Name: high-throughput assay to phenotype salmonella enterica typhimurium association, invasion, and replication in macrophages
Uploaded: 2014-08-11T18:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages at JoVE.com

Этот проект был поддержан частично грантом на Национальных Институтов здравоохранения NIAID (для AJB и LGA, R01 AI076246). Мутант коллекция Salmonella была частично поддержана Национальными Институтами грантов здравоохранения (для ММ, U01 A152237-05, R01 AI07397-01, R01 AI039557-11 и R01 AI075093-01), частично Национальными Институтами грантов здравоохранения (для ГАП, R21 AI083964-01, 1R0 1AI083646-01, 1R56AI077645, R01 AI075093). Мы благодарим Штеффен Prowollik для реплик и подтверждения мутантов в коллекции.

1 Мышиные макрофагов RAW264.7 Культура клеток <ol><li> Grow с низким числом пассажей мышиных макрофагов, RAW264.7 (АТСС номер ®, TIB-71) в Т-75 колбу для культивирования клеток вентилируемые крышки фильтра в Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) , 0,5% NaHC...

<ol>
	<li>Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonellae+interplay+with+host+cells.">Salmonellae interplay with host cells.</a> Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).</li><li>Mandell, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+intraleukocytic+bacteria+and+antibiotics.">Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics.</a> The Journal of clinical investigation. 52, 1673-1679 (1973).</li><li>Elsinghorst, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+invasion+by+gentamicin+resistance.">Measurement of invasion by gentamicin resistance.</a> Methods Enzymol. 236, 405-420 (1994).</li><li>Elsinghorst, E. A., Weitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+invasion+and+adherence+directed+by+the+enterotoxigenic+Escherichia+coli+tib+locus+is+associated+with+a+104-kilodalton+outer+membrane+protein.">Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic Escherichia coli tib locus is associated with a 104-kilodalton outer membrane protein.</a> Infect Immun. 62, 3463-3471 (1994).</li><li>Behlau, I., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PhoP-repressed+gene+promotes+Salmonella+typhimurium+invasion+of+epithelial+cells.">A PhoP-repressed gene promotes Salmonella typhimurium invasion of epithelial cells.</a> J Bacteriol. 175, 4475-4484 (1993).</li><li>Hueck, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+typhimurium+secreted+invasion+determinants+are+homologous+to+Shigella+Ipa+proteins.">Salmonella typhimurium secreted invasion determinants are homologous to Shigella Ipa proteins.</a> Mol Microbiol. 18, 479-490 (1995).</li><li>Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+epithelial+cells+with+Salmonella+enterica.">Infection of epithelial cells with Salmonella enterica.</a> Methods Mol Biol. 431, 201-211 (2008).</li><li>Foster, J. W., Spector, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Salmonella+survive+against+the+odds.">How Salmonella survive against the odds.</a> Annu Rev Microbiol. 49, 145-174 (1995).</li><li>Edwards, A. M., Massey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+human+cells+by+a+bacterial+pathogen.">Invasion of human cells by a bacterial pathogen.</a> Journal of visualized experiments JoVE. 10, (2011).</li><li>Molinari, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+played+by+the+group+A+streptococcal+negative+regulator+Nra+on+bacterial+interactions+with+epithelial+cells.">The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells.</a> Mol Microbiol. 40, 99-114 (2001).</li><li>Van der Velden, A. W., Lindgren, S. W., Worley, M. J., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+pathogenicity+island+1-independent+induction+of+apoptosis+in+infected+macrophages+by+Salmonella+enterica+serotype+typhimurium.">Salmonella pathogenicity island 1-independent induction of apoptosis in infected macrophages by Salmonella enterica serotype typhimurium.</a> Infect Immun. 68, 5702-5709 (2000).</li><li>Santos, R. L., Zhang, S., Tsolis, R. M., Baumler, A. J., Adams, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+and+molecular+characterization+of+Salmonella+typhimurium+infection+in+neonatal+calves.">Morphologic and molecular characterization of Salmonella typhimurium infection in neonatal calves.</a> Vet Pathol. 39, 200-215 (2002).</li><li>Lawhon, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+SPI-1+secreted+effectors+in+acute+bovine+response+to+Salmonella+enterica+Serovar+Typhimurium+a+systems+biology+analysis+approach.">Role of SPI-1 secreted effectors in acute bovine response to Salmonella enterica Serovar Typhimurium a systems biology analysis approach.</a> PLoS One. 6, e26869 (2011).</li><li>Drecktrah, D., Knodler, L. A., Galbraith, K., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Salmonella+SPI1+effector+SopB+stimulates+nitric+oxide+production+long+after+invasion.">The Salmonella SPI1 effector SopB stimulates nitric oxide production long after invasion.</a> Cell Microbiol. 7, 105-113 (2005).</li></ol>

Анализ защиты Гентамицин широко используется для изучения вторжение и репликации внутриклеточных бактериальных патогенов внутри клетки-хозяина, и это особенно важным биологическим инструментом для изучения патогенов, как сальмонелла, чьи вторжение является предпосылкой шаг д?...

Nontyphoidal Salmonella являются важными причинами кишечных заболеваний у всех позвоночных. Сальмонеллез у человека является одним из главных бактериальных болезней пищевого происхождения 1. Характеристика молекулярных механизмов, лежащих в основе взаимодействия Salmonella со своими хозяевами животных в основном достигается через изучение Salmonella enterica серотипа Typhimurium (СТМ) в культуре ткани и животных моделях инфекции. Получение понимание в STM-хост взаимодействий поможет нам понять, как Salmonella выжить и развиваться внутри клеток-хозяев. Первая задача в изучении этих взаимодействий является определить, как много участвующих факторов, а от хозяина и патогена, но эти усилия в значительной степени препятствуют значительные трудности дело с двумя независимыми сложных биологических систем одновременно, то есть, хост и сальмонеллы, при физиологических условиях. Кроме того, большое Repertoire сальмонеллы и гены хозяина потенциально кодирующие факторы, участвующие в принимающих взаимодействий требуют высокой пропускной биологическую платформу для решения этой проблемы. Изменение, стандартные тесты на фенотип Salmonella ассоциации, вторжение и репликации в макрофагах с высокой пропускной способностью был разработан для изучения большой набор генов, вероятно, занимающихся Salmonella -host взаимодействий. Анализ защиты гентамицин был разработан в 1973 году 2, но впервые была тщательно описывается Elsinghorst в 1994 3,4. Теперь это стало стандартным инструментом для изучения многих внутриклеточных бактериальных патогенов экс естественных условиях, в том числе сальмонеллы 5,6. Интернализованная бактерии избегают гибели от некоторых антибиотиков, таких как гентамицин, что не могут проникнуть эукариотических клеток 3. Воспользовавшись этим явлением, анализ защиты гентамицин измеряет выживания и роста внутриклеточных баcterial патогены. Три события в период инфекции, т.е. связь с эукариотических клеток, инвазии и репликации, может быть оценена для внутриклеточных бактериальных патогенов на основе временного интервала между инфекции, лечения гентамицин, и дальнейшей инкубации (рисунок 1). Эукариотической клетки линии обеспечивают физиологическую среду, которая является менее сложным, чем соответствующих животных моделях для исследования взаимодействия хост-патогена. Защита анализа Гентамицин является подходящей платформой для изучения СТМ-хост взаимодействий, но стандарт анализа в культуральной чашке 24-луночного имеет низкую пропускную способность. Автоматическая обработка естественных условиях наборов данных в идентифицированы 149 генов сальмонеллы продукты, которые, по прогнозам, взаимодействовать с приблизительно 300 генов хозяина продукции (неопубликованные данные). Стандарт гентамицин анализ защиты не имеют возможности фенотип это число мутантов эффективно. В Additионный, анализ защиты гентамицин теоретически может обнаружить вторжение даже одной бактерии. Из этой присущей чувствительности, необработанные данные восприимчивы к техническим дисперсий, когда повторяется в разные моменты времени. Внутренние органы управления и относительная представление данных после нормализации имеют важное значение для содержательной интерпретации результатов. Учитывая эти соображения, изменение, стандартизированная гентамицин защиты был разработан анализ, чтобы добавлять потенциала по тестированию и повышают точность. Следующий протокол подробно и показано для выполнения измененного гентамицина защиты анализа, используя блюда культуры 96-а и мышиный линию макрофагов RAW264.7 клеток. По сравнению со стандартным протоколом в чашки для культивирования с 24 лунками, модифицированный протокол имеет следующие преимущества: 1) Использование тарелки культуры 96-а позволяет до 10 различных мутантных штаммов, которые будут phenotyped в том числе внутренних положительных и отрицательных контролей с достаточной статистической мощности;2) Дисперсия результатов значительно снижается, потому что мутантные штаммы тестируют в той же культуральной чашке, и в то же время; 3) Использование многоканальных пипеток увеличивает пропускную при одновременном снижении утомляемости оператора. Наконец, по сравнению с блюдами культуры 24-а, опасения менее клетках-хозяевах на лунку в культуральной чашке 96-а были адресованы путем оптимизации протокола и стандартизации. Таким образом, изменение, стандартные тесты, чтобы в пробирке фенотипа Salmonella или другой бактериальной ассоциации, инвазию и репликации в фагоцитирующих клеток повышает точность и достигает высокой пропускной способности при одновременном снижении усталости оператора.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:173px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:173px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:173px;">11965</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:173px;">HyClone</td>
			<td style="width:173px;">SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">T-75 cell culture flask vented filter cap</td>
			<td style="width:173px;">Nest Biotechnology</td>
			<td style="width:173px;">708003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">100X Non-Essential Amino Acids</td>
			<td style="width:173px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:173px;">11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Cell scraper</td>
			<td style="width:173px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:173px;">353086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">96-well cell culture plate</td>
			<td style="width:173px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:173px;">3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">Luria-Bertani (LB) broth</td>
			<td style="width:173px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:173px;">3002-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td style="width:173px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:173px;">352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">PBS pH7.4 (1x)</td>
			<td style="width:173px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:173px;">10010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">T-8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Kanamycin solution</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">K0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Gentamicin solution</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">G1272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:173px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:173px;">25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput assay to phenotype salmonella enterica typhimurium association, invasion, and replication in macrophages

Salmonella виды патогенов и ведущими причинами продуктами болезней у людей и скота 1. Понимание механизмов, лежащих в основе сальмонеллы -host взаимодействия важны для выяснения молекулярного патогенеза сальмонеллеза. Анализ защиты гентамицин фенотипу Salmonella ассоциации, вторжение и репликации в фагоцитирующих клеток был адаптирован, чтобы позволить высокой скрининг для определения роли мутантов с делецией Salmonella enterica серотипа Typhimurium в принимающих взаимодействий с использованием RAW 264,7 мышиных макрофагов. Согласно этому протоколу, дисперсию измерений существенно снижается по сравнению со стандартным протоколом, так как дикого типа, и множество мутантные штаммы могут быть проверены в той же культуральной чашке, и в то же время. Использование многоканальных пипеток увеличивает пропускную способность и повышает точность. Кроме того, опасения в связи с использованием менее хоул клеток на лунку в культуральной чашке 96-а были адресованы. Вот, протокол модифицированного пробирке Salmonella вторжения анализа при помощи фагоцитоза клетки был успешно применен для фенотип 38 индивидуальных Salmonella делеционных мутантов для объединения, вторжения и внутриклеточной репликации. В фенотипы в пробирке представлены, некоторые из которых впоследствии были подтверждены, чтобы иметь в естественных фенотипов в животной модели. Таким образом, изменение, стандартные тесты на фенотип Salmonella ассоциации, вторжение и репликации в макрофагах с высокой пропускной мощности могут быть использованы в более широком смысле для изучения бактериально-хост взаимодействий.

Смотреть репрезентативные результаты (Рисунок 2) после того, как данные представлены на основе модифицированного фагоцитарной вторжения клеток анализа. Данные включают в себя пять различных штаммов, Вт, ΔinvA, ΔphoP, мутант A, и мутант Б. Δ Инва, как известно, неисправен дл?...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages at JoVE.com

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Была разработана с высокой пропускной анализ, чтобы в пробирке фенотипа сальмонеллами или другой бактериальной ассоциации, вторжения и репликации в фагоцитов с высокой пропускной способностью. Метод был использован для оценки Salmonella ген нокаут мутантных штаммов для их вовлеченности в хозяин-патоген взаимодействий.

Высокая пропускная Анализ фенотипу<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Ассоциация, Нашествие, и репликации в макрофагах

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

Allelotyping ПЦР для выявления Salmonella enterica Сероваров Enteritidis, Хадар, Гейдельберг, и Typhimurium

Current commercial PCRs tests for identifying Salmonella target genes unique to this genus.  However, there are two species, six subspecies, and over ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Количественные высокой пропускной Single-клеточной цитотоксичности анализа для Т-клеток

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

Протокол заразить<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; С<em&gt; Сальмонелла Typhimurium</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Количественное Цитозольные против вакуолярной<em&gt; Сальмонелла</em&gt; В первичных макрофагах дифференциальной проницаемости

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Высокая пропускная способность гена Tagging в<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

Флуоресцентным на основе анализа Лимфоцит Подходит для высокопроизводительного скрининга малых молекул

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

Высокая пропускная способность Совместимость анализа для оценки эффективности против наркотиков пассировать макрофагов<em&gt; Микобактерии туберкулеза</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Ячейки бесплатно биохимических флуориметрический ферментативные Assay высок объём измерения перекисного окисления липидов в липопротеинов высокой плотности

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Изоляция Salmonella typhimurium-содержащих Phagosomes от макрофагов

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Высок объём платформы для проверки Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...