Name: a video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture
Uploaded: 2014-08-11T18:30:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture at JoVE.com

कू बीके और Mustata आर सी चिकित्सा अनुसंधान परिषद (एमआरसी) द्वारा समर्थित है वेलकम ट्रस्ट और एंडरसन-रॉल्फ एक से सर हेनरी डेल फैलोशिप द्वारा समर्थित हैं. गुप्तचर जम्मू वेलकम ट्रस्ट 4 साल पीएचडी कार्यक्रम के द्वारा समर्थित है.

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell:+mechanism+and+applications.">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li><li>Stelzner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nomenclature+for+intestinal+in+vitro+cultures.+American+journal+of+physiology.">A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American journal of physiology.</a> Gastrointestinal and liver physiology. 302, G1359-G1363 (2012).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature. 9, 81-83 (2012).</li><li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+BAC+Transgenic+Epithelial+Organoids.">Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids.</a> PloS one. 8, e76871 (2013).</li><li>Mustata, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr4+is+required+for+Paneth+cell+differentiation+and+maintenance+of+intestinal+stem+cells+ex+vivo.">Lgr4 is required for Paneth cell differentiation and maintenance of intestinal stem cells ex vivo.</a> EMBO reports. 12, 558-564 (2011).</li><li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5+homologues+associate+with+Wnt+receptors+and+mediate+R-spondin+signalling.">Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling.</a> Nature. 476, 293-297 (2011).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+suppressor+RNF43+is+a+stem-cell+E3+ligase+that+induces+endocytosis+of+Wnt+receptors.">Tumour suppressor RNF43 is a stem-cell E3 ligase that induces endocytosis of Wnt receptors.</a> Nature. 488, 665-669 (2012).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> The EMBO journal. 32, 2708-2721 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494, 247-250 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose. The authors have no conflict of interest declared.

<html> उच्च पारगमन क्षमता कुछ पहलुओं महत्वपूर्ण हैं को प्राप्त करने के लिए. वे एक दौर सिस्टिक आकार अपनाने जब तक एक ENRWntNic मीडिया के साथ organoids के पूर्व उपचार है. यह स्टेम कोशिकाओं की संख्या और transgene की एक स्थिर एकीकरण प्राप्त करने के लिए, साथ ही पारगमन प्रक्रिया के दौरान एसआई organoids के जीवित रहने की दर में वृद्धि की है, जिससे संभावना बढ़ जाती है. एक अन्य पैरामीटर spinoculation निम्नलिखित ऊष्मायन समय है. क्रमशः गरीब पारगमन दक्षता और organoids की गरीब अस्तित्व में बहुत कम या बहुत लंबी ऊष्मायन का परिणाम है. यह काफी transduced organoids का प्रतिशत बढ़ जाती है, हालांकि spinoculation कदम आवश्यक नहीं है. अंत में, उच्च अनुमापांक वायरस सफल पारगमन के लिए महत्वपूर्ण है. इस पैकेजिंग सेल लाइन और वायरस के प्रकार पर निर्भर है. प्लेटिनम ई सेल लाइन और murine स्टेम सेल वायरस (MSCV) का संयोजन, organoids के पारगमन के लिए पर्याप्त उच्च एक अनुमापांक उत्पादन पाया गया. ve_content &quot;&gt; नीचे सफल पारगमन को प्राप्त करने में मदद मिल सकती है, जो समस्या निवारण के लिए सुझाव दिए गए हैं. पैकेजिंग सेल लाइन के अभिकर्मक गरीब है तो सबसे पहले, कोशिकाओं के confluency 70-80% के बीच और के ऊष्मायन समय कि है बनाना जमा पी डीएनए मिश्रण 20-30 मिनट के बीच है. पारगमन के दौरान organoids के अस्तित्व अत्यधिक टुकड़ा आकार पर निर्भर करता है. बहुत लंबा trypsinization कम से कम 3 कोशिकाओं से मिलकर टुकड़े के बहुमत का कारण बनता है और इस तरह organoid survivability कम हो जाती है. एक और पहलू है Wnt वातानुकूलित माध्यम की गतिविधि, गतिविधि बहुत कम अस्तित्व को बढ़ा सकते हैं 5 माइक्रोन का एक काम एकाग्रता में CHIR99021 के अलावा के माध्यम से इसे बढ़ा है. CHIR99021 वृद्धि हुई Wnt संकेतन में जिसके परिणामस्वरूप, GSK3 रोकता. इसके अलावा, वाई-27362, जो रोकता organoids पूर्व पारगमन को टुकड़े (1-10 कोशिकाओं से युक्त) को बाधित कर रहे हैं के बाद से anoikis, organoid survivability सुधार लाने के लिए पारगमन मीडिया में जोड़ा जाता है. के रूप में60; ऊपर उल्लेख किया है, spinoculation बाद ऊष्मायन समय 6 घंटे से अधिक नहीं होना चाहिए. गरीब पारगमन मनाया जाता है अन्त में, वायरल अनुमापांक और रेट्रोवायरल वेक्टर के लिए डालने के आकार की सीमा को प्रभावित aforementioned कारकों पर विचार किया जाना चाहिए. पछाड़ना की दक्षता miRNA पर अत्यधिक निर्भर है. दक्षता लक्ष्य जीन और miRNA के संयोजन के साथ बदलता रहता है के बाद से यह सबसे अच्छा काम है कि उन लोगों की पहचान करने के लिए एक दक्षता स्क्रीन प्रदर्शन के लायक है. तकनीक organoid प्रणाली की उपकला घटना तक ही सीमित है. भविष्य में यह क्रमश: प्रतिरक्षा प्रणाली से व्युत्पन्न घटकों के साथ रोगजनकों या पुनर्गठन के सह संस्कृति के माध्यम से संक्रामक या प्रतिरक्षा की मध्यस्थता रोगों का अध्ययन करने के लिए संभव हो सकता है. इसके अलावा, रेट्रोवायरस केवल एक अपेक्षाकृत छोटे आकार का सम्मिलित ले जा सकता है. नतीजतन, स्वाभाविक रूप से होती विनियामक क्षेत्रों को बाहर रखा जा सकता है और इसलिए transgene की अभिव्यक्ति की है कि नकल नहीं कर सकतेअंतर्जात जीन. जैसा कि ऊपर कहा, पछाड़ना दक्षता लक्ष्य जीन और miRNA पर निर्भर है. उपयुक्त पछाड़ना दक्षता के साथ कोई miRNA पाया जा सकता है, तो यह है कि विशेष लक्ष्य जीन के लिए तकनीक का उपयोग सीमित कर सकता है. सिद्धांततः, organoids सेल लाइनों के लिए इस्तेमाल सभी मानकीकृत जोड़ तोड़ तकनीक के साथ संगत कर रहे हैं. रेट्रोवायरल पारगमन 4 सूचित किया जा करने के लिए पहली विधि था, और हाल ही में बीएसी (जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्र) -transgenesis 5 उपलब्ध हो गया है. 2-3 सप्ताह के कुल पीढ़ी समय के साथ, पैकेजिंग सेल लाइन में वायरल प्लाज्मिड के अभिकर्मक के बाद, यह एक ट्रांसजेनिक (टीजी) माउस की पीढ़ी की तुलना में काफी तेज है. स्टेम सेल के साथ ही आंतों उपकला के सभी विभेदित सेल प्रजातियों युक्त जबकि इन विवो तहखाना-अंकुर वास्तुकला बनाए रखने से, organoid संस्कृति प्रणाली टीजी पशु और पहले से इस्तेमाल किया सेल संस्कृति के बीच की खाई को पुल. <pवर्ग = &quot;jove_content&quot;&gt; यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल एक gain- के माध्यम से इन विट्रो में endodermal उपकला के प्ररूपी विश्लेषण करने के लिए विधि और समारोह के अध्ययन के loss- प्रदान करता है. इस टीजी चूहों की एक न्यूनतम आवश्यकता के साथ, वयस्क स्टेम कोशिका जीव विज्ञान में physiologically प्रासंगिक सवालों का पता करने के लिए यह संभव बनाता है. उदाहरण के लिए, सशर्त पीटा चूहों की पीढ़ी प्रसवकालीन मारक 6 के साथ नवजात म्यूटेंट से व्युत्पन्न organoids का उपयोग करके बचा जा सकता है. इसके अलावा, तकनीक अतिरिक्त पछाड़ना 7,8 प्रदर्शन से paralogues की भूमिका का अध्ययन करने के लिए पहले से स्थापित पीटा चूहों से ली गई organoids के लिए लागू किया जा सकता है. छोटी आंतों organoids की स्थापना के बाद, मूल संस्कृति प्रोटोकॉल का अनुकूलन अग्नाशय, जिगर, पेट और पेट epithelia 9-11 के संवर्धन की अनुमति दी है. इसके अलावा, मानव आंत्र organoids और ट्यूमर organoids प्राथमिक अदन, सामान्य मानव बायोप्सी से प्राप्त किया गया हैओमा और कोलोरेक्टल कैंसर 10 बायोप्सी. वायरल संक्रमण प्रोटोकॉल आसानी organoids के इन प्रकार के लिए बढ़ाया और मानव व्युत्पन्न ऊतकों में कार्यात्मक अध्ययन प्रदर्शन का एक अभूतपूर्व तरीका प्रदान किया जा सकता है. साथ में ले ली, छोटी आंतों organoids की रेट्रोवायरल पारगमन स्टेम सेल रखरखाव, भेदभाव, और सेल भाग्य निर्णय, साथ ही सेल संकेतन और सेल सेल बातचीत की जांच के लिए एक बहुमूल्य संसाधन है.

उच्च throughput कार्यात्मक आनुवंशिकी मौजूदा बुनियादी विज्ञान और चिकित्सा में सुधार करने के लिए, शरीर की हमारी जैविक समझ को बढ़ाने की जरूरत है. माउस आनुवंशिकी यह समय लेने वाली और महंगा दोनों हालांकि, vivo में जीन समारोह की जांच के लिए सोने के मानक किया गया है. कम महंगा किया जा रहा है, जबकि अन्य आम चुनाव किया जा रहा है सेल लाइनों, एक उच्च throughput क्षमता है. हालांकि, वे इन विवो में देखा उचित microenvironment और इस तरह शारीरिक प्रतिक्रियाओं को पुन: पेश करने के लिए उनकी अक्षमता से बाधित कर रहे हैं. इसलिए, लागत / समय कुशल उच्च throughput विश्लेषण करते हुए अनुमति देता है एक आसान करने के लिए संभाल मॉडल प्रणाली के लिए एक स्पष्ट की जरूरत है, वहाँ है इन विवो ट्रांसजेनिक (टीजी) माउस प्रयोगों में मनाया शारीरिक प्रतिक्रियाओं नकल उतार. Endodermal उपकला के लिए ऐसा ही एक मॉडल प्रणाली 2009 1 में दिखाई दिया. ज्ञान Lgr5 पॉजिटिव आंतों स्टेम कोशिकाओं की खोज से प्राप्त की बीच थास्टेम सेल रखरखाव के लिए आवश्यक अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स और वृद्धि कारकों के लिए इसी जगह के बारे में जानकारी. यह भी organoids 2 के रूप में जाना जाता है &#39;मिनी हिम्मत&#39; स्थापित करने के लिए संभव हो गया इस जानकारी का उपयोग. हाल ही में organoids &#39;enteroids&#39; के रूप में भेजा जाता है जहां इन विट्रो संस्कृतियों,, के लिए एक आम सहमति नामकरण 3 सुझाव दिया गया था. सेल लाइनों की तरह, organoids कभी विस्तार और ligands और inhibitors के साथ इलाज के लिए आसान कर रहे हैं. हालांकि, बजाय दो आयामी होने का वे तीन आयामी आत्म आयोजन तहखाना-अंकुर संगठन बनाए रखने संरचनाओं कि के साथ ही स्टेम कोशिकाओं और छोटी आंत (एसआई) की विभेदित सेल प्रजातियों हैं. Organoids एक luminal क्षेत्र है कि चारों ओर उपकला कोशिकाओं की एक परत से मिलकर. फैला हुआ नवोदित संरचनाओं स्टेम सेल कम्पार्टमेंट वाले छोटे आंत्र तहखाने के अनुरूप हैं. वे मील के रूप में नवोदित संरचना की नोक से शुरू पूर्वज कोशिकाओं को अलगटर्मिनली विभेदित कोशिकाओं लुमेन में बहा रहे हैं जहां उपकला अस्तर, की ओर भट्ठी. सेल लाइनों की तुलना में, इस पूर्व vivo प्रणाली को और अधिक बारीकी से सामान्य शरीर विज्ञान का स्मरण दिलाता है और इसलिए छोटी आंतों उपकला के लिए एक होनहार मॉडल प्रणाली है. रेट्रोवायरल पारगमन के इस वीडियो प्रोटोकॉल में, हम इस उपन्यास organoid संस्कृति प्रणाली में पूर्व vivo जीन समारोह के अध्ययन के लिए सक्षम बनाता है कि एक विधि प्रस्तुत करते हैं. हम एक कदम दर कदम तरीके से संस्कृति organoid वर्णन द्वारा शुरू, और पारगमन प्रक्रिया द्वारा पीछा रेट्रोवायरस की पीढ़ी का प्रदर्शन द्वारा जारी है. अंत में, समस्या निवारण के लिए अतिरिक्त सलाह के लिए एक अनुभाग है. इस तकनीक का एक फायदा यह आंतों उपकला में homeostasis, सेल भाग्य का निर्णय और सेल सेल बातचीत का अध्ययन करने के लाइव इमेजिंग या दवा स्क्रीनिंग के साथ जोड़ा जा सकता है. कारण उनके सरल वास्तुकला और तेजी से कारोबार दर के लिए, organoids एक आदर्श मॉडल है प्रतिनिधित्ववयस्क स्टेम कोशिका जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए ystem. इसके अलावा रेट्रोवायरल पारगमन पूर्व स्थापित ट्रांसजेनिक चूहों के साथ ही मानव रोगी के नमूने से व्युत्पन्न organoids के लिए लागू किया जा सकता है. में दस्तक और नाक आउट दृष्टिकोण मनुष्य के लिए बढ़ाया जा नहीं सकते हैं, मानव एसआई organoids एक आकर्षक विकल्प का गठन. संक्षेप में, रेट्रोवायरल पारगमन के माध्यम से जीन में गड़बड़ी मानव व्युत्पन्न ऊतकों में पढ़ाई के लिए नए रास्ते खोलने के दौरान जिससे माउस आनुवंशिकी और सेल लाइनों के पूरक, चूहे या मानव ऊतकों के नमूनों से निकाली गई छोटी आंतों organoids में प्ररूपी विश्लेषण की अनुमति देता है. रेट्रोवायरल पारगमन gain- सक्षम बनाता है और नुकसान के समारोह पढ़ाई organoid संस्कृति प्रणाली 4 में प्रदर्शन किया जाएगा. यह बात तीन रुपये (कमी, शोधन, और प्रतिस्थापन) के अनुसार किया जा रहा है, जबकि जीन समारोह, वयस्क स्टेम कोशिका जीव विज्ञान और रोग की जांच के लिए एक बहुमूल्य संसाधन है.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1090">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:220px;">Advanced DMEM/F12&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12634-034</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Glutamax 100x&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">35050-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Hepes 1M&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin- Streptomycin 100x</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">B27 supplement 50x</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">N2 supplement 100x&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">n-Acetylcysteine 500 mM&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse EGF 500 &#181;g/ml</td>
			<td>Invitrogen Biosource</td>
			<td>PMG8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse Noggin 100 &#181;g/ml&#160;&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">R-Spondin conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The conditioned media is generated&#160; from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Wnt conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The conditioned media is generated&#160; from L cells, for details see Sato and Clevers 2013</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Nicotinamide 1 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Y-27632 10 &#181;M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polybrene 8 &#181;g/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;">Standard BD Matrigel matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td style="width:595px;">Basement Matrix Extract (Cultrex PathClear BME Reduced Growth Factor Type 2, 3533-005-02 ) 
			supplied by AMSBIO can be used as an alterntive.</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:220px;">24 well plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>662960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">48 well plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>677980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">CHIR99021</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3734-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Platinum- E cells</td>
			<td>Cell biolabs</td>
			<td>RV-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Puromycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Blasticidin</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A1113902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Polyethyleneimine (PEI)</td>
			<td style="width:157px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">opti-MEM</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">51985-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">TrypLE</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Parafilm</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P7793-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">4-OHT</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H7904</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture

Lgr5 पॉजिटिव स्टेम कोशिकाओं आवश्यक विकास के साथ पूरक किया जा सकता है EGF, नोगिन, और संस्कृति इन विट्रो में प्राथमिक 3D उपकला संरचनाओं कभी विस्तार करने के लिए हमें की अनुमति देता है जो आर Spondin, कारकों. दोनों भी organoids बुलाया इन &#39;मिनी हिम्मत&#39;, की वास्तुकला और शारीरिक गुण, बारीकी से उनके vivo में समकक्षों के समान है. इससे उन्हें छोटी आंतों उपकला के लिए एक आकर्षक मॉडल प्रणाली बनाता है. रेट्रोवायरल पारगमन का उपयोग करना, कार्यात्मक जेनेटिक्स अब सशर्त जीन overexpression या पछाड़ना द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है. यह वीडियो organoid संस्कृति की प्रक्रिया, रेट्रोवायरस की पीढ़ी, और इन विट्रो में छोटी आंतों उपकला के प्ररूपी विश्लेषण की सहायता के लिए organoids की रेट्रोवायरल पारगमन को दर्शाता है. रेट्रोवायरल मध्यस्थता जीन अभिव्यक्ति के साथ संयोजन में इस उपन्यास organotypic मॉडल प्रणाली costl की आवश्यकता के बिना इन विट्रो में जीन समारोह का तेजी से विश्लेषण के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करता हैट्रांसजेनिक जानवरों के लिए वाई और समय लेने वाली पीढ़ी.

Organoids केंद्रीय लुमेन वजह से मृत कोशिकाओं (चित्रा 2) की उपस्थिति के लिए अन्धेरा है जब विभाजित होने के लिए तैयार हैं. पूर्व उपचार organoids के 2-3 दिनों के बाद एक दौर सिस्टिक आकारिकी (चित्रा 3) को अपनाना चाहिए. यह स्थिर एकीकरण प्राप्त करने के अवसरों को बढ़ाने, स्टेम कोशिकाओं की संख्या बढ़ जाती है. वायरल गोली के आकार की वजह से गोली आकार के लिए सेल मलबे के अलग योगदान करने के लिए, वायरल सतह पर तैरनेवाला के centrifugation के बाद सबसे अधिक संभावना हो सकती है. पारगमन क्षमता के लिए कोई स्पष्ट संबंध देखा गया है. लोगों को एक स्थिर एकीकरण रहेगा जबकि चयन प्रक्रिया के दौरान गैर transduced organoids, मर जाएगा. MSCV-EGFP रेट्रोवायरस से फ्लोरोसेंट प्रोटीन (चित्रा 4) पारगमन निम्नलिखित 2-3 दिनों के भीतर एक पित्ताशय आकृति विज्ञान है, जो जीवित organoids, से होने वाले कोशिकाओं में मनाया जा सकता है. <img alt<html> = &quot;चित्रा 1&quot; के लिए: सामग्री चौड़ाई = &quot;6in&quot; src = &quot;/ फ़ाइलें / ftp_upload / 51,765 / 51765fig1highres.jpg&quot; चौड़ाई = &quot;600&quot; /&gt; चित्रा 1 रेट्रोवायरल पारगमन की प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध ड्राइंग. पूर्व संक्रमण organoids को पूर्व इलाज वे एक पित्ताशय संरचना (चरण 1) अपनाने जब ​​तक ENRWntNic का उपयोग कर रहे हैं. प्लेटिनम ई कोशिकाओं पैकेजिंग सेल लाइन के रूप में इस्तेमाल किया, और वे 70-80% confluency तक पहुंचने तक संवर्धित कर रहे हैं. इसके बाद वे पी का उपयोग कर रेट्रोवायरल निर्माण के साथ ट्रांसफ़ेक्ट हैं. वायरस 2 दिन बाद (चरण 2) काटा जाता है. Organoids 1-10 कोशिकाओं (चरण 3) युक्त टुकड़े प्राप्त करने के लिए trypsinized कर रहे हैं, और उसके बाद (चरण 4) संक्रमित हैं. स्थिर एकीकरण (चरण 7) किया जा सकता है साथ spinoculation बाद संक्रमण दक्षता (चरण 5) को बढ़ाने के लिए, संक्रमित organoid टुकड़े सकारात्मक क्लोन के लिए (चरण 6) और 2-3 दिन बाद चयन वरीयता प्राप्त कर रहे हैं. 1765fig2highres.jpg &quot;चौड़ाई =&quot; 500 &quot;/&gt; चित्रा संस्कृति के 4-6 दिन बाद organoids की 2. प्रतिनिधि छवि. लुमेन, मृत कोशिकाओं से भरा अंधेरा प्रकट कर रही है. इस स्तर पर Organoids passaged बनने के लिए तैयार हैं. <img alt="चित्रा 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig3highres.jpg" width="500" /> 3-4 दिनों के लिए ENRWntNic मीडिया में सुसंस्कृत छोटी आंतों organoids की चित्रा 3 प्रतिनिधि छवि. Organoids एक पित्ताशय आकारिकी अपनाने. <img alt="चित्रा 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig4highres.jpg" width="500" /> छोटी आंतों organoids की चित्रा 4 प्रतिनिधि छवि (एक) वायरल transgene अभिव्यक्ति (बी, EGFP) बताते हैं कि. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> उन्नत स्तरnced DMEM / F12 +++ </td></tr><tr><td colspan="2"> 4 हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर </td></tr><tr><td> उन्नत DMEM / F12 </td><td> 500 मिलीलीटर </td></tr><tr><td> Glutamax 100x </td><td> 5 मिलीलीटर </td></tr><tr><td> Hepes 1 एम </td><td> 5 मिलीलीटर </td></tr><tr><td> एंटीबायोटिक्स 100x </td><td> 5 मिलीलीटर </td></tr><tr><td colspan="2"> ENRWntNic मध्यम (20 मिलीग्राम के लिए) </td></tr><tr><td colspan="2"> 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर </td></tr><tr><td> उन्नत DMEM / F12 +++ </td><td> 7.2 मिलीलीटर </td></tr><tr><td> B27 पूरक (50x) </td><td> 400 μl </td></tr><tr><td> एन 2 पूरक (100x) </td><td> 200 μl </td></tr><tr><td> एन एसिटाइलसिस्टीन (500 मिमी) </td><td> 50 μl </td></tr><tr><td> माउस EGF (500 माइक्रोग्राम / एमएल) </td><td> 2 μl </td></tr><tr><td> माउस नोगिन (100 माइक्रोग्राम / एमएल) </td><td> 20 μl </td></tr><tr><td> आर Spondin Conditioned मध्यम </td><td> 2 मिलीलीटर </td></tr><tr><td> Wnt3a वातानुकूलित माध्यम </td><td> 10 मिलीलीटर </td></tr><tr><td> निकोटिनामाइड (1 एम) </td><td> 200 μl </td></tr><tr><td colspan="2"> पारगमन मध्यम (20 मिलीग्राम के लिए) </td></tr><tr><td colspan="2"> ताजा तैयार </td></tr><tr><td> ENRWntNic मध्यम </td><td> 20 मिलीलीटर </td></tr><tr><td> वाई 27,632 (10 माइक्रोन) </td><td> 20 μl </td></tr><tr><td> Polybrene (8 माइक्रोग्राम / एमएल) </td><td> 20 μl </td></tr><tr><td colspan="2"> ENR मध्यम (20 मिलीग्राम के लिए) </td></tr><tr><td colspan="2"> 4 हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर </td></tr><tr><td> उन्नत DMEM / F12 +++ </td><td> 17.4 मिलीलीटर </td></tr><tr><td> B27 पूरक (50x) </td><td> 400 μl </td></tr><tr><td> एन 2 पूरक (100x) </td><td> 200 μl </td></tr><tr><td> एन एसिटाइलसिस्टीन (500 मिमी) </td><td> 50 μl </टीडी&gt; </tr><tr><td> माउस EGF (500 माइक्रोग्राम / एमएल) </td><td> 2 μl </td></tr><tr><td> माउस नोगिन (100 माइक्रोग्राम / एमएल) </td><td> 20 μl </td></tr><tr><td> आर Spondin वातानुकूलित माध्यम </td><td> 2 मिलीलीटर </td></tr><tr><td colspan="2"> प्लेटिनम ई कोशिकाओं के लिए मीडिया (500 मिलीलीटर के लिए) </td></tr><tr><td colspan="2"> 12 हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 449.45 मिलीलीटर </td></tr><tr><td> भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) </td><td> 50 मिलीलीटर </td></tr><tr><td> Puromycin (1 माइक्रोग्राम / एमएल) </td><td> 50 μl </td></tr><tr><td> Blasticidin (10 माइक्रोग्राम / एमएल) </td><td> 500 μl </td></tr></tbody></table> प्लेटिनम ई कोशिकाओं के लिए विकसित DMEM / F12 +++, ENRWntNic मध्यम, पारगमन मध्यम, ENR मध्यम, और मध्यम के लिए तालिका 1 मीडिया रचना.

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A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

प्राथमिक आंतों Organoid संस्कृति में रेट्रोवायरल संक्रमण का एक वीडियो प्रोटोकॉल

इस प्रोटोकॉल प्राथमिक Lgr5-positve organoid संस्कृति और रेट्रोवायरल पारगमन के बाद प्रदर्शन बताते हैं. इस विट्रो organotypic में उपन्यास में बाहर ले जाने के लिए कार्यात्मक अध्ययन वितरित transgene की Cre-inducible overexpression या पछाड़ना सक्षम बनाता है और अनुमति देता है मॉडल प्रणाली.

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

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