Name: a video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture
Uploaded: 2014-08-11T18:30:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture at JoVE.com

Koo BK og Mustata RC støttes av Sir Henry Dale Fellowship fra Wellcome Trust og Andersson-Rolf A er støttet av Medical Research Council (MRC). Fink J er støttet av Wellcome Trust 4-årig PhD-programmet.

Alle mus som brukes i følgende protokoll ble holdt i bestemte patogen-frie forhold, og alle prosedyrer ble utført i henhold til Storbritannia hjemmekontor forskrifter. 1. Forberedelse <ol><li> Forbered media 1 time i forkant av bruk (se tabell 1 og liste over materialer for flere detaljer) og pre-varme i en 37 ° C vannbad i minst 10 minutter før bruk. </li></ol> 2. dyrking Small Intestinal (SI) Organoids MERK: Med mindre annet er oppgitt, er alle inkubasjoner utført ved 37 ° C, 5% CO 2 i en fuktet inkubator. Utstyr og reagenser kommer i kontakt med levende celler, må være sterile. Forvarme vevkulturplate er viktig fordi det hindrer kjelleren matrise (Matrigel eller BME) dråper fra å spre seg ut når seeding. I tillegg bør kjelleren matrisen holdes på is hele tiden. Oppbevares ved -20 ° C og tøværpå is før bruk. <ol><li> Isolere krypter <ol><li> For isolering av tynntarmen ofre musen i henhold til nasjonale lover og forskrifter, og deretter plassere dyret på ryggen og vaske magen med 70% etanol. Utfør en langsgående midtlinjen snitt fra lysken til brystbenet. For det første kutt i huden og deretter subkutant vev. Fjern tynntarm fra cecum til magen. Krypter isolert fra duodenum, jejunum og ileum kan brukes til organoid kultur. </li><li> Vask isolert tynntarm med forhåndskjølt fosfatbuffret saltoppløsning uten kalsium eller magnesium (PBS0). </li><li> Skjær vevet inn 3-5 cm lange biter og bruke saks til å klippe det åpne lengde. Spre vev ved hjelp av tang. </li><li> Skrape av villi ved hjelp av en dekkglass. Forsiktig, for mye kraft vil føre til at vevet rives og vil redusere utbyttet av kryptene i følgende trinn. </li><li> Overfør vevet til et 50 ml rør inneholdende pre-avkjølt PBS0 using tang. Vask vev fragmenter gjennom kraftig risting og endre PBS0. Gjenta 2-3 x eller til PBS0 blir mindre regn. </li><li> Inkuber vevet i et 50 ml rør inneholdende 30 ml av PBS0 med 1 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) i 30 min ved 4 ° C på et rør valsen. </li><li> Kraft riste røret og overføre vevet til en annen 50 ml rør inneholdende 30 ml av PBS0 med 5 mM EDTA. Den 1 mM EDTA-løsning (inneholdende tidligere vevet) vil inneholde en blanding av krypter og villi. Denne fraksjon er ikke egnet for såing av organoids som det ofte inneholder en høy prosentandel av villi. </li><li> Inkuber vevet videre i 1 time ved 4 ° C på et rør valsen. </li><li> Kraft riste røret og samle oppløsningen i en ren 50 ml rør. Bekrefte tilstedeværelse av krypter og beregne antall, for eksempel ved å telle krypter i 50 pl ved lysmikroskopi. Beregn volumet nødvendig for å oppnå 50 til 100 krypter og overføre den til et 1,5 ml tube. </li><li> Spin ved 300 xg i 5 min. Kast supernatanten, resuspender pelleten i 50 mL av kjeller matrise, og frø i et forvarmet 24-brønns plate. Inkuber platen i en vevskultur-inkubator i 5 til 15 minutter, slik at kjeller matrisen polymeriserer. </li><li> Overlegg med 500 mL ENR medium (se tabell 1). Omtrent 24 timer etter seeding de organoids vil vise en liten runde cystisk form og etter ytterligere 2-3 dager spirende strukturer blir synlige. Bytt til ferske ENR media hver 3. dag. </li><li> Passage organoid kulturer hver 7. dag. </li></ol></li><li> Aging og Vedlikeholde Organoids <ol><li> Opprettholde organoids av forfriskende media hver 3 dager og passasje 1: 3 eller 1: 5 som lumen blir fylt med døde celler, omtrent hver 7. dag. </li><li> Bryt kjelleren matrise kuppel med medium med en ml Pipetman tips og overføre det fra brønnen til en 1,5 ml tube. </li><li> Mekanisk distansere de organoids gjennom pipettering enpproximately 50x med en fin (f.eks 200 pl) tips. </li><li> Spin ved 300 xg i 5 min. </li><li> Kast supernatanten og resuspender pelleten i 150-250 pl av kjelleren matrise. Seed i et forvarmet 24-brønns plate (50 mL av kjellermatrise / brønn). Før såing pipette kjelleren matrisen opp og ned en gang for å belegge veggen av spissen. Pipetter sakte for å unngå bobler og frø i midten av brønnen for å hindre at kjelleren matrisen fra å spre seg ut. Det er ønskelig å få en kuppel av kjeller matrise i sentrum av brønnen. </li><li> Inkuber i en vevskultur-inkubator i 5 til 15 minutter, slik at kjeller matrisen polymeriserer. Overlegg med 500 mL ENR media per brønn. </li></ol></li></ol> 3. Pre-infeksjon Behandling av SI Organoids MERK: Figur 1 illustrerer transduksjon prosedyre. <ol><li> Utveksling ENR til ENRWntNic (se tabell 1) medium og vokse de organoids i tsin medium i minst 3 dager eller inntil de er tatt i bruk en cystisk morfologi. Wnt3a øker antall stamceller og Paneth celler mens nikotinamid (Nic) forbedrer kultur effektivitet. </li></ol> 4. Virus Produksjon <ol><li> En 150 mm rett av Platinum-E celler er nødvendig per infeksjon. Seed omtrent 5 x 10 6 celler med 15 til 18 ml medium (DMEM + 10% FBS) i nærvær av puromycin (1 pg / ml) og blasticidin (10 ug / ml). Transfektere celler etter 2-3 dager, når de har nådd 70-80% konfluens. Endre medium til DMEM + 10% FBS uten puromycin og blasticidin før transfeksjon. </li><li> Tilsett 30 ug av retroviral DNA-konstruksjon, og 240 pl av polyetylenimin (PEI) for å separere rørene inneholdende 1 ml Opti-MEM. Bland og inkuber ved romtemperatur i 5 min. </li><li> Pool de to oppløsninger og inkuber ved romtemperatur i 20-30 min. Legg den fullstendige blanding til mediet av platina-E celler og forsiktig ryste plate for å sikre lik fordeling av de DNA-pei komplekser. </li><li> Inkuber platina-E celler med transfeksjon blandingen over natten og oppdatere medium neste dag. Hold cellene i det nye mediet for 2 dager. </li><li> Samle bare medium i en 50 ml Falcon-rør, passerer den gjennom et 0,45 mikrometer filter og sentrifuger ved 8000 xg ved 4 ° C i 12-16 timer. Kast supernatanten og resuspender pelleten i 250 pl av Transduksjon medium (se tabell 1). </li></ol> 5. Organoid Fragment Forberedelse <ol><li> For en infeksjon av en brønn fra en 24-brønns plate er nødvendig. Bryt kjelleren matrise kuppel med medium med en ml Pipetman tips og overføre den til en 1,5 ml tube. </li><li> Bruk en finere volum tips (f.eks 200 mL tips) til mekanisk forstyrre organoids gjennom pipettering (30-50x). Løsningen vil bli overskyet og ingen hele organoids skal være synlig. </li><li> Sentrifuger ved romtemperatur, 900 xg i 5 min<html> . </li><li> Kast supernatanten og resuspender pelleten i 500 pl av cellekulturkvalitet rekombinant protease (f.eks TrypLE). Inkuber ved 37 ° C i 5 min. Etter inkubasjon kontrollere størrelsen på de organoid fragmenter ved hjelp av lysmikroskopi, telling av antall celler pr fragment. Fragmenter som inneholder 5-10 celler er ideelt. Hvis de fleste av fragmentene inneholder en høyere antall celler inkubasjonstiden kan økes ved 2 min på en gang. </li><li> Avslutte dissosiasjon prosessen ved å legge til 500 mL av ENR medium. </li><li> Sentrifuger ved romtemperatur, 900 xg i 5 min. Fjern supernatanten og holde pelleten på is eller 4 ° C. </li></ol> 6. Retroviral Transduksjon <ol><li> Kombiner organoid fragmenter med 250 pl av den retrovirale løsning (fra avsnitt 4.5) i en brønn av en 48-brønns plate. Bland forsiktig ved langsom pipettering bruke 1 ml Pipetman tips. </li><li> Tett plate med Parafilm. </li></ol>e &quot;&gt; 7. Spinoculation og plating <ol><li> Sentrifuger plate ved 32 ° C, 600 xg, i 1 time. Fjern forsiktig Parafilm og inkuber platen i en vev kultur inkubator for 6 hr. </li></ol> 8. Seeding av infiserte Organoid Fragments <ol><li> Overfør den infiserte organoid fragmenter og transduksjon medier fra brønnen til et 1,5 ml rør og sentrifugering ved 900 xg i 5 min. </li><li> Kast supernatanten og sette røret inneholdende pellets på is i 5 minutter for å avkjøle. Tilsett 100 ul av kjeller matrisen og resuspender pelleten ved pipettering langsomt opp og ned. </li><li> Seed dråper av 50 pl kjeller matrise-celle blande &#39;i en ny 24-brønners plate. Inkuber platen ved 37 ° C i 5-15 min inntil kjelleren matrise størkner. </li><li> Legg transduksjon medier uten polybren til brønnene og inkuber platen i en vevskultur-inkubator. Endre media hver 2-3 dager. </li></ol> 9. Valg <ol><li> Begynn selection etter 2-3 dager ved å legge puromycin (1 mikrogram / ml) til media. </li><li> Når fragmentene er begynt å danne organoids erstatte Transduksjon medier med ENR medier supplert med puromycin (1 pg / ml). </li></ol> 10. Post-infeksjon Behandling av SI Organoids <ol><li> Kultur omformet organoids henhold til &quot;passaging og opprettholde organoids&quot; protokoll (§ 2.2.1). Etter 1-2 uker SI organoids vil gjenvinne sine spirende strukturer. </li><li> Etter opptreden av spirende strukturer indusere ekspresjon av miRNA eller cDNA ved tilsetning av 4-hydroxytamoxifen (4-OHT) i en arbeidskonsentrasjon på 1 mM. Legg merke til at dette trinnet gjelder bare dersom du bruker retrovirale vektorer fra Addgene (pMSCV-loxp-DsRed-loxp-EGFP-Puro-WPRE (32702), pMSCV-loxp-DsRed-loxp-3xHA-Puro-WPRE (32703), og pMSCV -FLIP-puro-DsRed-GFP-miRNA (32704)) og organoids uttrykker Cre-ERT2. </li></ol> 11. Bekreftelse av Infeksjon og Expression / Undertrykkelse av genet av interesse <ol><li> Hvis du bruker retrovirale vektorer fra Addgene (32702, 32703 og 32704) transduksjon effektivitet kan bekreftes ved observasjon av DsRed uttrykk. Videre, kan uttrykket eller undertrykkelse av genet av interesse bli bekreftet ved Western blot ved hjelp av GFP eller 3xHA epitopen (for genet overekspresjon) og qPCR (for genet knockdown), som eksemplifisert i Koo et al 4. </li></ol>

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell:+mechanism+and+applications.">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li><li>Stelzner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nomenclature+for+intestinal+in+vitro+cultures.+American+journal+of+physiology.">A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American journal of physiology.</a> Gastrointestinal and liver physiology. 302, G1359-G1363 (2012).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature. 9, 81-83 (2012).</li><li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+BAC+Transgenic+Epithelial+Organoids.">Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids.</a> PloS one. 8, e76871 (2013).</li><li>Mustata, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr4+is+required+for+Paneth+cell+differentiation+and+maintenance+of+intestinal+stem+cells+ex+vivo.">Lgr4 is required for Paneth cell differentiation and maintenance of intestinal stem cells ex vivo.</a> EMBO reports. 12, 558-564 (2011).</li><li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5+homologues+associate+with+Wnt+receptors+and+mediate+R-spondin+signalling.">Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling.</a> Nature. 476, 293-297 (2011).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+suppressor+RNF43+is+a+stem-cell+E3+ligase+that+induces+endocytosis+of+Wnt+receptors.">Tumour suppressor RNF43 is a stem-cell E3 ligase that induces endocytosis of Wnt receptors.</a> Nature. 488, 665-669 (2012).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> The EMBO journal. 32, 2708-2721 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494, 247-250 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose. The authors have no conflict of interest declared.

<html> For å oppnå høy transduksjon effektivitet visse aspekter er kritiske. Den ene er forbehandling av organoids med ENRWntNic media før de vedtar en runde cystisk form. Dette øker antallet av stamceller og derved muligheten for å oppnå en stabil integrering av transgenet, så vel som å øke overlevelsen av de SI organoids hele transduksjon prosedyren. En annen parameter er inkubasjonstiden følgende spinoculation. For kort eller for lang ruge resulterer i dårlig transduksjon effektivitet og dårlig overlevelse av organoids, henholdsvis. Den spinoculation trinnet er ikke avgjørende selv om det øker andelen transduserte organoids. Endelig er høy titer virus nøkkelen for vellykket transduksjon. Dette er avhengig av typen av emballasje cellelinje og virus. Kombinasjonen av platina-E-cellelinje og murine stamcelle virus (MSCV), ble funnet å produsere en titer høy nok for transduksjon av organoids. ve_content &quot;&gt; Her er tips for feilsøking som kan bidra til å oppnå vellykket transduksjon. Først, dersom transfeksjon av emballasjen cellelinjen er dårlig, må du kontrollere at konfluens av cellene er mellom 70-80%, og at inkubasjonstid på pooled PEI-DNA-blandingen er mellom 20-30 min. overlevelsen av organoids under transduksjon sterkt avhengig av fragmentstørrelsen. For lang trypsinisering fører til at mesteparten av fragmenter for å bestå av mindre enn tre celler, og derved minsker organoid overlevelsesevne. annen faktor er aktiviteten av Wnt kondisjonerte medium, hvis aktivitet er for lav forsterke det gjennom tilsetning av CHIR99021 i en arbeidskonsentrasjon på 5 pM kan øke overlevelsen. CHIR99021 hemmer GSK3, noe som resulterer i økt Wnt signalering. Videre, Y-27362, som hindrer anoikis legges til transduksjon media for å forbedre organoid overlevelsesevne, siden organoids blir forstyrret til fragmenter (som inneholder 1-10 celler) før transduksjon. As60; nevnt ovenfor, bør inkubasjonstiden etter spinoculation ikke overstige 6 hr. Til slutt, hvis dårlig transduksjon er observert de nevnte faktorer som påvirker viral titer og størrelsesbegrensningen for innsatsen for den retroviral vektor bør vurderes. Effektiviteten av knockdown er svært avhengig av miRNA. Siden effektiviteten varierer med kombinasjoner av målgenet, og miRNA det er verdt å utføre en effektivitet skjermen for å identifisere de som egner seg best. Teknikken er begrenset til de epiteliale fenomener av organoid system. I fremtiden kan det være mulig å studere infeksiøse eller immunmedierte sykdommer gjennom ko-kultur av patogener eller rekonstituering med komponenter utledet fra immunsystemet, henholdsvis. Videre kan retrovirus kun bære innsatser av en relativt liten størrelse. Følgelig, naturlig forekommende regulatoriske regioner er å utelukkes, og dermed ekspresjonen av transgenet ikke kan etterligne den forden endogene genet. Som nevnt ovenfor, er den knockdown effektivitet avhengig av målgenet og miRNA. Hvis ingen miRNA med egnet knockdown effektivitet kan bli funnet det kan begrense bruken av teknikken for det bestemte målgenet. Teoretisk organoids er kompatible med alle standardiserte manipulerende teknikker som benyttes for cellelinjer. Retroviral transduksjon var den første metoden for å bli rapportert til 4, og nylig BAC (bakterielt kunstig kromosom) -transgenesis har blitt tilgjengelig 5. Med en total generasjonstid på 2-3 uker, etter transfeksjon av viral plasmid inn i emballasjen cellelinje, det er betydelig raskere enn generering av et transgent (tg) mus. Ved å opprettholde in vivo krypt-villus-arkitektur mens inneholder stamceller så vel som alle differensierte celle linjer av intestinal epitelium, broer organoid kultursystemet gapet mellom tg dyr og tidligere brukte cellekultur. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Protokollen er beskrevet her gir en metode for å utføre fenotypeanalyser av endodermal epitel in vitro gjennom gevinst-og taps av funksjon studier. Dette gjør det mulig å ta opp fysiologisk relevante spørsmål i voksen stamcellebiologi, med et minimalt behov for tg mus. For eksempel kan den generasjonen av betingede knockout mus unngås ved å bruke organoids avledet fra nyfødte mutanter med perinatal dødelighet seks. Dessuten kan teknikken anvendes til å organoids avledet fra tidligere etablerte knockout mus for å studere rollen til paralogues ved å utføre ytterligere knockdown 7,8. Etter etablering av tynntarms organoids har tilpasning av det opprinnelige kultur-protokollen tillates dyrking av pankreas, lever, tykktarm og mage epitel 9-11. Videre har menneskelige tarm organoids og kreft organoids er avledet fra normale menneskelige biopsier, primær adenoma og tykktarmskreft biopsier 10. Den virale infeksjon protokollen kan lett utvides til disse typer organoids og gir en enestående måte å utføre funksjonelle studier i humane vev avledet. Til sammen er retrovirale transduksjon av tynntarms organoids en verdifull ressurs for å undersøke stamcelle vedlikehold, differensiering og celle skjebne beslutning, samt cellesignalering og celle-celle interaksjoner.

High-throughput funksjonelle genetikk er nødvendig for å øke vår biologiske forståelse av kroppen, for å forbedre dagens grunnleggende vitenskap og medisin. Muse genetikk har vært gullstandarden for undersøkelse av gen-funksjon in vivo, selv om den både er tidkrevende og kostbare. Cellelinjer, som er den andre vanlige valg, har en høyere gjennomstrømning kapasitet samtidig er rimeligere. De er imidlertid hindret av deres manglende evne til å reprodusere den riktige mikromiljøet og dermed de fysiologiske responser sees in vivo. Derfor er det en utvetydig behov for en lett-å-håndtaket modellsystem som gjør det mulig kostnad / tidseffektiv høy gjennomstrømning analyse mens ligne de fysiologiske responser observert i in vivo transgene (tg) museforsøk. For endodermal epitel en slik modell system dukket opp i 2009 1. Blant kunnskapen fra oppdagelsen av Lgr5-positive tarm stamceller bleinformasjon om den nisje som svarer til den ekstra-cellulære matriks og vekstfaktorer som er nødvendige for stamcelle vedlikehold. Utnytte denne informasjonen ble det mulig å etablere &#39;mini-guts&#39; også kjent som organoids to. Nylig en konsensus nomenklatur for in vitro kulturer, hvor organoids er referert til som &quot;enteroids &#39;, ble foreslått tre. Som cellelinjer, de organoids er stadig voksende og lett å behandle med ligander og inhibitorer. Imidlertid, i stedet for å være to-dimensjonale de tredimensjonale selvorganiserende strukturer som beholder krypten-villus organisasjonen så vel som stamceller og differensierte celle linjer av tynntarmen (SI). Organoids bestå av et enkelt lag av epitelceller som omgir en luminal området. Utstående spirende strukturer tilsvarer tynntarms krypter inneholder stamcellelinjen. Start fra spissen av spirende struktur progenitorceller skille som de miriv mot epitel foring, hvor terminalt differensierte celler er skur inn i hulrommet. Sammenlignet med cellelinjer, dette ex vivo-system nærmere sammenfatter normal fysiologi og er derfor en lovende modellsystem for den lille tarm epitel. I denne videoen protokollen av retrovirale transduksjon, presenterer vi en metode som gjør det mulig ex vivo genet funksjon studier i denne romanen organoid kultur system. Vi starter med å beskrive organoid kultur i en steg-for-steg måte, og fortsette ved å demonstrere generasjon av retrovirus fulgt av transduksjon prosedyren. Til slutt er det en seksjon for ytterligere råd for feilsøking. En fordel med denne teknikken er at den kan kombineres med levende avbildning eller medikamentscreening for å studere homeostase celle fate beslutninger og celle-celle interaksjoner i intestinal epitelium. På grunn av sin enkle arkitektur og høy omløpshastighet, organoids representerer en ideell modell system for å studere voksen stamcellebiologi. I tillegg retroviral transduksjon kan påføres organoids avledet fra pre-etablerte transgene mus, så vel som humane pasientprøver. Som knock-in og knock-out tilnærminger ikke kan utvides til mennesker, de menneskelige SI organoids utgjøre et attraktivt alternativ. I sammendraget, genmanipulering gjennom retrovirale transduksjon tillater fenotypeanalyser i tynntarms organoids avledet fra mus eller menneskelige vevsprøver, og dermed utfyller muse genetikk og cellelinjer under åpning av nye veier for studier i humane avledet vev. Retrovirale transduksjon gjør gevinst-og taps-of-funksjon studier som skal utføres i organoid kultur system 4. Dette gjør det til en verdifull ressurs for å undersøke gen-funksjon, voksen stamcellebiologi og sykdom mens den er i samsvar med de tre Rs (reduksjon, raffinement, og erstatning).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1090">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:220px;">Advanced DMEM/F12&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12634-034</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Glutamax 100x&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">35050-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Hepes 1M&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin- Streptomycin 100x</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">B27 supplement 50x</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">N2 supplement 100x&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">n-Acetylcysteine 500 mM&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse EGF 500 &#181;g/ml</td>
			<td>Invitrogen Biosource</td>
			<td>PMG8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse Noggin 100 &#181;g/ml&#160;&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">R-Spondin conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The conditioned media is generated&#160; from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Wnt conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The conditioned media is generated&#160; from L cells, for details see Sato and Clevers 2013</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Nicotinamide 1 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Y-27632 10 &#181;M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polybrene 8 &#181;g/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;">Standard BD Matrigel matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td style="width:595px;">Basement Matrix Extract (Cultrex PathClear BME Reduced Growth Factor Type 2, 3533-005-02 ) 
			supplied by AMSBIO can be used as an alterntive.</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:220px;">24 well plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>662960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">48 well plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>677980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">CHIR99021</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3734-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Platinum- E cells</td>
			<td>Cell biolabs</td>
			<td>RV-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Puromycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Blasticidin</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A1113902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Polyethyleneimine (PEI)</td>
			<td style="width:157px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">opti-MEM</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">51985-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">TrypLE</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Parafilm</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P7793-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">4-OHT</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H7904</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture

Lgr5-positive stamceller kan suppleres med viktige vekstfaktorer Egf, Noggin, og R-Spondin, som tillater oss å kultur stadig voksende primære 3D epiteliale strukturer in vitro. Både arkitektur og fysiologiske egenskapene til disse &quot;mini-guts &#39;, også kalt organoids, likne deres in vivo kolleger nøye. Dette gjør dem til et attraktivt modellsystem for den lille tarm epitel. Ved hjelp av retroviral transduksjon, kan funksjonelle gener nå utføres av betinget gen eller overekspresjon knockdown. Denne filmen demonstrerer fremgangsmåten i organoid kultur, generering av retrovirus, og retroviral transduksjon av organoids å bistå fenotypeanalyser av den lille tarm epitel in vitro. Denne nye organotypic modellsystem i kombinasjon med retrovirale mediert gen-ekspresjon gir et verdifullt verktøy for rask analyse av gen-funksjon in vitro uten behov for costly og tidkrevende for generering av transgene dyr.

Organoids er klar til å deles når det sentrale lumen er mørknet på grunn av tilstedeværelse av døde celler (figur 2). Etter 2-3 dager før behandling organoids bør vedta en runde cystisk morfologi (figur 3). Dette øker antallet av stamceller, forbedrer sjansene for å oppnå stabil integrering. Størrelsen av viral pellet kan variere etter sentrifugering av viral supernatant, mest sannsynlig på grunn av varierende bidrag fra celleavfall til pelletstørrelse. Ingen klar sammenheng til transduksjon effektivitet har blitt observert. Under utvelgelsesprosedyren ikke-transduced organoids vil dø, mens de som har en stabil integrasjon vil forbli. Det fluorescerende protein fra MSCV-EGFP retrovirus kan bli observert i celler som stammer fra overlevende organoids, som har en cystisk morfologi, i løpet av 2-3 dager etter transduksjon (figur 4). <img alt<html> = &quot;Figur 1&quot; fo: content-width = &quot;6in&quot; src = &quot;/ filer / Ftp_upload / 51765 / 51765fig1highres.jpg&quot; width = &quot;600&quot; /&gt; Figur 1. En skjematisk tegning av den retrovirale transduksjon prosedyren. Før infeksjon organoids er forhåndsbehandlet ved hjelp av ENRWntNic inntil de innta en cystisk struktur (trinn 1). Platina-E-celler ble anvendt som emballasje-cellelinje, og dyrkes inntil de når 70-80% konfluens. Deretter blir de transfektert med den retrovirale konstruksjonen ved hjelp av PEI. Virus er høstet to dager senere (trinn 2). Organoids er trypsinisert for å oppnå fragmenter som inneholder 1-10 celler (trinn 3), og blir deretter infisert (trinn 4). Etter spinoculation å øke infeksjons-effektivitet (trinn 5), blir de infiserte organoid fragmenter utsådd (trinn 6), og 2-3 dager senere utvalg for positive kloner med stabil integrasjon kan utføres (trinn 7). 1765fig2highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figur 2. Representant bilde av organoids etter 4-6 dager med kultur. Hulrommet er fylt med døde celler, slik at det ser mørkt. Organoids på dette stadiet er klar til å bli passaged. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig3highres.jpg" width="500" /> Figur 3. Representant bilde av tynntarms organoids dyrket i ENRWntNic media for 3-4 dager. Den organoids vedta en cystisk morfologi. <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig4highres.jpg" width="500" /> Figur 4. Representative bilde av tynntarms organoids (a) som viser viral transgen ekspresjon (b, EGFP). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Advanced DMEM / F12 +++ </td></tr><tr><td colspan="2"> Oppbevar ved 4 ° C i 4 uker </td></tr><tr><td> Avansert DMEM / F12 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Glutamax 100x </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Hepes en M </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Antibiotika 100x </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> ENRWntNic medium (20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Oppbevar ved 4 ° C i 2 uker </td></tr><tr><td> Avansert DMEM / F12 +++ </td><td> 7,2 ml </td></tr><tr><td> B27 supplement (50x) </td><td> 400 mL </td></tr><tr><td> N2 supplement (100x) </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> N-acetylcystein (500 mM) </td><td> 50 mL </td></tr><tr><td> mus EGF (500 ug / ml) </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> mus Noggin (100 ug / ml) </td><td> 20 mL </td></tr><tr><td> R-Spondin Conditioned medium </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> Wnt3a kondisjonerte medium </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> Nikotinamid (1 M) </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td colspan="2"> Transduksjon medium (20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Forbered frisk </td></tr><tr><td> ENRWntNic medium </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> Y-27632 (10 mm) </td><td> 20 mL </td></tr><tr><td> Polybren (8 ug / ml) </td><td> 20 mL </td></tr><tr><td colspan="2"> ENR medium (20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Oppbevar ved 4 ° C i 4 uker </td></tr><tr><td> Avansert DMEM / F12 +++ </td><td> 17.4 ml </td></tr><tr><td> B27 supplement (50x) </td><td> 400 mL </td></tr><tr><td> N2 supplement (100x) </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> N-acetylcystein (500 mM) </td><td> 50 mL </td&gt; </tr><tr><td> mus EGF (500 ug / ml) </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> mus Noggin (100 ug / ml) </td><td> 20 mL </td></tr><tr><td> R-Spondin kondisjonerte medium </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Media for platina-E-celler (500 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Oppbevar ved 4 ° C i 12 uker </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 449,45 ml </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum (FBS) </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> Puromycin (1 pg / ml) </td><td> 50 mL </td></tr><tr><td> Blasticidin (10 ug / ml) </td><td> 500 mL </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Media sammensetning for Advanced DMEM / F12 +++, ENRWntNic medium, Transduksjon medium, ENR medium og medium for Platinum-E celler.

Watch this Scientific Journal Video about A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture at JoVE.com

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

En video-protokollen av retroviral infeksjon i Primær Intestinal Organoid Kultur

Denne protokollen forklarer primære Lgr5-positve organoid kultur og den påfølgende ytelsen retrovirale transduksjon. Dette gjør Cre-induserbar overekspresjon eller knockdown av den leverte transgenet og lar funksjonelle studier som skal gjennomføres i romanen in vitro organotypic modellsystem.

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Research

JoVE Journal

Biology

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolering og Primær kultur Rat Nedsatt Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analyse av metabolsk profil i<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse Tarm Crypt Organoid Cultures

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

En protokoll for Lentiviral Transduksjon og Nedstrøms Analyse av Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Isolering og kultur av primære muskeratinocytter fra neonatal og voksen mus hud

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Apoptose induksjon og deteksjon i en primær kultur av Sea agurk intestinal celler

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

Organoid-avledet epitelmonolayer: En klinisk relevant in vitro-modell for tarmbarrierefunksjon

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...

Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models

Kulturmetoder for å studere apikale spesifikke interaksjoner ved hjelp av intestinale organoidmodeller

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...