Optogenetic stimulering av lukt nervceller

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...