Name: a video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture
Uploaded: 2014-08-11T18:30:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture at JoVE.com

Koo BK en Mustata RC worden ondersteund door de Sir Henry Dale Fellowship van de Wellcome Trust en Andersson-Rolf A wordt ondersteund door de Medical Research Council (MRC). Fink J wordt ondersteund door de Wellcome Trust 4-jarige PhD-programma.

Alle muizen gebruikt in het volgende protocol werden gehouden in specifieke pathogeen-vrije omstandigheden, en alle procedures werden uitgevoerd volgens het Verenigd Koninkrijk van Binnenlandse Zaken regelgeving. Bereiding 1 <ol><li> Bereid media 1 uur van te voren van het gebruik (zie tabel 1 en lijst van materialen voor meer informatie) en pre-warm in een 37 ° C waterbad minstens 10 min voor gebruik. </li></ol> 2 kweken dunne darm (SI) Organoids Opmerking: Tenzij anders vermeld, worden alle incubaties uitgevoerd bij 37 ° C, 5% CO2 in een bevochtigde incubator. Uitrusting en reagentia in contact met levende cellen moeten steriel zijn. Voorverwarmen van de weefselkweek plaat is belangrijk omdat het voorkomt dat de kelder matrix (Matrigel of BME) druppels uit te spreiden wanneer zaaien. Ook moet de kelder matrix worden bewaard op ijs te allen tijde. Bewaren bij -20 ° C en dooiop ijs voor gebruik. <ol><li> Isoleren crypten <ol><li> Voor isolatie van de dunne darm te offeren de muis volgens de nationale regels en voorschriften, dan plaatst het dier op zijn rug en was de buik met 70% ethanol. Voer een longitudinale incisie van de lies tot het borstbeen. Eerst snijd de huid en het onderhuidse weefsel. Verwijder de dunne darm van de blindedarm naar de maag. Crypten geïsoleerd uit duodenum, jejunum en ileum kan voor organoïde cultuur. </li><li> Was de geïsoleerde dunne darm met pre-gekoelde fosfaat-gebufferde zoutoplossing zonder calcium of magnesium (PBS0). </li><li> Snijd het weefsel in 3-5 cm lange stukken en gebruik een schaar te knippen in de lengte te openen. Verspreid het weefsel met behulp van een tang. </li><li> Schraap villi met een dekglaasje. Voorzichtigheid, te veel kracht zal het weefsel scheuren veroorzaken en zal de opbrengst van de crypten verminderen in volgende stappen. </li><li> Transfer van het weefsel in een 50 ml buis met voorgekoeld PBS0 usinG forceps. Was de weefselfragmenten door krachtig schudden en verander het PBS0. Herhaal 2-3x of totdat het PBS0 wordt minder troebel. </li><li> Incubeer het weefsel in een 50 ml buis met 30 ml PBS0 met 1 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) gedurende 30 min bij 4 ° C op een buis roller. </li><li> Schud de buis en breng het weefsel een 50 ml buis met 30 ml van PBS0 met 5 mM EDTA. De 1 mM EDTA-oplossing (voorheen met het weefsel) wordt een mengsel van crypten en villi bevatten. Deze fractie is niet geschikt voor het zaaien van organoids als het bevat vaak een hoog percentage van villi. </li><li> Incubeer het weefsel verder gedurende 1 uur bij 4 ° C op een buis roller. </li><li> Schud de buis en het verzamelen van de oplossing in een schone buis van 50 ml. Bevestigen de aanwezigheid van crypten en schatten het aantal, bijvoorbeeld, door het tellen van crypten in 50 pl met lichtmicroscopie. Bereken het benodigde volume 50-100 crypten verkrijgen en overbrengen naar een 1,5 ml tube. </li><li> Draaien op 300 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant, resuspendeer de pellet in 50 ul kelder matrix en zaad in een voorverwarmde 24-well plaat. Incubeer de plaat in een weefselkweek incubator voor 5-15 min, zodat de kelder matrix polymeriseert. </li><li> Overlay met 500 ul ENR medium (zie tabel 1). Ongeveer 24 uur na het zaaien de organoids zal een kleine ronde cystische vorm laten zien en na nog eens 2-3 dagen ontluikende structuren zichtbaar worden. Wissel naar verse ENR media om de 3 dagen. </li><li> Passage organoïde culturen om de 7 dagen. </li></ol></li><li> Passage en onderhouden Organoids <ol><li> Handhaaf de organoids met het opfrissen van de media om de 3 dagen en passage 1: 3 en 1: 5 als het lumen wordt gevuld met dode cellen, ongeveer om de 7 dagen. </li><li> Breek de kelder matrix koepel met medium met 1 ml pipetman tip en over te dragen van de put naar een 1,5 ml tube. </li><li> Mechanisch scheiden de organoids door pipetteren eenpproximately 50x met een fijn (bijvoorbeeld 200 ul) tip. </li><li> Draaien op 300 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 150-250 ul kelder matrix. Zaad in een voorverwarmde 24-well plaat (50 ui kelder matrix / putje). Voor het zaaien pipet de kelder matrix keer op en neer om de vacht van de wand van de tip. Pipetteer langzaam om luchtbellen en zaad voorkomen in het midden van de put te voorkomen dat de kelder matrix uitspreiden. Het is gewenst een koepel kelder matrix krijgen in het midden van de put. </li><li> Incubeer in een weefselkweek incubator voor 5-15 min, zodat de kelder matrix polymeriseert. Overlay met 500 ul ENR media per well. </li></ol></li></ol> 3 Pre-infectie Behandeling van SI Organoids OPMERKING: Figuur 1 illustreert de transductieprocedure. <ol><li> Exchange ENR te ENRWntNic (zie tabel 1) medium en groeien de organoids in tZijn medium voor minimaal 3 dagen of totdat ze een cystische morfologie vastgesteld. Wnt3a verhoogt het aantal stamcellen en Paneth cellen terwijl Nicotinezuuramide (Nic) verbetert cultuur efficiency. </li></ol> 4 virusproductie <ol><li> Een 150 mm schaal van Platinum-E cellen nodig per infectie. Seed ca. 5 x 10 6 cellen met 15-18 ml medium (DMEM + 10% FBS) in aanwezigheid van puromycine (1 pg / ml) en blasticidine (10 ug / ml). Transfecteren cellen na 2-3 dagen, als ze 70-80% samenvloeiing hebben bereikt. Verander het medium om DMEM + 10% FBS zonder puromycine- en blasticidine voorafgaand aan transfectie. </li><li> Voeg 30 ug retroviraal DNA construct en 240 gl polyethyleenimine (PEI) naar buisjes die 1 ml Opti-MEM scheiden. Meng en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. </li><li> Verzamel de twee oplossingen en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 20-30 minuten. Voeg het mengsel als geheel aan het medium van de Platinum-E cellen voorzichtig schudden om het plate gelijke verdeling van de DNA-PEI-complexen waarborgen. </li><li> Incubeer de Platinum-E cellen met de transfectie mengsel &#39;s nachts en vernieuw het medium de volgende dag. Laat de cellen in het nieuwe medium gedurende 2 dagen. </li><li> Verzamel alleen het medium in een 50 ml Falcon buis, deze door een 0,45 urn filter en centrifugeer bij 8000 xg bij 4 ° C gedurende 12-16 uur. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 250 pl Transductie medium (zie tabel 1). </li></ol> 5. organoïde Fragment Voorbereiding <ol><li> Voor een infectie een goed van een 24-wells plaat nodig. Breek de kelder matrix koepel met medium met 1 ml pipetman tip en overbrengen naar een 1,5 ml tube. </li><li> Gebruik een fijnere volume tip (bijvoorbeeld, 200 ul tips) mechanisch verstoren de organoids door pipetteren (30-50x). De oplossing wordt troebel en er geen hele organoids moet zichtbaar zijn. </li><li> Centrifugeer bij kamertemperatuur 900 g gedurende 5 min<html> . </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 500 pi van celcultuur leerjaar recombinant protease (bijvoorbeeld TrypLE). Incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten. Na incubatie de grootte van de organoïde fragmenten middels lichtmicroscopie, tellen van het aantal cellen per fragment. Fragmenten die 5-10 cellen ideaal. Indien de meerderheid van de fragmenten bevatten een groter aantal cellen de incubatietijd kan worden verhoogd met 2 minuten per keer. </li><li> Beëindig het dissociatieproces toevoeging van 500 pl ENR medium. </li><li> Centrifugeer bij kamertemperatuur 900 g gedurende 5 minuten. Verwijder de bovenstaande vloeistof en bewaar de pellet op ijs of 4 ° C. </li></ol> 6 retrovirale transductie <ol><li> Combineer organoïde fragmenten met 250 ul van de retrovirale (uit 4.5) in een putje van een 48-well plaat. Meng voorzichtig door langzame pipetteren met 1 ml pipetman tip. </li><li> Dicht de plaat met Parafilm. </li></ol>e &quot;&gt; 7. Spinoculation en Plating <ol><li> Centrifugeer de plaat bij 32 ° C, 600 xg, 1 uur. Verwijder voorzichtig de Parafilm en incubeer de plaat in een weefselkweek incubator voor 6 uur. </li></ol> 8 Zaaien van Infected organoïde Fragmenten <ol><li> Breng de besmette organoïde fragmenten en transductie media uit de put naar een 1,5 ml tube, en draaien op 900 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder het supernatant en zet de buis met de pellet op ijs gedurende 5 minuten om af te koelen. Voeg 100 ul kelder matrix en resuspendeer de pellet door pipetteren langzaam op en neer. </li><li> Zaad druppels 50 gl &#39;kelder matrix-cel mix in een nieuwe 24-well plaat. Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 5-15 min, totdat de kelder matrix stolt. </li><li> Voeg transductie media zonder polybreen aan de putjes en incubeer de plaat in een weefselkweek incubator. Veranderen de media om de 2-3 dagen. </li></ol> 9 Selectie <ol><li> Beginnen selectie na 2-3 dagen door het toevoegen van puromycine (1 pg / ml) aan de media. </li><li> Wanneer de fragmenten beginnen te vormen organoids vervangen Transductie media ENR medium aangevuld met puromycine (1 pg / ml). </li></ol> 10 Post-infectie Behandeling van SI Organoids <ol><li> Cultuur getransduceerde organoids volgens de &quot;Passage en onderhouden organoids&quot; protocol (paragraaf 2.2.1). Na 1-2 weken de SI organoids hun ontluikende structuren zal herwinnen. </li><li> Na weergave van ontluikende structuren induceren de expressie van miRNA of cDNA door toevoeging van 4-hydroxytamoxifen (4-OHT) in een werkende concentratie van 1 uM. Merk op dat deze stap is alleen geldig indien het gebruik van retrovirale vectoren van Addgene (pMSCV-loxP-DsRed-loxP-eGFP-Puro-WPRE (32702), pMSCV-loxP-DsRed-loxP-3xHA-Puro-WPRE (32703), en pMSCV -Flip-puro-DsRed-GFP-miRNA (32704)) en organoids uiten Cre-ERT2. </li></ol> 11 Bevestiging van Infectie en Exprsessieschijven / Onderdrukking van het gen van belang <ol><li> Bij gebruik van retrovirale vectoren van Addgene (32702, 32703 en 32704) transductie efficiëntie kan worden bevestigd door observatie van DsRed expressie. Bovendien kan de expressie of onderdrukking van het gen van belang worden bevestigd door Western Blot met behulp van de GFP of 3xHA epitoop (voor overexpressie) en qPCR (voor gen knockdown), zoals geïllustreerd in Koo et al 4. </li></ol>

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell:+mechanism+and+applications.">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li><li>Stelzner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nomenclature+for+intestinal+in+vitro+cultures.+American+journal+of+physiology.">A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American journal of physiology.</a> Gastrointestinal and liver physiology. 302, G1359-G1363 (2012).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature. 9, 81-83 (2012).</li><li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+BAC+Transgenic+Epithelial+Organoids.">Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids.</a> PloS one. 8, e76871 (2013).</li><li>Mustata, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr4+is+required+for+Paneth+cell+differentiation+and+maintenance+of+intestinal+stem+cells+ex+vivo.">Lgr4 is required for Paneth cell differentiation and maintenance of intestinal stem cells ex vivo.</a> EMBO reports. 12, 558-564 (2011).</li><li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5+homologues+associate+with+Wnt+receptors+and+mediate+R-spondin+signalling.">Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling.</a> Nature. 476, 293-297 (2011).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+suppressor+RNF43+is+a+stem-cell+E3+ligase+that+induces+endocytosis+of+Wnt+receptors.">Tumour suppressor RNF43 is a stem-cell E3 ligase that induces endocytosis of Wnt receptors.</a> Nature. 488, 665-669 (2012).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> The EMBO journal. 32, 2708-2721 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494, 247-250 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose. The authors have no conflict of interest declared.

<html> Om tot een hoog transductierendement bepaalde aspecten kritisch. Een daarvan is de voorbehandeling van organoids met ENRWntNic media totdat ze een ronde cystische vorm aannemen. Dit verhoogt het aantal stamcellen en daarmee de kans op een stabiele integratie van het transgen, evenals het verhogen van de overlevingskans van de SI organoids gedurende de transductie procedure. Een andere parameter is de incubatietijd volgende spinoculation. Een te kort of te lang incubatie resulteert in een slechte transductie efficiëntie en slechte overleving van de organoids respectievelijk. De spinoculation stap is niet essentieel maar het verhoogt het percentage van getransduceerde organoids. Tenslotte hoge titer virus is essentieel voor een succesvolle transductie. Dit is afhankelijk van het soort verpakking cellijn en virus. De combinatie van platina-E cellijn van muis stamcellen virus (MSCV), bleek een titer hoog genoeg transductie van organoids produceren. ve_content &quot;&gt; Hieronder zijn tips voor probleemoplossing die kunnen bijdragen tot succesvolle transductie te bereiken. eerste, als de transfectie van de verpakkingscellijn is slecht, ervoor zorgen dat de confluentie van de cellen tussen 70-80% en de incubatietijd van de gepoolde PEI-DNA mengsel 20-30 min. Het overleven van de organoids tijdens transductie sterk afhankelijk van de fragmentgrootte. Te lange trypsinisatie veroorzaakt de meeste fragmenten uit minder dan 3 cellen en daardoor vermindert organoïde overlevingskansen. Een andere factor is de activiteit van de Wnt geconditioneerde medium, indien de activiteit te laag gehalte opvoeren door toevoeging van CHIR99021 in een werkende concentratie van 5 uM kan de overlevingskans te vergroten. CHIR99021 remt GSK3, resulterend in verhoogde Wnt signalering. Bovendien Y-27362, die voorkomt anoikis wordt toegevoegd aan de transductie media organoïde overlevingskansen verbeteren doordat de organoids verstoord fragmenten (bevattende 1-10 cellen) voorafgaand aan transductie. Al60, hierboven vermeld, dient de incubatietijd na spinoculation niet meer dan 6 uur. Ten slotte, als slechte transductie wordt waargenomen de bovengenoemde factoren die de virale titer en de maximale grootte van het inzetstuk voor de retrovirale vector moet worden beschouwd. De efficiëntie van de knockdown is sterk afhankelijk van de miRNA. Aangezien de efficiëntie varieert met de combinatie van het doelgen en miRNA is het goed uitvoeren van een efficiency scherm die het best werken identificeren. De techniek is beperkt tot de epitheliale verschijnselen van het organoïde systeem. In de toekomst zal het mogelijk zijn om infectieuze of immuungemedieerde ziekten door co-kweek van pathogenen of reconstitutie studie met componenten afgeleid van het immuunsysteem, respectievelijk. Bovendien kunnen retrovirussen enkel dragen inserts van betrekkelijk geringe omvang. Bijgevolg nature voorkomende regulerende gebieden moeten worden uitgesloten en derhalve de expressie van het transgen kan nabootsen die vanhet endogene gen. Zoals hierboven vermeld, de knockdown efficiëntie afhankelijk van het doelgen en miRNA. Wanneer geen miRNA met geschikte knockdown efficiëntie vindt kan het gebruik van de techniek voor die doelwitgen beperken. Theoretisch organoids zijn compatibel met alle gestandaardiseerde manipulatieve technieken die worden gebruikt voor de cellijnen. Retrovirale transductie was de eerste methode worden gemeld 4, en recent BAC (kunstmatig bacterieel chromosoom) -transgenesis is beschikbaar 5 geworden. Met een totale productie van 2-3 weken na transfectie van de virale plasmide in de verpakkingscellijn is aanzienlijk sneller dan het genereren van een transgene (tg) muizen. Door het handhaven van de in vivo crypte-villus architectuur tegelijkertijd de stamcellen en alle gedifferentieerde cellijnen van het darmepitheel, het organoïde kweeksysteem brug tussen tg dier en voorheen gebruikte celkweek. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; De hier beschreven protocol voorziet in een methode om fenotypische analyse van endodermale epitheel presteren in vitro door gain en verlieslatende van functie studies. Dit maakt het mogelijk om fysiologisch relevante vragen bij volwassen stamcel biologie aan te pakken, met een minimale behoefte van tg muizen. Zo kan de vorming van conditionele knockout muizen te vermijden door organoids afgeleid van pasgeboren mutanten perinatale letaliteit 6. Bovendien kan de techniek worden toegepast organoids afgeleid van eerder vastgestelde knockout muizen om de rol van paralogen bestuderen door extra knockdown 7,8. Na de oprichting van de dunne darm organoids, heeft aanpassing van de oorspronkelijke cultuur protocol stond het kweken van de alvleesklier, lever, dikke darm en maag epitheel 9-11. Bovendien hebben de menselijke darm organoids en tumor organoids afgeleid van normale menselijke biopten, primaire Adenoma en colorectale kanker biopsieën 10. De virale infectie protocol kan gemakkelijk worden uitgebreid om dit soort organoids en biedt ongekende wijze het functioneel studies in mensen afgeleide weefsels. Tezamen retrovirale transductie dunne darm organoids is een waardevolle bron voor onderzoek stamcellen onderhoud, differentiatie en Celgedrag, alsmede celsignalen en cel-cel interacties.

High-throughput functionele genetica is nodig om onze biologische kennis van het lichaam te verhogen, om de huidige fundamentele wetenschap en de geneeskunde te verbeteren. Muisgenetica is de gouden standaard voor het onderzoek van genfunctie in vivo, hoewel het zowel tijdrovend en kostbaar. Cellijnen, die andere zijn voorkomende keuze, een hogere doorvoercapaciteit terwijl goedkoper. Ze worden echter gehinderd door hun onvermogen om de juiste micro en daardoor de fysiologische responsen waargenomen in vivo reproduceren. Daarom is er een duidelijke behoefte aan een gemakkelijk te hanteren modelsysteem dat de kosten / tijd-efficiënte high throughput analyse terwijl toelaat nabootsen van de fysiologische responsen waargenomen in in vivo transgene (tg) muisexperimenten. Voor de endodermal epitheel een dergelijk modelsysteem verscheen in 2009 1. Onder de opgedane kennis uit de ontdekking van Lgr5-positieve intestinale stamcellen werdinformaties niche overeenkomt met de extracellulaire matrix en groeifactoren nodig voor stamceltransplantatie onderhoud. Gebruik makend van deze informatie het mogelijk om &#39;mini-guts&#39; ook wel bekend als organoids 2 vast geworden. Onlangs consensus nomenclatuur in vitro culturen waar organoids worden aangeduid als &quot;enteroids &#39;, werd gesuggereerd 3. Net als cellijnen, de organoids zijn steeds groeiende en gemakkelijk te behandelen met liganden en remmers. Echter, in plaats van tweedimensionale ze driedimensionale zelforganiserende structuren die de crypte-villus houdsorganisatie en stamcellen en gedifferentieerde cellijnen van de dunne darm (SI). Organoids bestaan ​​uit een enkele laag van epitheelcellen die een luminale gebied omringen. Vooruitstekende ontluikende structuren komen overeen met de dunne darm crypten waarin de stamcel compartiment. Vanaf de top van de ontluikende structuur stamcellen differentiëren ze miRasp de richting van de epitheel, waar terminaal gedifferentieerde cellen worden afgeworpen in het lumen. Vergeleken met cellijnen Deze ex vivo systeem beter recapituleert de normale fysiologie en is daarom een veelbelovend modelsysteem voor de kleine darm epitheel. In deze video protocol van retrovirale transductie, presenteren we een methode die ex vivo gen-functie studies stelt in deze roman organoïde kweeksysteem. We beginnen met een beschrijving organoïde cultuur in een stap voor stap manier en verder door het aantonen van de vorming van retrovirussen gevolgd door de transductie procedure. Ten slotte is er een sectie voor bijkomend advies voor het oplossen van problemen. Een voordeel van deze techniek is dat het kan worden gecombineerd met live imaging of drug screening homeostase, lot van de cel beslissingen en cel-cel interacties te bestuderen in het darmepitheel. Door hun eenvoudige architectuur en snelle omloopsnelheid, organoids vertegenwoordigen een ideaal model systeem voor het bestuderen van volwassen stamcellen biologie. Bovendien kunnen retrovirale transductie worden toegepast organoids afgeleid van vooraf vastgestelde transgene muizen en humane patiënt monsters. Zoals knock-in en knock-out benadering niet kan worden uitgebreid tot de mens, de menselijke SI organoids vormen een aantrekkelijk alternatief. Samengevat, genetische manipulatie door retrovirale transductie laat fenotypische analyse in de dunne darm organoids afgeleid van muizen of menselijk weefsel monsters, waardoor aanvulling muis genetica en cellijnen tijdens het openen van nieuwe wegen voor onderzoek bij mensen afgeleide weefsels. Retrovirale transductie maakt gain en verlies-van-functie studies in het organoïde kweeksysteem 4 uit te voeren. Dit maakt het een waardevolle bron voor onderzoek van genfunctie, volwassen stamcellen biologie en ziekte terwijl volgens de drie V (vermindering, verfijning en vervanging).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1090">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:220px;">Advanced DMEM/F12&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12634-034</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Glutamax 100x&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">35050-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Hepes 1M&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin- Streptomycin 100x</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">B27 supplement 50x</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">N2 supplement 100x&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">n-Acetylcysteine 500 mM&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse EGF 500 &#181;g/ml</td>
			<td>Invitrogen Biosource</td>
			<td>PMG8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse Noggin 100 &#181;g/ml&#160;&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">R-Spondin conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The conditioned media is generated&#160; from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Wnt conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The conditioned media is generated&#160; from L cells, for details see Sato and Clevers 2013</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Nicotinamide 1 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Y-27632 10 &#181;M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polybrene 8 &#181;g/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;">Standard BD Matrigel matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td style="width:595px;">Basement Matrix Extract (Cultrex PathClear BME Reduced Growth Factor Type 2, 3533-005-02 ) 
			supplied by AMSBIO can be used as an alterntive.</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:220px;">24 well plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>662960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">48 well plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>677980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">CHIR99021</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3734-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Platinum- E cells</td>
			<td>Cell biolabs</td>
			<td>RV-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Puromycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Blasticidin</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A1113902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Polyethyleneimine (PEI)</td>
			<td style="width:157px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">opti-MEM</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">51985-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">TrypLE</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Parafilm</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P7793-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">4-OHT</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H7904</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture

Lgr5-positieve stamcellen kan worden aangevuld met de essentiële groeifactoren EFG Noggin, en R-Spondin, die ons in staat om de cultuur steeds groeiende primaire 3D-epitheliale structuren in vitro. Zowel de architectuur en de fysiologische eigenschappen van deze &#39;mini-guts&#39;, ook wel organoids, sterk lijken op hun in vivo tegenhangers. Dit maakt hen een aantrekkelijk model voor de kleine darm epitheel. Met behulp van retrovirale transductie, kan functionele genetica nu worden uitgevoerd door conditionele gen overexpressie of knock-down. Deze video toont de procedure van organoïde cultuur, het genereren van retrovirussen en de retrovirale transductie van organoids tot fenotypische analyse van de dunne darm epitheel in vitro ondersteunen. Deze nieuwe organotypische modelsysteem in combinatie met retrovirale gemedieerde genexpressie verschaft een waardevol instrument voor snelle analyse van genfunctie in vitro zonder van costly en tijdrovend generatie van transgene dieren.

Organoids klaar te verdelen wanneer de centrale lumen wordt verduisterd door de aanwezigheid van dode cellen (figuur 2). Na 2-3 dagen van voorbehandeling organoids moet een ronde cystic morfologie (figuur 3) vast te stellen. Dit verhoogt het aantal stamcellen, het verbeteren van de kansen op stabiele integratie. De grootte van de virale pellet kan variëren na centrifugeren van het virale supernatant, waarschijnlijk door variërende bijdrage van celresten de korrelgrootte. Er is geen duidelijke correlatie met transductie efficiëntie is waargenomen. Tijdens de selectieprocedure niet-getransduceerde organoids sterven, terwijl die een stabiele integratie blijft. De fluorescerende eiwit van MSCV-eGFP retrovirus kan worden waargenomen in cellen afkomstig van overleven organoids, die een cystische morfologie binnen 2-3 dagen na transductie hebben (figuur 4). <img alt<html> = &quot;Figuur 1&quot; fo: content-width = &quot;6in&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 51765 / 51765fig1highres.jpg&quot; width = &quot;600&quot; /&gt; Figuur 1 Een schematische tekening van de retrovirale transductie procedure. Voorafgaand aan infectie organoids zijn voorbehandeld met ENRWntNic totdat ze een cystische structuur (stap 1) vast te stellen. Platinum-E cellen worden gebruikt als de verpakkingscellijn en gekweekt tot zij 70-80% confluentie bereikt. Daarna worden ze getransfecteerd met het retrovirale construct met PEI. Virussen worden 2 dagen later (stap 2) geoogst. Organoids worden getrypsiniseerd fragmenten bevattende 1-10 cellen (stap 3) te verkrijgen, en vervolgens geïnfecteerd (stap 4). Na spinoculation de infectie-efficiëntie (stap 5) te verhogen, worden de geïnfecteerde organoïde fragmenten geënt (stap 6) en 2-3 dagen later selectie voor positieve klonen met stabiele integratie kan worden uitgevoerd (stap 7). 1765fig2highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figuur 2 representatief beeld van organoids na 4-6 dagen van de cultuur. Het lumen is gevuld met dode cellen, waardoor het donker lijken. Organoids in dit stadium zijn klaar om te worden gepasseerd. <img alt="Figuur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig3highres.jpg" width="500" /> Figuur 3 representatief beeld van de dunne darm organoids gekweekt in ENRWntNic media voor 3-4 dagen. De organoids nemen een cystic morfologie. <img alt="Figuur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig4highres.jpg" width="500" /> Figuur 4 representatief beeld van de dunne darm organoids (a) dat de virale transgene expressie (b, eGFP) tonen. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Advanced DMEM / F12 +++ </td></tr><tr><td colspan="2"> Bewaar bij 4 ° C gedurende 4 weken </td></tr><tr><td> Geavanceerde DMEM / F12 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Glutamax 100x </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 1 M Hepes </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Antibiotica 100x </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> ENRWntNic medium (20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Bewaar bij 4 ° C gedurende 2 weken </td></tr><tr><td> Geavanceerde DMEM / F12 +++ </td><td> 7,2 ml </td></tr><tr><td> B27 supplement (50x) </td><td> 400 gl </td></tr><tr><td> N2 supplement (100x) </td><td> 200 gl </td></tr><tr><td> N-acetylcysteïne (500 mM) </td><td> 50 gl </td></tr><tr><td> muis EGF (500 ug / ml) </td><td> 2 ui </td></tr><tr><td> muis Noggin (100 ug / ml) </td><td> 20 gl </td></tr><tr><td> R-Spondin conditioned medium </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> Wnt3a geconditioneerd medium </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> Nicotinamide (1M) </td><td> 200 gl </td></tr><tr><td colspan="2"> Transductie medium (20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Bereid verse </td></tr><tr><td> ENRWntNic medium </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> Y-27632 (10 uM) </td><td> 20 gl </td></tr><tr><td> Polybreen (8 ug / ml) </td><td> 20 gl </td></tr><tr><td colspan="2"> ENR medium (20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Bewaar bij 4 ° C gedurende 4 weken </td></tr><tr><td> Geavanceerde DMEM / F12 +++ </td><td> 17.4 ml </td></tr><tr><td> B27 supplement (50x) </td><td> 400 gl </td></tr><tr><td> N2 supplement (100x) </td><td> 200 gl </td></tr><tr><td> N-acetylcysteïne (500 mM) </td><td> 50 gl </td&gt; </tr><tr><td> muis EGF (500 ug / ml) </td><td> 2 ui </td></tr><tr><td> muis Noggin (100 ug / ml) </td><td> 20 gl </td></tr><tr><td> R-Spondin geconditioneerd medium </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Media voor platina-L-cellen (500 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Bewaar bij 4 ° C gedurende 12 weken </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 449,45 ml </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum (FBS) </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> Puromycine (1 pg / ml) </td><td> 50 gl </td></tr><tr><td> Blasticidine (10 ug / ml) </td><td> 500 pi </td></tr></tbody></table> Tabel 1 Media samenstelling voor Advanced DMEM / F12 +++, ENRWntNic medium, Transduction medium, ENR medium en medium voor Platinum-E cellen.

Watch this Scientific Journal Video about A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture at JoVE.com

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Een video Protocol van retrovirale infectie in het jeugdwerk Intestinale organoïde Cultuur

Dit protocol legt de primaire Lgr5-positve organoïde cultuur en de daaropvolgende prestaties van retrovirale transductie. Dit maakt Cre-induceerbare overexpressie of knock-down van de geleverde transgen en maakt de functionele studies die in de roman worden uitgevoerd in vitro organotypisch modelsysteem.

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Research

JoVE Journal

Biology

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Protocol voor Dengue Infecties in Muggen (A. aegypti) en Infectie Fenotype Bepaling

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

Primaire Cultuur en Plasmide Elektroporatie van de muizen orgaan van Corti.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolatie en Primaire Cultuur van Rat levercellen

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analyse van Metabool profiel in<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Muis Intestinale Crypt organoïde Cultures

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Een protocol voor Lentiviral Transduction en Downstream Analyse van Intestinale Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Isolatie en Cultuur van Primaire Muis Keratinocyten Uit Neonatale en Volwassen Muis Huid

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Apoptosis inductie en detectie in een primaire cultuur van zee komkommer darmcellen

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

Organoïde-afgeleide epitheliale monolaag: een klinisch relevant in vitro model voor de darmbarrièrefunctie

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...

Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models

Kweekmethoden om apicale-specifieke interacties te bestuderen met behulp van intestinale organoïde modellen

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...