Name: high-throughput assay to phenotype salmonella enterica typhimurium association, invasion, and replication in macrophages
Uploaded: 2014-08-11T18:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages at JoVE.com

Dette projekt blev til dels understøttet af et tilskud til National Institutes of Health NIAID (til AJB og LGA, R01 AI076246). Salmonella-mutant samling blev delvist støttet af National Institutes of Health tilskud (for MM, U01 A152237-05, R01 AI07397-01, R01 AI039557-11 og R01 AI075093-01), dels af National Institutes of Health tilskud (for HAP, R21 AI083964-01, 1R0 1AI083646-01, 1R56AI077645, R01 AI075093). Vi takker Steffen Prowollik for replikaudpladning og bekræfter mutanter i samlingen.

1. Murin makrofag RAW264.7 Cellekultur <ol><li> Grow lavpassage antal murine makrofag celler RAW264.7 (ATCC ® Nummer TIB-71) i en T-75 cellekultur kolbe ventileret filterhætten i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) , 0,5% NaHCO3 og 1% 100x ikke-essentielle aminosyrer (NEAA) ved 37 ° C, i en 5% CO2-inkubator. </li><li> Når cellerne når en 60-80% sammenflydning i kolben, skal du bruge en celle skraber til at høste celler og tælle cel...

<ol>
	<li>Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonellae+interplay+with+host+cells.">Salmonellae interplay with host cells.</a> Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).</li><li>Mandell, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+intraleukocytic+bacteria+and+antibiotics.">Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics.</a> The Journal of clinical investigation. 52, 1673-1679 (1973).</li><li>Elsinghorst, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+invasion+by+gentamicin+resistance.">Measurement of invasion by gentamicin resistance.</a> Methods Enzymol. 236, 405-420 (1994).</li><li>Elsinghorst, E. A., Weitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+invasion+and+adherence+directed+by+the+enterotoxigenic+Escherichia+coli+tib+locus+is+associated+with+a+104-kilodalton+outer+membrane+protein.">Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic Escherichia coli tib locus is associated with a 104-kilodalton outer membrane protein.</a> Infect Immun. 62, 3463-3471 (1994).</li><li>Behlau, I., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PhoP-repressed+gene+promotes+Salmonella+typhimurium+invasion+of+epithelial+cells.">A PhoP-repressed gene promotes Salmonella typhimurium invasion of epithelial cells.</a> J Bacteriol. 175, 4475-4484 (1993).</li><li>Hueck, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+typhimurium+secreted+invasion+determinants+are+homologous+to+Shigella+Ipa+proteins.">Salmonella typhimurium secreted invasion determinants are homologous to Shigella Ipa proteins.</a> Mol Microbiol. 18, 479-490 (1995).</li><li>Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+epithelial+cells+with+Salmonella+enterica.">Infection of epithelial cells with Salmonella enterica.</a> Methods Mol Biol. 431, 201-211 (2008).</li><li>Foster, J. W., Spector, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Salmonella+survive+against+the+odds.">How Salmonella survive against the odds.</a> Annu Rev Microbiol. 49, 145-174 (1995).</li><li>Edwards, A. M., Massey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+human+cells+by+a+bacterial+pathogen.">Invasion of human cells by a bacterial pathogen.</a> Journal of visualized experiments JoVE. 10, (2011).</li><li>Molinari, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+played+by+the+group+A+streptococcal+negative+regulator+Nra+on+bacterial+interactions+with+epithelial+cells.">The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells.</a> Mol Microbiol. 40, 99-114 (2001).</li><li>Van der Velden, A. W., Lindgren, S. W., Worley, M. J., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+pathogenicity+island+1-independent+induction+of+apoptosis+in+infected+macrophages+by+Salmonella+enterica+serotype+typhimurium.">Salmonella pathogenicity island 1-independent induction of apoptosis in infected macrophages by Salmonella enterica serotype typhimurium.</a> Infect Immun. 68, 5702-5709 (2000).</li><li>Santos, R. L., Zhang, S., Tsolis, R. M., Baumler, A. J., Adams, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+and+molecular+characterization+of+Salmonella+typhimurium+infection+in+neonatal+calves.">Morphologic and molecular characterization of Salmonella typhimurium infection in neonatal calves.</a> Vet Pathol. 39, 200-215 (2002).</li><li>Lawhon, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+SPI-1+secreted+effectors+in+acute+bovine+response+to+Salmonella+enterica+Serovar+Typhimurium+a+systems+biology+analysis+approach.">Role of SPI-1 secreted effectors in acute bovine response to Salmonella enterica Serovar Typhimurium a systems biology analysis approach.</a> PLoS One. 6, e26869 (2011).</li><li>Drecktrah, D., Knodler, L. A., Galbraith, K., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Salmonella+SPI1+effector+SopB+stimulates+nitric+oxide+production+long+after+invasion.">The Salmonella SPI1 effector SopB stimulates nitric oxide production long after invasion.</a> Cell Microbiol. 7, 105-113 (2005).</li></ol>

Gentamicin beskyttelse analyse er almindeligt anvendt til at undersøge invasion og replikation af intracellulære bakterielle patogener inden værtscelle, og det er især et vigtigt biologisk redskab til at studere patogener, såsom Salmonella, hvis invasion er forudsætningen trin for at etablere infektion 1. Standarden Gentamicin beskyttelse assay i Salmonella forskersamfund er implementeret i 24-brønds dyrkningsskål 5. Selvom anvendelse af 48 eller endda 96-brønds plader bl...

Nontyphoidal Salmonella er vigtige årsager til enteriske sygdomme i alle hvirveldyr. Salmonellose hos mennesker er blandt de øverste bakterielle fødevarebårne sygdomme 1. Karakterisering af de molekylære mekanismer, der ligger til grund for interaktioner af Salmonella med deres dyreværter opnås primært gennem studiet af Salmonella enterica serotype Typhimurium (STM) i vævskultur og dyremodeller for infektion. Opsamling indsigt i STM-vært interaktioner vil hjælpe os med at forstå, hvordan Salmonella overleve og vokse inde i værtsceller. Den første udfordring i at studere disse interaktioner er at identificere så mange deltagende faktorer som muligt fra både vært og patogen, men disse bestræbelser er i høj grad hindres af de betydelige vanskeligheder ved at håndtere to uafhængige komplekse biologiske systemer samtidigt, dvs vært og Salmonella, under fysiologiske betingelser. Derudover store repertoire af Salmonella og værtsgener potentielt koder for faktorer involveret i værts interaktioner kræver high-throughput biologisk platform til at håndtere denne udfordring. En modificeret, standardiseret assay fænotype Salmonella forening, invasion og replikation i makrofager med high-throughput kapacitet blev udviklet for at undersøge et stort sæt af gener sandsynligvis deltager i Salmonella -host interaktioner. Gentamicin beskyttelse assay blev udviklet i 1973 2, men blev først grundigt ved Elsinghorst beskrevet i 1994 3,4. Det er nu blevet en standard værktøj til at studere mange intracellulære bakterielle patogener ex vivo, herunder Salmonella 5,6. Internaliserede bakterier undgå at blive dræbt af nogle antibiotika, ligesom gentamicin, der ikke kan trænge eukaryote celler 3. Ved at drage fordel af dette fænomen, gentamicin beskyttelse assayet måler overlevelse og vækst af intracellulært bacterial patogener. Tre begivenheder i løbet af infektion, dvs sammen med eukaryote celler, invasion og replikation, kan vurderes for intracellulære bakterielle patogener, baseret på tidsintervallet mellem infektion, gentamicin behandling, og yderligere inkubation (figur 1). Eukaryote cellelinier giver et fysiologisk miljø, der er mindre kompleks end relevante dyremodeller for vært-patogen interaktionsundersøgelser. Gentamicin beskyttelse assayet er et godt udgangspunkt for at studere STM-vært interaktioner, men standard-assay i en 24-brønds dyrkningsplade har lav gennemløb kapacitet. Computational analyse af in vivo-datasæt identificeret 149 Salmonella genprodukter, der er forudsagt at interagere med cirka 300 vært genprodukter (upublicerede data). Standarden Gentamicin beskyttelse analysen ikke har kapacitet til at fænotype dette antal mutanter effektivt. I Addition kan Gentamicin beskyttelse assayet teoretisk detektere invasionen af ​​selv en enkelt bakterie. På grund af denne iboende følsomhed, rådata er modtagelige for tekniske forskelle når gentaget på forskellige tidspunkter. De interne kontroller og relativ præsentation af data efter normalisering er afgørende for en meningsfuld fortolkning af resultaterne. På baggrund af disse overvejelser blev en modificeret, standardiseret Gentamicin beskyttelse assay udviklet til at forbedre test kapacitet og øge præcision. Følgende protokol er detaljeret og illustreret for at udføre den modificerede Gentamicin beskyttelse under anvendelse af 96-brønds dyrkningsskåle og den murine makrofag RAW264.7 cellelinie. Sammenlignet med standard-protokol i 24-brønds dyrkningsskåle, den modificerede protokol har følgende fordele: 1) Anvendelse af 96 brønde dyrkningsskåle tillader op til 10 forskellige mutantstammer at fænotypebestemmes herunder interne positive og negative kontroller med tilstrækkelig statistisk styrke;2) variation i resultaterne er reduceret betydeligt, fordi de mutante stammer testes i samme dyrkningsskål og på samme tid; 3) Anvendelsen af ​​multikanalpipetter øger hastigheden og operatør træthed reducere. Endelig sammenligner til 24 brønds dyrkningsskåle, blev bekymringer færre værtsceller per brønd i 96-brønds dyrkningsplade løses gennem protokol optimering og standardisering. Sammenfattende modificerede, standardiserede analyse til in vitro-fænotype Salmonella eller andre bakterielle forening, invasion og replikation i fagocytceller øger præcision og opnår high-throughput kapacitet mens operatør træthed reducere.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:173px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:173px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:173px;">11965</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:173px;">HyClone</td>
			<td style="width:173px;">SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">T-75 cell culture flask vented filter cap</td>
			<td style="width:173px;">Nest Biotechnology</td>
			<td style="width:173px;">708003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">100X Non-Essential Amino Acids</td>
			<td style="width:173px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:173px;">11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Cell scraper</td>
			<td style="width:173px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:173px;">353086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">96-well cell culture plate</td>
			<td style="width:173px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:173px;">3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">Luria-Bertani (LB) broth</td>
			<td style="width:173px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:173px;">3002-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td style="width:173px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:173px;">352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">PBS pH7.4 (1x)</td>
			<td style="width:173px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:173px;">10010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">T-8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Kanamycin solution</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">K0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Gentamicin solution</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">G1272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:173px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:173px;">25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput assay to phenotype salmonella enterica typhimurium association, invasion, and replication in macrophages

Salmonella-arter er zoonotiske patogener og førende årsager til fødevarebårne sygdomme hos mennesker og husdyr 1. Er vigtigt at belyse den molekylære patogenese salmonellainfektion forstå de mekanismer, der ligger til grund Salmonella -host interaktioner. Gentamicin beskyttelse assay til fænotype Salmonella forening, invasion og replikation i fagocytceller blev tilpasset til at tillade højkapacitetsscreening at definere roller deletionsmutanterne Salmonella enterica serotype Typhimurium i værts interaktioner ved hjælp af RAW 264,7 murine makrofager. Ifølge denne protokol, variansen i målingerne er betydeligt reduceret i forhold til standard-protokollen, fordi vildtype-og multiple mutantstammer kan testes på samme dyrkningsskål og på samme tid. Anvendelsen af ​​multikanalpipetter forøger gennemløbet og forbedrer præcision. Endvidere bekymringer vedrørende anvendelse af mindre host brønd i 96-brønds dyrkningsskål blev behandlet. Her blev protokollen af den modificerede in vitro Salmonella invasion under anvendelse fagocytceller anvendt med succes til fænotype 38 individuelle Salmonella deletionsmutanterne for foreningen, invasion og intracellulær replikation. In vitro fænotyper præsenteres, hvoraf nogle senere blev bekræftet at have in vivo fænotyper i en dyremodel. Således, at den modificerede, standardiserede analyse fænotype Salmonella forening, invasion og replikation i makrofager med high-throughput kapacitet kunne udnyttes mere bredt for at studere bakteriel-vært interaktioner.

Se repræsentative resultater (figur 2), efter at dataene er plottet baseret på det ændrede fagocytisk celle invasion assay. Dataene omfatter fem forskellige stammer, WT, ΔinvA, ΔphoP, mutant A, og mutant B. Δ INVA, der er kendt for at være defekt invasion, og ΔphoP kendt for at være defekt for replikation 8, anvendes som positive kontroller til at vurdere eksperimentelle gyldighed . Faktisk, i den modificerede invasion assay en ΔinvA mutant intern...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages at JoVE.com

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

En høj-throughput assay til in vitro-fænotype salmonella eller andre bakterielle forening, invasion og replikation i fagocytiske celler med højt gennemløb kapacitet blev udviklet. Metoden blev anvendt til at vurdere Salmonella gen knockout mutantstammer for deres Involvering i værtspatogene interaktioner.

Højkapacitetsforskning Assay til Fænotype<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Association, Invasion, og replikering i makrofager

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

Current commercial PCRs tests for identifying Salmonella target genes unique to this genus.  However, there are two species, six subspecies, and over ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Kvantitativ Højkapacitetsforskning encellede cytotoksicitetsassay for T-celler

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

En protokol til at inficere<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Med<em&gt; Salmonella typhimurium</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Kvantificering af Cytosolisk vs. vakuolær<em&gt; Salmonella</em&gt; I Primære Makrofager af Differential Permeabilisering

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging i<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

En Fluorescens-baserede lymfocyt Assay Egnet til high-throughput screening af små molekyler

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

En High-throughput Kompatibel Assay at evaluere Drug Effekt mod makrofag passeres<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Celle-fri biokemiske fluorometriske enzymatisk Assay for høj overførselshastighed måling af Lipid fedtstoffer i High Density Lipoprotein

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolering af Salmonella typhimurium-indeholdende Phagosomes fra makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

En høj overførselshastighed Platform for Screening af Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...