Name: a video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture
Uploaded: 2014-08-11T18:30:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture at JoVE.com

Koo BK og Mustata RC understøttes af Sir Henry Dale Fellowship fra Wellcome Trust og Andersson-Rolf A er støttet af Medical Research Council (MRC). Fink J er støttet af Wellcome Trust 4-årigt ph.d.-programmet.

Alle mus, der anvendes i den følgende protokol blev holdt i specifikke patogenfrie betingelser, og alle procedurer blev udført i henhold til Det Forenede Kongerige hjemmekontor regler. 1. Fremstilling <ol><li> Forbered medier 1 time forud for brug (se tabel 1 og liste over materialer for flere detaljer) og præ-varme i et 37 ° C vandbad mindst 10 minutter før brug. </li></ol> 2. Dyrkning af tyndtarmen (SI) Organoids BEMÆRK: Medmindre andet er angivet, er alle inkubationer udføres ved 37 ° C, 5% CO2 i en fugtig inkubator. Udstyr og reagenser kommer i kontakt med levende celler, skal være steril. Opvarmningsfunktion vævskulturpladen er vigtigt, da det forhindrer kælderen matrix (Matrigel eller BME) falder i at sprede ud under såning. Desuden bør kælderen matrix holdes på is hele tiden. Opbevar ved -20 ° C og optøningpå is før anvendelse. <ol><li> Isolering af Cryptocoryner <ol><li> Til isolering af tyndtarmen ofre musen i henhold til de nationale regler og bestemmelser, og derefter placere dyret på ryggen og vaske maven med 70% ethanol. Udfør en langsgående midtlinjeincision fra lysken til brystbenet. Først skære huden og det subkutane væv. Fjern tyndtarmen fra coecum til maven. Krypter isoleret fra duodenum, jejunum og ileum kan anvendes til organoide kultur. </li><li> Vask isoleret tyndtarmen med forafkølet phosphatpufret saltopløsning uden calcium eller magnesium (PBS0). </li><li> Skær vævet ind i 3-5 cm lange stykker og bruge en saks til at klippe det åbne langs. Spred væv ved hjælp af pincet. </li><li> Skrab villi ved hjælp af et dækglas. Forsigtig, for meget kraft, vil medføre, at vævet til at rive og vil reducere udbyttet af krypter i følgende trin. </li><li> Overfør væv til et 50 ml rør indeholdende forafkølet PBS0 Brug pincet. Vask vævsfragmenter gennem kraftig omrystning og ændre PBS0. Gentag 2-3x eller indtil PBS0 vender mindre overskyet. </li><li> Inkuber vævet i et 50 ml rør indeholdende 30 ml PBS0 med 1 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) i 30 minutter ved 4 ° C på et rør rulle. </li><li> Ryst røret og overføre vævet til en anden 50 ml-rør indeholdende 30 ml PBS0 med 5 mM EDTA. 1 mM EDTA-opløsning (tidligere indeholdende væv) vil indeholde en blanding af krypterne og villi. Denne fraktion er ikke egnet til såning af organoids da det ofte indeholder en høj procentdel af villi. </li><li> Inkubér væv yderligere i 1 time ved 4 ° C på et rør rulle. </li><li> Ryst røret og samle løsningen i et rent 50 ml rør. Bekræfte tilstedeværelsen af krypter og anslå antallet, fx ved at tælle krypter i 50 pi ved lysmikroskopi. Beregn volumen nødvendig for at opnå 50-100 krypter og overføre det til et 1,5 ml tUbe. </li><li> Spin ved 300 xg i 5 minutter. Supernatanten, pellet resuspenderes i 50 pi kælder matrix og frø i en forvarmet plade med 24 brønde. Inkubér pladen i en vævsdyrkningsinkubator i 5-15 min, så kælderen matrix polymeriserer. </li><li> Overlay med 500 pi ENR medium (se tabel 1). Ca. 24 timer efter podning af organoids vil vise en lille rund cystisk form og efter yderligere 2-3 dage spirende strukturer bliver synlige. Skift til frisk ENR medier hver 3 dage. </li><li> Passage organoide kulturer hver 7 dage. </li></ol></li><li> Passage og opretholdelse Organoids <ol><li> Vedligehold organoids ved forfriskende medierne hver 3 dage og passage 1: 3 eller 1: 5 som hulrummet bliver fyldt med døde celler, cirka hver 7 dage. </li><li> Bryd kælderen matrix kuppel med medium ved hjælp af 1 ml Pipetman spids og overføre det fra brønden til et 1,5 ml rør. </li><li> Mekanisk adskille organoids gennem pipettering enpproximately 50x med en fin (fx 200 ul) drikkepenge. </li><li> Spin ved 300 xg i 5 minutter. </li><li> Supernatanten fjernes, og pellet resuspenderes i 150-250 ul kælder matrix. Frø i en opvarmet plade med 24 brønde (50 pi kælder matrix / brønd). Før podning pipette kælderen matrixen op og ned en gang at belægge væg spidsen. Afpipetteres langsomt for at undgå bobler og frø i midten af ​​brønden for at forhindre kælderen matricen fra spredning. Det er ønskeligt at få en kuppel kælder matrix i centrum af brønden. </li><li> Anbring i en vævsdyrkningsinkubator i 5-15 min, så kælderen matrix polymeriserer. Overlay med 500 ul ENR medier per brønd. </li></ol></li></ol> 3. Pre-infektion Behandling af SI Organoids BEMÆRK: Figur 1 illustrerer transduktion proceduren. <ol><li> Exchange ENR til ENRWntNic (se tabel 1) medium og vokse de organoids i thans medium for en minimum 3 dage eller indtil de har vedtaget en cystisk morfologi. Wnt3a øger antallet af stamceller og Paneth celler, mens Nicotinamid (Nic) forbedrer kultur effektivitet. </li></ol> 4. virusproduktion <ol><li> Der er behov for én 150 mm skål af platin-E-celler pr infektion. Frø ca. 5 x 10 6 celler med 15-18 ml medium (DMEM + 10% FBS) i nærvær af puromycin (1 ug / ml) og Blasticidin (10 ug / ml). Transficere celler efter 2-3 dage, når de har nået 70-80% sammenflydning. Skift mediet til DMEM + 10% FBS uden puromycin og blasticidin før transfektion. </li><li> Tilsæt 30 ug retroviral DNA-konstruktion og 240 pi af polyethylenimin (PEI) for at adskille rør indeholdende 1 ml Opti-MEM. Bland og inkuber ved stuetemperatur i 5 min. </li><li> Pool De to opløsninger og inkuberes ved stuetemperatur i 20-30 minutter. Tilføj hele blandingen til mediet af Platinum-E-celler og omhyggeligt ryste plate for at sikre en ligelig fordeling af de dna-pei-komplekser. </li><li> Inkubér Platinum-E celler med transfektionsblandingen natten over og opdatere mediet den følgende dag. Hold cellerne i det nye medium i 2 dage. </li><li> Saml kun mediet i et 50 ml Falcon-rør, passerer det gennem et 0,45 um filter og centrifugeres ved 8000 xg ved 4 ° C i 12-16 timer. Supernatanten fjernes, og pellet resuspenderes i 250 pi Transduktion medium (se tabel 1). </li></ol> 5. organoide Fragment Forberedelse <ol><li> For en infektion er der behov for en brønd af en 24-brønds plade. Bryd kælderen matrix kuppel med medium ved hjælp af 1 ml Pipetman spids og overføre det til et 1,5 ml rør. </li><li> Brug en finere volumen spids (f.eks, 200 tip ul) til mekanisk forstyrre organoids gennem pipettering (30-50x). Løsningen bliver overskyet og ingen hele organoids skal være synlig. </li><li> Der centrifugeres ved stuetemperatur, 900 xg i 5 minutter<html> . </li><li> Supernatanten fjernes, og pellet resuspenderes i 500 pi cellekultur kvalitet rekombinant protease (f.eks TrypLE). Der inkuberes ved 37 ° C i 5 min. Efter inkubation kontrollere størrelsen af ​​de organoide fragmenter ved anvendelse af lysmikroskopi, tælle antallet af celler pr fragment. Fragmenter indeholdende 5-10 celler er ideelle. Hvis flertallet af fragmenterne indeholder et større antal celler inkubationstiden kan øges med 2 minutter ad gangen. </li><li> Afslut dissociation proces ved tilsætning af 500 pi af ENR medium. </li><li> Der centrifugeres ved stuetemperatur, 900 xg i 5 minutter. Supernatanten fjernes, og holde pellet på is eller 4 ° C. </li></ol> 6. Retroviral transduktion <ol><li> Kombiner organoide fragmenter med 250 pi af den retrovirale opløsning (fra afsnit 4.5) i en brønd af en 48-brønds plade. Bland forsigtigt ved langsom pipettering hjælp 1 ml Pipetman spids. </li><li> Forsegle skiltet med Parafilm. </li></ol>e &quot;&gt; 7. Spinoculation og Belægning <ol><li> Centrifugeres pladen ved 32 ° C, 600 x g i 1 time. Fjern forsigtigt Parafilm og inkuberes pladen i et vævsdyrkningsinkubator i 6 timer. </li></ol> 8. Såning af inficerede organoide Fragmenter <ol><li> Overfør inficerede organoide fragmenter og transduktion medier fra brønden til et 1,5 ml rør, og centrifugering ved 900 xg i 5 minutter. </li><li> Supernatanten fjernes, og sætte rør indeholdende pelleten på is i 5 min til cool. Tilsæt 100 ul kælder matrix og pellet resuspenderes ved pipettering langsomt op og ned. </li><li> Seed dråber 50 pi kælder matrix-celle blanding &quot;i en ny 24-brønds plade. Inkubér pladen ved 37 ° C i 5-15 minutter, indtil kælder matrix størkner. </li><li> Tilføj transduktion medier uden polybren til brøndene og inkuberes pladen i en vævskultur-inkubator. Skift medier hver 2-3 dage. </li></ol> 9. Udvælgelse <ol><li> Start selvlektion efter 2-3 dage efter tilsætning af puromycin (1 ug / ml) til mediet. </li><li> Når fragmenterne begyndt at danne organoids erstatte Transduktion medier med ENR medier suppleret med puromycin (1 ug / ml). </li></ol> 10. Post-infektion Behandling af SI Organoids <ol><li> Kultur transduceret organoids henhold til &quot;Passage og opretholdelse organoids&quot; protokol (afsnit 2.2.1). Efter 1-2 uger SI organoids vil genvinde deres spirende strukturer. </li><li> Efter fremkomsten af ​​spirende strukturer inducere ekspressionen af ​​miRNA eller cDNA ved tilsætning af 4-hydroxytamoxifen (4-OHT) i en arbejdsgruppe koncentration på 1 uM. Bemærk, at dette skridt er kun gyldig, hvis du bruger retrovirusvektorer fra Addgene (pMSCV-loxP-dsRed-loxP-eGFP-Puro-WPRE (32702), pMSCV-loxP-dsRed-loxP-3xHA-Puro-WPRE (32703), og pMSCV -FLIP-puro-dsRed-GFP-miRNA (32704)), og organoids udtrykker Cre-ERT2. </li></ol> 11. Bekræftelse af infektion og Udtression / Undertrykkelse af genet af interesse <ol><li> Hvis du bruger retrovirusvektorer fra Addgene (32702, 32703 og 32704) transduktionseffektivitet kan bekræftes ved observation af dsRed udtryk. Endvidere kan ekspression eller suppression af genet af interesse bekræftes ved Western Blot under anvendelse af GFP eller 3xHA epitop (til gen-overekspression) og qPCR (til gen-knockdown), som eksemplificeret i Koo et al 4. </li></ol>

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell:+mechanism+and+applications.">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li><li>Stelzner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nomenclature+for+intestinal+in+vitro+cultures.+American+journal+of+physiology.">A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American journal of physiology.</a> Gastrointestinal and liver physiology. 302, G1359-G1363 (2012).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature. 9, 81-83 (2012).</li><li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+BAC+Transgenic+Epithelial+Organoids.">Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids.</a> PloS one. 8, e76871 (2013).</li><li>Mustata, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr4+is+required+for+Paneth+cell+differentiation+and+maintenance+of+intestinal+stem+cells+ex+vivo.">Lgr4 is required for Paneth cell differentiation and maintenance of intestinal stem cells ex vivo.</a> EMBO reports. 12, 558-564 (2011).</li><li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5+homologues+associate+with+Wnt+receptors+and+mediate+R-spondin+signalling.">Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling.</a> Nature. 476, 293-297 (2011).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+suppressor+RNF43+is+a+stem-cell+E3+ligase+that+induces+endocytosis+of+Wnt+receptors.">Tumour suppressor RNF43 is a stem-cell E3 ligase that induces endocytosis of Wnt receptors.</a> Nature. 488, 665-669 (2012).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> The EMBO journal. 32, 2708-2721 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494, 247-250 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose. The authors have no conflict of interest declared.

<html> For at opnå høj transduktionseffektivitet visse aspekter er kritiske. Den ene er den forbehandling af organoids med ENRWntNic medier indtil de vedtager en rund cystisk form. Dette øger antallet af stamceller og dermed mulighed for at opnå en stabil integration af transgenet, samt øge overlevelsesraten for SI organoids hele transduktion proceduren. En anden parameter er inkubationstiden efter spinoculation. For kort eller for lang inkubationstid resulterer i dårlig transduktionseffektivitet og dårlig overlevelse organoids hhv. Det spinoculation trin er ikke afgørende, selv om det øger procentdelen af ​​transducerede organoids. Endelig højtiter-virus er afgørende for succesfuld transduktion. Denne er afhængig af typen af ​​emballage cellelinie og virus. Kombinationen af ​​platin-E cellelinie og murin stamcelle-virus (MSCV), blev fundet at frembringe en titer højt nok til transduktion af organoids. ve_content &quot;&gt; Her er tips til fejlfinding, som kan bidrage til at opnå en vellykket transduktion. det første, hvis transfektion af pakkecellelinien er dårlig, skal du sørge for, at sammenflydning af cellerne er mellem 70-80%, og at inkubationstiden for pooled PEI-DNA-blandingen er mellem 20-30 min. overlevelsen af ​​de organoids under transduktion stærkt afhænger af størrelsen fragmentet. For lang trypsinisering forårsager størstedelen af ​​fragmenter at bestå af mindre end 3 celler og derved mindsker organoide overlevelsesevne. En anden faktor er aktiviteten af ​​Wnt konditionerede medium, hvis aktiviteten for lav styrke den gennem tilsætning af CHIR99021 i en arbejdsgruppe koncentration på 5 uM kan øge overlevelse. CHIR99021 hæmmer GSK3p, hvilket resulterer i øget Wnt-signalering. Endvidere Y-27362, som forhindrer anoikis tilsættes til transduktion medier til forbedring organoide overlevelsesevne, da organoids forstyrres til fragmenter (indeholdende 1-10 celler) før transduktion. Som60; nævnt ovenfor bør inkubationstiden efter spinoculation ikke overstige 6 timer. Endelig, hvis der observeres dårlig transduktion de ovennævnte faktorer, der påvirker den virale titer og størrelsen grænse for indsats til retrovirusvektoren bør overvejes. Effektiviteten af ​​knockdown er meget afhængig af miRNA. Eftersom effektiviteten varierer med kombinationen af ​​målgenet og miRNA er det værd at udføre en effektivitet skærmen for at identificere dem, der fungerer bedst. Teknikken er begrænset til de epiteliale fænomener organoide systemet. I fremtiden vil det være muligt at studere infektiøse eller immun-medierede sygdomme gennem co-kultur af patogener eller rekonstitution med komponenter afledt fra immunsystemet hhv. Desuden kan retrovirus kun bære skær af en relativt lille størrelse. Derfor har naturligt forekommende regulatoriske regioner, der skal udelukkes, og derfor ekspression af transgenet kan ikke efterligne detdet endogene gen. Som nævnt ovenfor knockdown effektivitet er afhængig af målgenet og miRNA. Hvis der ikke kan findes miRNA med passende knockdown effektivitet det kan begrænse brugen af ​​teknik for den pågældende mål-gen. Teoretisk organoids er kompatible med alle standardiserede manipulerende teknikker, der anvendes til cellelinier. Retrovirustransduktion var den første metode, der skal indberettes 4, og for nylig BAC (bakteriel kunstigt kromosom) -transgenesis er blevet tilgængelig 5. Med den samlede tid af 2-3 uger efter transfektion af det virale plasmidet i pakkende cellelinie, det er betydeligt hurtigere end dannelsen af ​​en transgen (Tg) mus. Ved at opretholde in vivo krypt-villus arkitektur mens indeholdende stamceller samt alle differentierede cellelinier af tarmepitelet det organoide dyrkningssystem bro mellem tg dyr og tidligere anvendte cellekultur. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Den her beskrevne protokol giver en metode til at udføre fænotypisk analyse af endodermal epitel in vitro gennem GAIN- og tab af funktion studier. Dette gør det muligt at tage fat fysiologisk relevante spørgsmål i voksne stamceller biologi, med et minimalt behov for tg mus. For eksempel kunne frembringelsen af betingede knockout-mus undgås ved organoids afledt fra nyfødte mutanter med perinatal letalitet 6. Desuden kan teknikken anvendes på organoids afledt fra den tidligere etablerede knockout-mus for at undersøge den rolle, paraloger ved at udføre yderligere knockdown 7,8. Efter etableringen af tyndtarmen organoids har tilpasning af den oprindelige kultur protokol tillod dyrkning af pancreas, lever, tyktarm og mave epiteler 9-11. Desuden har de menneskelige tarm organoids og tumor organoids stammer fra normale humane biopsier, primær Adenoma og endetarmskræft biopsier 10. Den virusinfektion protokol kan let udvides til disse typer af organoids og giver en hidtil uset måde at udføre funktionelle undersøgelser i humane stammer væv. Tilsammen retroviral transduktion af tyndtarmens organoids er en værdifuld ressource for at undersøge stamcelle vedligeholdelse, differentiering og celle skæbne beslutning, samt cellesignalering og celler celle interaktioner.

High-throughput funktionelle genetik er nødvendig for at øge vores biologiske forståelse af kroppen, for at forbedre den nuværende grundlæggende videnskab og medicin. Mus genetik er guldstandarden til at undersøge genfunktion in vivo, men det er både tidskrævende og dyrt. Cellelinjer, er den anden fælles valg, har en højere kapacitet på og samtidig være billigere. Men de er hæmmet af deres manglende evne til at gengive den korrekte mikromiljø og dermed fysiologiske reaktioner ses in vivo. Der er således et entydigt behov for en nem at håndtere modelsystem, som giver cost / tidseffektive high throughput analyse, mens efterligne de fysiologiske reaktioner observeret i in vivo transgene (TG) museforsøg. For endodermal epitel et sådant modelsystem udkom i 2009 1. Blandt viden fra opdagelsen af Lgr5-positive tarm stamceller, blevoplysninger om den niche, der svarer til de ekstra-cellulær matrix og vækstfaktorer der er nødvendige for stamcelle vedligeholdelse. Ved hjælp af disse oplysninger blev det muligt at etablere »mini-indvolde &#39;også kendt som organoids 2. For nylig en konsensus nomenklatur for in vitro-kulturer, hvor organoids er benævnt »enteroids«, blev foreslået 3. Ligesom cellelinjer, de organoids er stadigt voksende og let at behandle med ligander og inhibitorer. Men i stedet for at være to-dimensionelle de er tredimensionale selvorganiserende strukturer, som bevarer krypten-villus organisation samt stamceller og differentierede cellelinier i tyndtarmen (SI). Organoids består af et enkelt lag af epitelceller, der omgiver et luminale område. Fremspringende spirende strukturer svarer til tyndtarmens krypter, som indeholder knoglemarven. Begyndende fra spidsen af ​​den spirende struktur progenitorceller differentiere de af mirist mod epitelomkranset, hvor terminalt differentierede celler kaste ind i hulrummet. Sammenlignet med cellelinier denne ex vivo-system, nærmere rekapitulerer den normale fysiologi og er derfor en lovende model for tyndtarmens epitel. I denne video protokol af retroviral transduktion, præsenterer vi en metode, der gør det muligt for ex vivo genfunktion undersøgelser i denne roman organoide kultur-system. Vi starter med at beskrive organoide kultur i en trin-for-trin måde, og fortsætte med at demonstrere generation af retrovirus efterfulgt af transduktion procedure. Endelig er der et afsnit for yderligere råd til fejlfinding. En fordel ved denne teknik er, at den kan kombineres med billeddannelse eller lægemiddel-screening for at studere homeostase, cell fate beslutninger og celle-celle-interaktioner i tarmepitelet. På grund af deres enkle arkitektur og hurtig omsætningshastighed, organoids udgør en ideel model system for at studere voksne stamceller biologi. Desuden kan anvendes retrovirustransduktion til organoids afledt af forud etablerede transgene mus såvel som humane patientprøver. Som knock-in og knock-out tilgange ikke kan udvides til mennesker, de menneskelige SI organoids udgør et attraktivt alternativ. Sammenfattende genmanipulation gennem retroviral transduktion tillader fænotypeanalyse i små tarm organoids afledt fra mus eller humane vævsprøver og dermed supplere muse genetik og cellelinjer, mens du åbner nye muligheder for studier i humane stammer væv. Retrovirustransduktion muliggør GAIN- og tab af funktion undersøgelser, der skal udføres i organoide kultur system 4. Dette gør det en værdifuld ressource for at undersøge gen-funktion, voksne stamceller biologi og sygdom og samtidig være i overensstemmelse med de tre R&#39;er (reduktion, forfining og erstatning).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1090">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:220px;">Advanced DMEM/F12&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12634-034</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Glutamax 100x&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">35050-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Hepes 1M&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin- Streptomycin 100x</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">B27 supplement 50x</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">N2 supplement 100x&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">n-Acetylcysteine 500 mM&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse EGF 500 &#181;g/ml</td>
			<td>Invitrogen Biosource</td>
			<td>PMG8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse Noggin 100 &#181;g/ml&#160;&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">R-Spondin conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The conditioned media is generated&#160; from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Wnt conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The conditioned media is generated&#160; from L cells, for details see Sato and Clevers 2013</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Nicotinamide 1 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Y-27632 10 &#181;M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polybrene 8 &#181;g/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;">Standard BD Matrigel matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td style="width:595px;">Basement Matrix Extract (Cultrex PathClear BME Reduced Growth Factor Type 2, 3533-005-02 ) 
			supplied by AMSBIO can be used as an alterntive.</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:220px;">24 well plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>662960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">48 well plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>677980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">CHIR99021</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3734-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Platinum- E cells</td>
			<td>Cell biolabs</td>
			<td>RV-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Puromycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Blasticidin</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A1113902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Polyethyleneimine (PEI)</td>
			<td style="width:157px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">opti-MEM</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">51985-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">TrypLE</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Parafilm</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P7793-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">4-OHT</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H7904</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture

Lgr5-positive stamceller kan suppleres med de væsentlige vækstfaktorer EGF, Noggin, og R-Spondin, som tillader os at kultur stadigt ekspanderende primære 3D epiteliale strukturer in vitro. Både arkitektur og fysiologiske egenskaber af disse »mini-indvolde«, også kaldet organoids, nøje ligne deres in vivo kolleger. Dette gør dem til et attraktivt modelsystem til tyndtarmens epitel. Ved hjælp af retroviral transduktion, kan funktionelle genetik nu udføres ved betinget gen overekspression eller knockdown. Denne video viser proceduren for organoide kultur, generering af retrovirus, og den retrovirale transduktion af organoids at hjælpe fænotypisk analyse af tyndtarmens epitel in vitro. Denne hidtil ukendte organotypisk modelsystem i kombination med retrovirale medieret genekspression giver et værdifuldt værktøj til hurtig analyse af genfunktion in vitro uden behov for costly og tidskrævende generation til transgene dyr.

Organoids er klar til at blive delt, når den centrale lumen er formørket på grund af tilstedeværelsen af døde celler (figur 2). Efter 2-3 dages forbehandling organoids bør vedtage en rund cystisk morfologi (Figur 3). Dette øger antallet af stamceller, forbedre chancerne for at opnå stabil integration. Størrelsen af ​​det virale pellet kan variere efter centrifugering af virussupernatanten, sandsynligvis på grund af varierende bidrag cellerester til pelleten størrelse. Ingen klar sammenhæng til transduktionseffektivitet er blevet observeret. Under udvælgelsesproceduren ikke-transduced organoids vil dø, mens de, der har en stabil integration vil forblive. Kan observeres fluorescerende protein fra MSCV-eGFP retrovirus i celler stammer fra overlevende organoids, som har en cystisk morfologi, inden for 2-3 dage efter transduktion (figur 4). <img alt<html> = &quot;Figur 1&quot; FO: indhold-width = &quot;6in&quot; src = &quot;/ filer / ftp_upload / 51765 / 51765fig1highres.jpg&quot; width = &quot;600&quot; /&gt; Figur 1. En skematisk tegning af den retrovirale transduktion procedure. Før infektion organoids er forbehandlet ved hjælp ENRWntNic indtil de vedtage en cystisk struktur (trin 1). Platin-E-celler anvendes som emballage cellelinie, og dyrkes, indtil de når 70-80% konfluens. Derefter de transficeret med den retrovirale konstrukt under anvendelse af PEI. Virus høstes 2 dage senere (trin 2). Organoids trypsiniseres til opnåelse af fragmenter indeholdende 1-10 celler (trin 3), og inficeres derefter (trin 4). Efter spinoculation at øge infektion effektivitet (trin 5), er de inficerede organoide fragmenter podet (trin 6) og 2-3 dage senere udvælgelse for positive kloner med stabil integration kan udføres (trin 7). 1765fig2highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figur 2. Repræsentant billede af organoids efter 4-6 dages dyrkning. Hulrummet er fyldt med døde celler, så det ser mørkt. Organoids på dette tidspunkt er klar til at blive passeret. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig3highres.jpg" width="500" /> Figur 3. Repræsentant billede af tyndtarmens organoids dyrket i ENRWntNic medier i 3-4 dage. De organoids vedtage en cystisk morfologi. <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig4highres.jpg" width="500" /> Figur 4. Repræsentative billede af tyndtarmens organoids (a), der viser viral transgenekspression (b eGFP). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Advacerede DMEM / F12 +++ </td></tr><tr><td colspan="2"> Opbevares ved 4 ° C i 4 uger </td></tr><tr><td> Avanceret DMEM / F12 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Glutamax 100x </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Hepes 1 M </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Antibiotika 100x </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> ENRWntNic medium (20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Opbevares ved 4 ° C i 2 uger </td></tr><tr><td> Avanceret DMEM / F12 +++ </td><td> 7.2 ml </td></tr><tr><td> B27 supplement (50x) </td><td> 400 pi </td></tr><tr><td> N2 supplement (100x) </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> n-acetylcystein (500 mM) </td><td> 50 pi </td></tr><tr><td> muse EGF (500 ug / ml) </td><td> 2 pi </td></tr><tr><td> musenoggin (100 ug / ml) </td><td> 20 pi </td></tr><tr><td> R-Spondin conditNG-medium </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> Wnt3a konditioneret medium </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> Nicotinamid (1 M) </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td colspan="2"> Transduktion medium (20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Forbered frisk </td></tr><tr><td> ENRWntNic medium </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> Y-27632 (10 uM) </td><td> 20 pi </td></tr><tr><td> Polybren (8 ug / ml) </td><td> 20 pi </td></tr><tr><td colspan="2"> ENR medium (20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Opbevares ved 4 ° C i 4 uger </td></tr><tr><td> Avanceret DMEM / F12 +++ </td><td> 17.4 ml </td></tr><tr><td> B27 supplement (50x) </td><td> 400 pi </td></tr><tr><td> N2 supplement (100x) </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> n-acetylcystein (500 mM) </td><td> 50 pi </td&gt; </tr><tr><td> muse EGF (500 ug / ml) </td><td> 2 pi </td></tr><tr><td> musenoggin (100 ug / ml) </td><td> 20 pi </td></tr><tr><td> R-Spondin konditioneret medium </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Medier til Platinum-E-celler (til 500 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Opbevares ved 4 ° C i 12 uger </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 449,45 ml </td></tr><tr><td> Føtalt bovint serum (FBS) </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> Puromycin (1 mg / ml) </td><td> 50 pi </td></tr><tr><td> Blasticidin (10 ug / ml) </td><td> 500 pi </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Medier sammensætning for Advanced DMEM / F12 +++, ENRWntNic medium, transduktion medium, ENR medium og medium til Platinum-E-celler.

Watch this Scientific Journal Video about A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture at JoVE.com

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

En video-protokollen af ​​retroviral infektion i Primary Intestinal organoide Kultur

Denne protokol forklarer primær Lgr5-positve organoide kultur og den efterfølgende udførelse af retroviral transduktion. Dette muliggør Cre-inducerbar overekspression eller knockdown af den leverede transgen og tillader funktionelle undersøgelser, der skal gennemføres i romanen in vitro organotypisk modelsystem.

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Research

JoVE Journal

Biology

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolering og Primær kultur Rotte levercellerne

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analyse af metaboliske profil i<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mus Intestinal Crypt organoide Cultures

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

En protokol for Lentiviral transduktion og nedstrøms analyse af Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Isolering og kultur af primære muskeratinocytter fra neonatal og voksen mus hud

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Apoptose induktion og detektion i en primær kultur af Havagurk Tarmceller

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

Organoidafledt epitelmonolag: En klinisk relevant in vitro-model til tarmbarrierefunktion

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...

Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models

Kultur metoder til at studere apikale-specifikke interaktioner ved hjælp af tarmorganoid modeller

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...

En video-protokollen af ​​retroviral infektion i Primary Intestinal organoide Kultur

En video-protokollen af retroviral infektion i Primary Intestinal organoide Kultur