Name: a video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture
Uploaded: 2014-08-11T18:30:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture at JoVE.com

Ку BK и Mustata RC поддерживаются сэра Генри Дейл стипендий от Wellcome Trust и Andersson-Рольф А поддерживается Советом по медицинским исследованиям (MRC). Финк J поддерживается 4-летнего PhD-программы Wellcome Trust.

Все мыши, используемые в следующим протоколом содержались в конкретного патогена условиях, и все процедуры были выполнены в соответствии с правилами внутренних дел Великобритании. 1 Подготовка <ol><li> Подготовьте СМИ 1 час до начала использования (см таблицу 1 и перечень материалов для более подробной информации) и предварительно тепло в водяной бане при 37 °, по крайней мере 10 мин перед использованием. </li></ol> 2 Культивирование тонкой кишки (SI) органоиды Примечание: Если не указано иное, все инкубации проводили при 37 ° С, 5% СО 2 в увлажненном инкубаторе. Оборудование и реагенты, вступая в контакт с живыми клетками, должны быть стерильными. Предварительно нагревая планшета для культуры ткани является важной, поскольку она предотвращает подвал матрица (Матригель или BME) капли от разводя при посеве. Кроме того, подвал матрица должна быть на льду во все времена. Хранить при -20 ° С и оттепелина льду перед использованием. <ol><li> Изоляция гробницы <ol><li> Для выделения тонкой кишке пожертвовать мыши в соответствии с национальными правилами и положениями, а затем поместите животное на спину и мыть живота с 70% этанола. Выполните продольный срединный разрез от паха до грудины. Во-первых, порезать кожу, а затем подкожной ткани. Удалить тонкую кишку от слепой кишки в желудок. Crypts, выделенные из двенадцатиперстной кишки, тощей кишки и подвздошной кишки может быть использован для Органоид культуры. </li><li> Вымойте изолированных тонкую кишку с предварительным охлаждением фосфатно-солевой буфер без кальция или магния (PBS0). </li><li> Разрежьте ткань в 3-5 см длинные куски и использовать ножницы, чтобы вырезать его открытым в продольном направлении. Распределите ткани с помощью щипцов. </li><li> Соскребите ворсинки, используя покровное. Осторожно, слишком много сил приведет к ткани, чтобы оторвать и снизить выход крипт в следующих шагов. </li><li> Передача ткани в 50 мл пробирку, содержащую предварительно охлаждается PBS0 Usinг щипцы. Вымойте фрагментов ткани через энергичного встряхивания и изменить PBS0. Повторите 2-3 раза, или до тех пор, PBS0 не получается менее пасмурная погода. </li><li> Инкубируйте ткани в 50 мл пробирку, содержащую 30 мл PBS0 с 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в течение 30 мин при 4 ° С на трубки валика. </li><li> Энергично встряхните трубку и перенесите ткани в другую 50 мл пробирку, содержащую 30 мл PBS0 5 мМ ЭДТА. 1 мМ раствора ЭДТА (ранее, содержащий ткань) будет содержать смесь крипт и ворсинок. Эту фракцию не подходит для посева органоидам как это часто содержит высокий процент ворсинок. </li><li> Инкубируйте ткани дополнительно в течение 1 часа при 4 ° С на трубки валика. </li><li> Энергично встряхните пробирку и собрать решение в чистую пробирку 50 мл. Подтвердите наличие крипт и оценить количество, например, путем подсчета склепы в 50 мкл с помощью световой микроскопии. Рассчитать объем необходимого для получения 50-100 склепы и перенести его на 1,5 мл тУбе. </li><li> Отжим при 300 мкг в течение 5 мин. Жидкость над осадком сливают, осадок ресуспендируют в 50 мкл базальной матрицы, а семена в предварительно нагретой пластине 24-луночного. Инкубируйте в культуре ткани инкубаторе в течение 5-15 мин, так подвал матрица полимеризуется. </li><li> Наложение с 500 мкл ENR среды (таблица 1). Примерно 24 ч после посева органоиды покажет маленький круглый кистозный форму и еще через 2-3 дней начинающим структуры становятся видимыми. Изменение в свежей среде ENR каждые 3 дня. </li><li> Прохождение Органоид культур каждые 7 дней. </li></ol></li><li> Пассирование и поддержание органоидов <ol><li> Поддерживать органоиды, обновив СМИ каждые 3 дня и прохождение 1: 3 или 1: 5 в просвет заполняется мертвых клеток, примерно каждые 7 дней. </li><li> Перерыв матрицу купол подвал со средой, используя 1 мл Pipetman наконечник и перенести его из колодца на 1,5 мл трубки. </li><li> Механически диссоциируют органоиды через пипеткойpproximately 50x с помощью штраф (например, 200 мкл) наконечника. </li><li> Отжим при 300 мкг в течение 5 мин. </li><li> Удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 150-250 мкл подвальном матрицы. Семя в предварительно нагревают 24-луночного планшета (50 мкл подвальном матрицы / а). Перед посевом пипетки подвал матрица вверх и вниз один раз, чтобы покрыть стенки наконечника. Пипетка медленно, чтобы избежать пузырьков и семена в середине скважины, чтобы предотвратить базальную матрицу из разводя. Желательно, чтобы получить купол базальной матрицы в центре скважины. </li><li> Выдержите в культуре ткани инкубаторе в течение 5-15 мин, так подвал матрица полимеризуется. Наложение с 500 мкл ENR СМИ на лунку. </li></ol></li></ol> 3 Pre-инфекция Лечение С.И. органоидов Примечание: Рисунок 1 иллюстрирует процедуру трансдукции. <ol><li> Обмен ENR в ENRWntNic (таблица 1) среду и выращивать органоиды в тего средний в течение как минимум 3 дней или до тех пор, приняли кистозный морфологию. Wnt3a увеличивает количество стволовых клеток, и Paneth а Никотинамид (NIC) повышает эффективность культуры. </li></ol> 4 Вирус Производство <ol><li> Один 150 мм блюдо Платина-E клеток необходимо на инфекции. Семя примерно 5 × 10 6 клеток с 15-18 мл среды (DMEM + 10% FBS) в присутствии пуромицина (1 мкг / мл) и бластицидин (10 мкг / мл). Трансфекции клеток после 2-3 дней, когда они достигли 70-80% слияния. Изменение среды к DMEM + 10% FBS без пуромицином и бластицидин до трансфекции. </li><li> Добавить 30 мкг ретровирусной конструкцией ДНК, и 240 мкл полиэтиленимина (PEI), чтобы отдельные пробирки, содержащие 1 мл OPTI-MEM. Смешать, инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин. </li><li> Бассейн двух растворов и инкубируют при комнатной температуре в течение 20-30 мин. Добавить полную смесь в среде Платина-E клеток и тщательно встряхнуть Platэ обеспечить равномерное распределение комплексов ДНК-PEI. </li><li> Инкубируйте клетки Платина-E с трансфекции смеси в течение ночи и обновить среды на следующий день. Хранить клеток в новой среде в течение 2 дней. </li><li> Собирают только среды в 50 мл сокола трубки, передать его через фильтр и центрифуги 0,45 мкм при 8000 х г при 4 ° С в течение 12-16 часов. Удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 250 мкл Transduction среды (таблица 1). </li></ol> 5 Органоид Фрагмент Подготовка <ol><li> Для одного инфекцией одна скважина из 24-луночного планшета не требуется. Перерыв матрицу купол подвал со средой, используя 1 мл Pipetman наконечник и перенести его на 1,5 мл трубки. </li><li> Используйте кончик громкости тоньше (например, 200 советы мкл), чтобы механически разрушить органоиды через пипетки (30-50x). Решение станет облачно и не целые органоиды не должны быть видны. </li><li> Центрифуга при комнатной температуре, 900 мкг в течение 5 мин<html> . </li><li> Удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 500 мкл класса культуре клеток рекомбинантного протеазы (например, TrypLE). Инкубируют при 37 ° С в течение 5 мин. После инкубации проверить размер Органоид фрагментов с использованием световой микроскопии, подсчета количества клеток на фрагменте. Фрагменты, содержащие 5-10 клеток идеальны. Если большинство фрагментов содержат большее количество клеток, время инкубации может быть увеличена на 2 мин за один раз. </li><li> Завершить процесс диссоциации путем добавления 500 мкл ENR среды. </li><li> Центрифуга при комнатной температуре, 900 мкг в течение 5 мин. Удалить супернатант и осадок держать на льду или 4 ° С. </li></ol> 6 Ретровирусная Трансдукция <ol><li> Объединение Органоид фрагменты с 250 мкл раствора ретровирусной (из раздела 4.5) в одну лунку 48-луночного планшета. Осторожно перемешать медленно пипетки с использованием 1 мл Pipetman наконечника. </li><li> Печать тарелку с парафильмом. </li></ol>е &quot;&gt; 7. Spinoculation и покрытия <ol><li> Центрифуга пластину при 32 ° С, 600 мкг, в течение 1 часа. Осторожно снимите парафильмом и инкубировать пластины в культуре ткани инкубаторе в течение 6 часов. </li></ol> 8 посев зараженных Органоид Фрагменты <ol><li> Перенесите зараженные Органоид фрагменты и трансдукции СМИ от скважины до 1,5 мл пробирку, и спина при 900 мкг в течение 5 мин. </li><li> Удалите супернатант и поставить пробирки, содержащей осадок на льду в течение 5 мин, чтобы охладить. Добавить 100 мкл подвальном матрицы и ресуспендируют осадок с помощью пипетки медленно вверх и вниз. </li><li> Семенной капли &quot;подвальной матрицы -клетка смешивать &#39;50 мкл в новом 24-луночного планшета. Инкубируйте планшет при 37 ° С в течение 5-15 мин, пока подвал матричных затвердевает. </li><li> Добавить трансдукции СМИ без полибрена в лунки и инкубировать пластину в инкубаторе для тканевых культур. Изменение СМИ каждые 2-3 дня. </li></ol> 9 Выбор <ol><li> Начните себелекция после 2-3 дней, добавляя пуромицина (1 мкг / мл) в средствах массовой информации. </li><li> Когда фрагменты начинают образовывать органоиды заменить трансдукции носитель с ENR среде с пуромицин (1 мкг / мл). </li></ol> 10. после заражения Лечение СИ органоидов <ol><li> Культура трансдуцировали органоиды в соответствии с &quot;пассажей и поддержание органоиды&quot; протокола (раздел 2.2.1). Через 1-2 недель органоиды SI вернет себе свои зарождающиеся структуры. </li><li> После появления подающих надежды структур индуцируют экспрессию микроРНК или кДНК путем добавления 4-гидрокситамоксифен (4-OHT) в рабочей концентрации 1 мкМ. Обратите внимание, что этот шаг является действительным только при использовании ретровирусных векторов из Addgene (pMSCV-LoxP-DsRed-LoxP-EGFP-Puro-WPRE (32702), pMSCV-LoxP-DsRed-LoxP-3xHA-Пуро-WPRE (32703), и pMSCV -flip-Puro-DsRed-GFP-микроРНК (32704)) и органоиды, выражающие CRE-ERT2. </li></ol> 11. подтверждения инфекции и Expression / Подавление интересующего гена <ol><li> При использовании ретровирусных векторов из Addgene (32702, 32703 и 32704) эффективность трансдукции может быть подтверждена путем наблюдения выражения DsRed. Кроме того, выражение или подавление интересующего гена может быть подтверждена с помощью Вестерн-блоттинга, с использованием GFP или 3xHA эпитоп (для сверхэкспрессии гена) и КПЦР (для нокдауна генов), как проиллюстрировано в Ку и соавт 4. </li></ol>

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell:+mechanism+and+applications.">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li><li>Stelzner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nomenclature+for+intestinal+in+vitro+cultures.+American+journal+of+physiology.">A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American journal of physiology.</a> Gastrointestinal and liver physiology. 302, G1359-G1363 (2012).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature. 9, 81-83 (2012).</li><li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+BAC+Transgenic+Epithelial+Organoids.">Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids.</a> PloS one. 8, e76871 (2013).</li><li>Mustata, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr4+is+required+for+Paneth+cell+differentiation+and+maintenance+of+intestinal+stem+cells+ex+vivo.">Lgr4 is required for Paneth cell differentiation and maintenance of intestinal stem cells ex vivo.</a> EMBO reports. 12, 558-564 (2011).</li><li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5+homologues+associate+with+Wnt+receptors+and+mediate+R-spondin+signalling.">Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling.</a> Nature. 476, 293-297 (2011).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+suppressor+RNF43+is+a+stem-cell+E3+ligase+that+induces+endocytosis+of+Wnt+receptors.">Tumour suppressor RNF43 is a stem-cell E3 ligase that induces endocytosis of Wnt receptors.</a> Nature. 488, 665-669 (2012).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> The EMBO journal. 32, 2708-2721 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494, 247-250 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose. The authors have no conflict of interest declared.

<html> Для достижения высокой эффективности трансдукции некоторые аспекты имеют решающее значение. Одним из них является предварительная обработка органоидов с ENRWntNic СМИ, пока они не примут круглую кистозный форму. Это увеличивает количество стволовых клеток и, тем самым, возможность получения стабильной интеграции трансгена, а также увеличение выживаемости по органоидам СИ в течение всей процедуры трансдукции. Другим параметром является время инкубации следующие spinoculation. Слишком короткие или слишком длинные Результаты инкубации в низкой эффективности трансдукции и плохого выживания органоидов, соответственно. Стадию spinoculation не является существенным, хотя это значительно увеличивает процент трансдуцированных органоидам. Наконец, вирус высокого титра является ключевым для успешного трансдукции. Это зависит от типа линии упаковка клеток и вируса. Сочетание Платина-E линии клеток и мышиного вируса стволовых клеток (MSCV), был найден, чтобы произвести титр достаточно высокую для трансдукции органоидов. ve_content &quot;&gt; Ниже приведены советы по устранению неполадок, которые могут содействовать достижению успешного трансдукции первых, если трансфекции упаковочной линии клеток беден, убедитесь, что конфлуэнтности клеток между 70-80% и что время инкубации. Смесь из пула PEI-ДНК находится в диапазоне от 20-30 мин. выживание органоидам при трансдукции, сильно зависит от размера фрагмента. Слишком долго трипсинизации вызывает большинство фрагментов, состоит из менее 3 клеток и тем самым уменьшает Органоид живучесть. Другим фактором является деятельность Wnt кондиционированной среды, если деятельность слишком низко повышения его через добавлением CHIR99021 в рабочей концентрации 5 мкМ может увеличить выживаемость. CHIR99021 ингибирует GSK3, что приводит к увеличению Wnt сигнализации. Кроме того, Y-27362, который предотвращает anoikis добавляется к трансдукции средств массовой информации, чтобы улучшить выживаемость Органоид, так как нарушается органоиды фрагментов, содержащих (1-10 клеток) до трансдукции. Как60; упомянуто выше, время инкубации, после spinoculation не должна превышать 6 часов. Наконец, если наблюдается плохое трансдукция вышеупомянутые факторы, влияющие на титр вируса и предельный размер вставки для ретровирусов вектора должны быть рассмотрены. Эффективность нокдауна в значительной степени зависит от миРНК. Поскольку эффективность зависит от комбинации гена-мишени и микроРНК стоит выполнении экрана эффективности, чтобы определить те, которые работают лучше. Методика ограничивается эпителиальных явлений Органоид системы. В будущем можно было бы изучать инфекционные или иммунные-опосредованных заболеваний через со-культуры патогенов или восстановления с компонентов, получаемых от иммунной системы, соответственно. Кроме того, ретровирусы могут нести только вставки относительно небольшого размера. Следовательно, должны быть исключены природные регуляторные области и, следовательно, экспрессии трансгена не может имитировать, что изэндогенный ген. Как упоминалось выше, нокдаун эффективность зависит от гена-мишени и миРНК. Если нет микроРНК с подходящей эффективности бросовой не может быть установлено, может быть ограничить использование техники для этого конкретного гена-мишени. Теоретически, органоиды совместимы со всеми стандартных манипуляционных методов, используемых для клеточных линий. Ретровирусная трансдукции был первый метод, который будет сообщили 4, а в последнее время BAC (бактериальная искусственная хромосома) -transgenesis стал доступен 5. С общим временем генерации 2-3 недель, после трансфекции вирусной плазмиды в упаковочной клеточной линии, то есть значительно быстрее, чем генерации трансгенных (Tg) мыши. Поддерживая в естественных условиях склеп-ворсинок архитектуры в то время как содержащий стволовые клетки, а также все дифференцированные клеточных клонов кишечного эпителия, Органоид система культуры устраняет разрыв между тг животного и ранее используемого клеточной культуре. <pкласс = &quot;jove_content&quot;&gt; Протокол, описанный здесь обеспечивает метод для выполнения фенотипическую анализ эндодермального эпителия в пробирке через амплитудно и убыточных функциональных исследований. Это делает возможным для решения физиологически соответствующие вопросы во взрослой биологии стволовых клеток, с минимальной потребностью ТГ мышей. Например, поколение условных мышей с можно было бы избежать с помощью органоиды, полученные из новорожденных мутантов с перинатальной летальности 6. Кроме того, метод может быть применен для органоидов, полученных из ранее установленных мышей с изучать роль паралогов путем дополнительной нокдаун 7,8. После создания тонкого кишечника органоидов, адаптация оригинального протокола культуры позволило культивирование поджелудочной, печени, толстой кишки и желудка эпителия 9-11. Кроме того, кишечные органоиды человека и опухолевые органоиды были получены из нормальных человеческих биопсии, первичный АденOMA и колоректальный рак биопсии 10. Протокол вирусная инфекция может быть легко расширена на эти типы органоидов и обеспечивает беспрецедентный способ выполнения функциональных исследований в человека происходит тканей. Взятые вместе, ретровирусная трансдукция тонкого кишечника органоидов является ценным ресурсом для исследования технического обслуживания стволовых клеток, дифференцировку и клеточных судеб решение, а также клеточной сигнализации и клеточно- клеточных взаимодействий.

Высокопроизводительная функциональной генетики необходимо увеличить нашу биологическую понимание тела, чтобы улучшить текущую фундаментальную науку и медицину. Генетика мыши был золотой стандарт для исследования функции генов в естественных условиях, хотя это отнимает много времени и дорого. Клеточные линии, будучи другой общий выбор, имеют более высокую пропускную способность, будучи дешевле. Тем не менее, они препятствуют их неспособности воспроизвести правильную микросреду и тем самым физиологические реакции видели в естественных условиях. Следовательно, существует обязательный потребность в легкой в обращении модельной системы, которая позволяет затраты / время-эффективность с высокой пропускной способностью анализа при имитируя физиологические реакции, наблюдаемые в в естественных условиях трансгенных экспериментов (TG) мыши. Для эндодермального эпителия одна такая модель системы появились в 2009 году 1. Среди знания, полученные от открытия Lgr5-положительных кишечных стволовых клетокИнформация о нише, соответствующей внеклеточного матрикса и факторов роста, необходимых для поддержания стволовых клеток. Используя эту информацию, это стало возможным установить &quot;мини-кишки&quot;, известные также как органоидов 2. Недавно консенсус номенклатура культур в пробирке, где органоиды которые называются «enteroids», было предложено 3. Как клеточных линий, что органоиды являются постоянно расширяющийся и легко поддается лечению с лигандами и ингибиторов. Однако, вместо того, чтобы двумерная они трехмерные самоорганизующиеся структуры, которые сохраняют склеп-ворсинок организацию, а также стволовые клетки и дифференцированные клеточные клоны из тонкой кишки (СИ). Органоидам состоять из одного слоя эпителиальных клеток, которые окружают площадь просвета. Выступающие начинающие структуры соответствуют малым кишечных крипт, содержащих стволовых клеток отсек. Исходя из кончика многообещающий структуры дифференциации клеток-предшественников, поскольку они пцнатереть к эпителиальной выстилки, где окончательно дифференцированными клетки пролил в просвет. По сравнению с клеточными линиями, это экс естественных система более тесно повторяет нормальную физиологию и, следовательно, является перспективной моделью системы для малого кишечного эпителия. В этом видео-протокола ретровирусов трансдукции, мы представляем метод, который позволяет Экс естественных функций гена исследования в этой новой Органоид системе культуры. Мы начнем с описания Органоид культуру в шаг за шагом образом, и по-прежнему демонстрируя генерацию ретровирусов с последующим процедуры трансдукции. Наконец, есть раздел для дополнительной консультации для поиска и устранения неисправностей. Преимуществом этого метода является то, что он может быть объединен с живого изображения или скрининга лекарственных средств для исследования гомеостаза судьба клеток решения и межклеточных взаимодействий в кишечном эпителии. Благодаря своей простой архитектуре и скорости быстрого оборота, органоиды представляют собой идеальное Model SИСТЕМА для изучения биологии взрослых стволовых клеток. Кроме того ретровирусный трансдукции может быть применен к органоидам, полученных из заранее установленных трансгенных мышей, а также образцов пациента-человека. Как нокаут-в и нокаут-подходы не могут быть распространены на людей, что органоиды человек SI представляют собой привлекательную альтернативу. Таким образом, манипуляции генов через ретровирусов трансдукции позволяет анализировать фенотипическую в тонкой кишки органоидов, полученных от мышей или образцов тканей человека, дополняя тем самым генетику мыши и клеточных линий, открывая новые возможности для исследований в человека происходит тканей. Ретровирусная трансдукции позволяет амплитудно и с потерей функции исследования должны быть выполнены в Органоид системе культуры 4. Это делает его ценным ресурсом для исследования функции генов, взрослый биологию стволовых клеток и болезни, находясь в соответствии с тремя рупий (сокращение, изысканность, и запасных).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1090">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:220px;">Advanced DMEM/F12&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12634-034</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Glutamax 100x&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">35050-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Hepes 1M&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin- Streptomycin 100x</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">B27 supplement 50x</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">N2 supplement 100x&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">n-Acetylcysteine 500 mM&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse EGF 500 &#181;g/ml</td>
			<td>Invitrogen Biosource</td>
			<td>PMG8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse Noggin 100 &#181;g/ml&#160;&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">R-Spondin conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The conditioned media is generated&#160; from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Wnt conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The conditioned media is generated&#160; from L cells, for details see Sato and Clevers 2013</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Nicotinamide 1 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Y-27632 10 &#181;M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polybrene 8 &#181;g/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;">Standard BD Matrigel matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td style="width:595px;">Basement Matrix Extract (Cultrex PathClear BME Reduced Growth Factor Type 2, 3533-005-02 ) 
			supplied by AMSBIO can be used as an alterntive.</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:220px;">24 well plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>662960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">48 well plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>677980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">CHIR99021</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3734-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Platinum- E cells</td>
			<td>Cell biolabs</td>
			<td>RV-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Puromycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Blasticidin</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A1113902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Polyethyleneimine (PEI)</td>
			<td style="width:157px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">opti-MEM</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">51985-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">TrypLE</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Parafilm</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P7793-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">4-OHT</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H7904</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture

Lgr5-положительным стволовые клетки могут быть дополнены с существенным ростом факторы EGF, Noggin, и R-Spondin, что позволяет нам культура постоянно расширяющийся первичные 3D эпителиальные структуры в пробирке. Оба архитектура и физиологические свойства этих «мини-кишок&quot;, которые также называются органоиды, напоминают свои аналоги в естественных условиях. Это делает их привлекательной моделью системы для малого кишечного эпителия. Использование ретровирусной трансдукции, функциональные генетика теперь могут быть выполнены с помощью условного избыточной экспрессии гена или нокдауна. Это видео демонстрирует процедуру Органоид культуры, генерирование ретровирусов, и ретровирусной трансдукции органоидам, чтобы помочь фенотипический анализ небольшого кишечного эпителия в пробирке. Этот роман органотипической модель системы в сочетании с выражением ретровирусная опосредованной генной предоставляет ценный инструмент для экспресс-анализа функции гена в пробирке без необходимости costlY и отнимает много времени для генерации трансгенных животных.

Органоидам готовы быть разделен, когда центральный просвет затемнены в связи с наличием мертвых клеток (рисунок 2). После 2-3 дней до начала лечения органоидов должны принять круглую кистозный морфологию (Рисунок 3). Это увеличивает количество стволовых клеток, повышает вероятность получения стабильной интеграции. Размер вирусной гранулы могут отличаться После центрифугирования вирусного супернатанта, скорее всего, за счет разной вклада клеточного дебриса от размера гранул. Нет четкой корреляции с эффективностью трансдукции не наблюдалось. Во время процедуры отбора не-трансдуцировали органоиды умрет, в то время как те, имеющие стабильный интеграция останется. Флуоресцентный белок из MSCV-EGFP ретровируса можно наблюдать в клетках, происходящих из выживших органоидам, которые имеют кистозный морфологию, в течение 2-3 дней после трансдукции (фиг.4). <img alt<html> = &quot;Рисунок 1&quot; FO: контент-ширина = &quot;6 дюймов&quot; SRC = &quot;/ файлы / ftp_upload / 51765 / 51765fig1highres.jpg&quot; ширина = &quot;600&quot; /&gt; Рисунок 1 схематически изображает ретровирусной трансдукции процедуры. До заражения органоидам предварительно обрабатывают с помощью ENRWntNic, пока они не принимают кистозную структуру (шаг 1). Платиновый-E клетки используют в качестве линии клеток упаковки, и культивируют, пока они не достигают 70-80% слияния. После этого они трансфицированы ретровирусной конструкции с использованием PEI. Вирусы собирают 2 дня спустя (шаг 2). Органоиды трипсинизируют получить фрагменты, содержащие 1-10 клеток (шаг 3), а затем инфицированных (шаг 4). После spinoculation повысить эффективность инфекции (этап 5), зараженные Органоид фрагменты высевают (шаг 6) и через 2-3 дня выбор для положительных клонов с стабильная интеграция может быть выполнена (этап 7). 1765fig2highres.jpg &quot;ширина =&quot; 500 &quot;/&gt; Рисунок 2 Представитель образ органоидов после 4-6 дней культуры. Просвет заполнен мертвых клеток, что делает его темным. Органоиды на данном этапе готовы пассировать. <img alt="Рисунок 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig3highres.jpg" width="500" /> Рисунок 3 Представитель образ тонкого кишечника органоидов, культивируемых в ENRWntNic СМИ в течение 3-4 дней. Эти органоиды принять кистозный морфологию. <img alt="Рисунок 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig4highres.jpg" width="500" /> Рисунок 4 Представитель образ тонкого кишечника органоидов (а), что показать вирусной экспрессии трансгена (B, EGFP). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Advaпродвинутый DMEM / F12 +++ </td></tr><tr><td colspan="2"> Хранить при 4 ° С в течение 4-х недель </td></tr><tr><td> Расширенный DMEM / F12 </td><td> 500 мл </td></tr><tr><td> Glutamax 100x </td><td> 5 мл </td></tr><tr><td> Гепес 1 М </td><td> 5 мл </td></tr><tr><td> Антибиотики 100x </td><td> 5 мл </td></tr><tr><td colspan="2"> ENRWntNic среднего (20 мл) </td></tr><tr><td colspan="2"> Хранить при 4 ° С в течение 2 недель </td></tr><tr><td> Расширенный DMEM / F12 +++ </td><td> 7,2 мл </td></tr><tr><td> B27 дополнения (50x) </td><td> 400 мкл </td></tr><tr><td> N2 добавка (100x) </td><td> 200 мкл </td></tr><tr><td> N-ацетилцистеин (500 мМ) </td><td> 50 мкл </td></tr><tr><td> мыши ЭФР (500 мкг / мл) </td><td> 2 мкл </td></tr><tr><td> мыши Noggin (100 мкг / мл) </td><td> 20 мкл </td></tr><tr><td> R-Spondin Кондитподкладку среднего </td><td> 2 мл </td></tr><tr><td> Wnt3a кондиционированной среды </td><td> 10 мл </td></tr><tr><td> Никотинамид (1 М) </td><td> 200 мкл </td></tr><tr><td colspan="2"> Трансдукция среднего (20 мл) </td></tr><tr><td colspan="2"> Подготовьте свежий </td></tr><tr><td> ENRWntNic среднего </td><td> 20 мл </td></tr><tr><td> Y-27632 (10 мкМ) </td><td> 20 мкл </td></tr><tr><td> Полибрен (8 мкг / мл) </td><td> 20 мкл </td></tr><tr><td colspan="2"> ENR среднего (20 мл) </td></tr><tr><td colspan="2"> Хранить при 4 ° С в течение 4-х недель </td></tr><tr><td> Расширенный DMEM / F12 +++ </td><td> 17,4 мл </td></tr><tr><td> B27 дополнения (50x) </td><td> 400 мкл </td></tr><tr><td> N2 добавка (100x) </td><td> 200 мкл </td></tr><tr><td> N-ацетилцистеин (500 мМ) </td><td> 50 мкл </TD&gt; </tr><tr><td> мыши ЭФР (500 мкг / мл) </td><td> 2 мкл </td></tr><tr><td> мыши Noggin (100 мкг / мл) </td><td> 20 мкл </td></tr><tr><td> R-Spondin кондиционированной среды </td><td> 2 мл </td></tr><tr><td colspan="2"> Медиа для платины-E клеток (на 500 мл) </td></tr><tr><td colspan="2"> Хранить при 4 ° С в течение 12 недель </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 449,45 мл </td></tr><tr><td> Эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) </td><td> 50 мл </td></tr><tr><td> Пуромицин (1 мкг / мл) </td><td> 50 мкл </td></tr><tr><td> Бластицидин (10 мкг / мл) </td><td> 500 мкл </td></tr></tbody></table> Таблица 1 Медиа композиция для Расширенный DMEM / F12 +++, ENRWntNic среды, Transduction среды, ENR среды и среды для платины-E клеток.

Watch this Scientific Journal Video about A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture at JoVE.com

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Видео Протокол ретровирусной инфекции в начальной кишечника Органоид культуры

Этот протокол объясняет основную Lgr5-positve Органоид культуру и последующее выполнение ретровирусов трансдукции. Это позволяет Cre-индуцибельную сверхэкспрессию или нокдаун поставляемого трансгена и позволяет функциональные исследования, которые будут проводиться в романе в пробирке Органотипической модель системы.

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Research

JoVE Journal

Biology

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Протокол денге инфекций в Комары (A. aegypti) и определение инфекции Фенотип

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

Первичные культуры и плазмиды электропорации мышей органа Корти.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Выделение и первичной культуре клеток крысы Печеночная

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

В режиме реального времени Анализ метаболического профиля в<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Мышь Кишечная Crypt Органоид Культуры

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Протокол Lentiviral трансдукции и вниз по течению анализа заболеваемости кишечными органоиды

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Изоляция и культура кератиноцитов первичной мыши от кожи новорожденных и взрослых мышей

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Апоптоз индукции и обнаружения в начальной культуре морских огурцов кишечных клеток

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

Органоидный эпителиальный монослой: клинически значимая модель in vitro для кишечной барьерной функции

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...

Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models

Методы культивирования для изучения апикально-специфических взаимодействий с использованием кишечных органоидных моделей

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...