Name: a video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture
Uploaded: 2014-08-11T18:30:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture at JoVE.com

Koo BK och Mustata RC stöds av Sir Henry Dale Fellowship från Wellcome Trust och Andersson-Rolf A stöds av Vetenskapsrådet (MRC). Fink J stöds av Wellcome Trust 4-års PhD-programmet.

Alla möss som används i följande protokoll hölls i specifika patogenfria förhållanden, och alla förfaranden genomfördes i enlighet med Storbritannien Home Office förordningar. 1 Förberedelser <ol><li> Förbered media 1 timme före användning (se tabell 1 och lista över material för mer information) och för-varm i ett 37 ° C vattenbad i minst 10 minuter före användning. </li></ol> 2. Odling Small Intestinal (SI) Organoids OBS: Om inget annat anges, är alla inkubationer utförs vid 37 ° C, 5% CO2 i en fuktad inkubator. Utrustning och reagenser som kommer i kontakt med levande celler måste vara sterila. Pre-uppvärmningen vävnadsodlingsplatta är viktigt eftersom det förhindrar källaren matrisen (Matrigel eller BME) droppar från att sprida ut när sådd. Dessutom bör källaren matris hållas på is vid alla tidpunkter. Lagra vid -20 ° C och tiningpå is före användning. <ol><li> Skilj Crypts <ol><li> För isolering av tunntarmen offra musen i enlighet med nationella regler och bestämmelser, och placera djuret på rygg och tvätta buken med 70% etanol. Utför en längsgående mittlinje snitt från ljumsken till bröstbenet. Först skära in i huden och sedan den subkutana vävnaden. Ta bort den lilla tarmen från blindtarmen till magsäcken. Kryptor isolerade från tolvfingertarmen, jejunum och ileum kan användas för organoid kultur. </li><li> Tvätta den isolerade tunntarmen med i förväg kyld fosfatbuffrad saltlösning utan kalcium eller magnesium (PBS0). </li><li> Skär vävnaden i 3-5 cm långa bitar och använda sax för att klippa det öppna längdriktningen. Sprid vävnaden med hjälp av pincett. </li><li> Skrapa bort villi med en täckglas. Varning, för mycket kraft gör att vävnaden att riva och kommer att minska avkastningen av kryptor i följande steg. </li><li> Överför vävnaden till ett 50 ml rör innehållande förkyld PBS0 using pincett. Tvätta vävnadsfragment genom kraftig skakning och ändra PBS0. Upprepa 2-3 x eller tills PBS0 vänder mindre grumlig. </li><li> Inkubera vävnaden i ett 50 ml rör innehållande 30 ml PBS0 med 1 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) under 30 min vid 4 ° C på ett rör rullen. </li><li> Skaka röret och överför vävnaden till en annan 50 ml rör som innehåller 30 ml PBS0 med 5 mM EDTA. Den 1 mM EDTA-lösning (tidigare innehållande vävnad) kommer att innehålla en blandning av kryptor och villi. Denna fraktion är inte lämplig för ympning av organoids eftersom det ofta innehåller en hög procentandel av tarmludd. </li><li> Inkubera vävnaden ytterligare under 1 h vid 4 ° C på ett rör rullen. </li><li> Skaka röret och samla lösningen i en ren 50 ml tub. Bekräfta förekomsten av kryptor och uppskatta antalet, till exempel genom att räkna kryptor i 50 l med ljusmikroskop. Beräkna volymen som behövs för att få 50-100 kryptor och överföra den till en 1,5 ml tUbe. </li><li> Snurra vid 300 xg under 5 min. Kasta bort supernatanten, återsuspendera pelleten i 50 | il av basalmatrisen, och frö i en förvärmd 24-brunnar. Inkubera plattan i en vävnadsodlingsinkubator under 5-15 minuter så källaren matrisen polymeriserar. </li><li> Överlagring med 500 | il ENR-medium (se tabell 1). Cirka 24 timmar efter sådd organoids kommer att visa en liten rund cystisk form och efter ytterligare 2-3 dagar spirande strukturer blir synliga. Byt till nya ENR media var 3 dagar. </li><li> Passage organoid kulturer var 7 dagar. </li></ol></li><li> Passaging och Underhålla Organoids <ol><li> Behåll de organoids genom att uppdatera media var 3 dagar och passage 1: 3 eller 1: 5 som lumen fylls med döda celler, ungefär var 7 dagar. </li><li> Bryt källaren matrisen kupolen med medium med användning av 1 ml pipetman spets och överföra den från brunnen till ett 1,5 ml rör. </li><li> Mekaniskt dissociera organoids genom pipettering approximately 50x med en fin (t.ex. 200 l) tips. </li><li> Snurra vid 300 xg under 5 min. </li><li> Kasta bort supernatanten och suspendera pelleten i 150-250 pl källaren matris. Seed i en förvärmd 24-brunnar (50 pl av basalmatrisen / brunn). Före sådd pipett källaren matris upp och ner en gång för att belägga väggen av spetsen. Pipettera långsamt för att undvika bubblor och frön i mitten av brunnen för att förhindra källaren matris från utspridning. Det är önskvärt att få en kupol av basalmatrisen i centrum av brunnen. </li><li> Inkubera i en vävnadsodling inkubator för 5-15 minuter så källaren matrisen polymeriserar. Overlay med 500 l ENR media per brunn. </li></ol></li></ol> 3 Pre-infektion Behandling av SI Organoids OBS: Figur 1 illustrerar transduktion förfarandet. <ol><li> Exchange ENR till ENRWntNic (se tabell 1) medium och odla organoids itsitt medium i minst 3 dagar eller tills de har antagit en cystisk morfologi. Wnt3a ökar antalet stamceller och Paneth celler medan Nikotinamid (Nic) förbättrar odlingseffektiviteten. </li></ol> 4. Virus Produktion <ol><li> Det krävs en 150 mm skål av platina-E-celler per infektion. Seed approximativt 5 x 10 6 celler med 15-18 ml medium (DMEM + 10% FBS) i närvaro av puromycin (1 | ig / ml) och blasticidin (10 pg / ml). Transfektera celler efter 2-3 dagar, när de har nått 70-80% konfluens. Ändra medium till DMEM + 10% FBS utan puromycin och blasticidin före transfektion. </li><li> Tillsätt 30 mikrogram av retroviral DNA-konstruktion och 240 l av polyetylenimin (PEI) för att separera rör innehållande 1 ml opti-MEM. Blanda och inkubera vid rumstemperatur under 5 min. </li><li> Samla de två lösningarna och inkubera vid rumstemperatur under 20-30 min. Lägg blandningen som helhet till mediet i Platinum-E-celler och försiktigt skaka plate för att garantera lika fördelning av DNA-PEI-komplex. </li><li> Inkubera Platinum-E celler med transfektionsblandningen natten och uppdatera mediet följande dag. Håll cellerna i det nya mediet under 2 dagar. </li><li> Samla bara mediet i en 50 ml Falcon-rör, passerar den genom ett 0,45 pm filter och centrifugera vid 8000 xg vid 4 ° C under 12-16 timmar. Kasta bort supernatanten och återsuspendera pelleten i 250 | il av Transduktion medium (se tabell 1). </li></ol> 5. organoid Fragment Framställning <ol><li> För en infektion behövs en brunn från en 24-brunnar. Bryt källaren matrisen kupolen med medium med användning av 1 ml pipetman spets och överföra det till ett 1,5 ml rör. </li><li> Använd en finare volym tips (t.ex. 200 il tips) för att mekaniskt störa organoids genom pipettering (30-50x). Lösningen blir grumlig och inga hela organoids ska synas. </li><li> Centrifugera vid rumstemperatur, 900 xg under 5 min<html> . </li><li> Kasta bort supernatanten och återsuspendera pelleten i 500 | il av cellodlingskvalitet rekombinant proteas (t.ex. TrypLE). Inkubera vid 37 ° C under 5 min. Efter inkubation kontrollera storleken på de organoid fragmenten med ljusmikroskop, räkna antalet celler per fragment. Fragment som innehåller 5-10 celler är idealiska. Om majoriteten av fragmenten innehåller ett större antal celler kan ökas inkubationstiden av 2 min vid en tidpunkt. </li><li> Avsluta dissociation processen genom att tillsätta 500 l av ENR medium. </li><li> Centrifugera vid rumstemperatur, 900 xg under 5 min. Avlägsna supernatanten och hålla pelleten på is eller 4 ° C. </li></ol> 6. Retroviral Transduction <ol><li> Kombinera organoid fragment med 250 | il av den retrovirala lösning (från avsnitt 4.5) i en brunn på en 48-brunnars platta. Blanda försiktigt genom långsam pipettering hjälp av 1 ml pipetman spets. </li><li> Täta plattan med Parafilm. </li></ol>e &quot;&gt; 7. Spinoculation och Plating <ol><li> Centrifugera plattan vid 32 ° C, 600 x g, under 1 timme. Ta försiktigt bort Parafilm och inkubera plattan i en vävnadsodling inkubator under 6 timmar. </li></ol> 8 Sådd av Infected organoid Fragments <ol><li> Överför infekterade organoid fragment och transduktion media från brunnen till ett 1,5 ml rör och centrifugera vid 900 xg under 5 minuter. </li><li> Kasta bort supernatanten och placera röret med pellets på is i 5 min till cool. Lägg 100 pl av basalmatrisen och suspendera pelleten genom pipettering långsamt upp och ner. </li><li> Seed droppar av 50 ^ il &#39;basalmatrisen -cell mix &quot;i en ny 24-brunnars platta. Inkubera plattan vid 37 ° C under 5-15 min tills de basalmatris stelnar. </li><li> Lägg transduktion medier utan polybren till brunnarna och inkubera plattan i en vävnadsodlingsinkubator. Ändra media var 2-3 dagar. </li></ol> 9. Urval <ol><li> Börja SOling efter 2-3 dagar genom att lägga puromycin (1 mikrogram / ml) till media. </li><li> När fragmenten börjar bilda organoids ersätta Transduktion media med ENR media kompletterade med puromycin (1 | ig / ml). </li></ol> 10. Post-infektion Behandling av SI Organoids <ol><li> Kultur omvandlade organoids enligt &quot;Passaging och upprätthålla organoids&quot; protokoll (avsnitt 2.2.1). Efter 1-2 veckor SI organoids kommer att återfå sina spirande strukturer. </li><li> Efter uppkomsten av spirande strukturer inducerar uttrycket av miRNA eller cDNA genom att lägga till 4-hydroxitamoxifen (4-OHT) i en arbetskoncentration av 1 iM. Observera att detta steg är giltigt endast om du använder retrovirusvektorer från Addgene (pMSCV-loxP-dsRed-loxP-eGFP-Puro-WPRE (32702), pMSCV-loxP-dsRed-loxP-3xHA-Puro-WPRE (32703), och pMSCV Luck-puro-dsRed-GFP-miRNA (32704)) och organoids uttrycker Cre-ERT2. </li></ol> 11 Bekräftelse av infektion och Expression / Dämpning av genen av intresse <ol><li> Om du använder retrovirusvektorer från Addgene (32702, 32703 och 32704) transduktionseffektiviteten kan bekräftas genom observation av dsRed uttryck. Vidare kan uttrycket eller undertryckande av genen av intresse bekräftas av Western Blot, med hjälp av GFP eller 3xHA epitop (för gen överuttryck) och qPCR (för gen knockdown), vilket exemplifieras i Koo et al 4. </li></ol>

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell:+mechanism+and+applications.">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li><li>Stelzner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nomenclature+for+intestinal+in+vitro+cultures.+American+journal+of+physiology.">A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American journal of physiology.</a> Gastrointestinal and liver physiology. 302, G1359-G1363 (2012).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature. 9, 81-83 (2012).</li><li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+BAC+Transgenic+Epithelial+Organoids.">Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids.</a> PloS one. 8, e76871 (2013).</li><li>Mustata, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr4+is+required+for+Paneth+cell+differentiation+and+maintenance+of+intestinal+stem+cells+ex+vivo.">Lgr4 is required for Paneth cell differentiation and maintenance of intestinal stem cells ex vivo.</a> EMBO reports. 12, 558-564 (2011).</li><li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5+homologues+associate+with+Wnt+receptors+and+mediate+R-spondin+signalling.">Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling.</a> Nature. 476, 293-297 (2011).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+suppressor+RNF43+is+a+stem-cell+E3+ligase+that+induces+endocytosis+of+Wnt+receptors.">Tumour suppressor RNF43 is a stem-cell E3 ligase that induces endocytosis of Wnt receptors.</a> Nature. 488, 665-669 (2012).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> The EMBO journal. 32, 2708-2721 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494, 247-250 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose. The authors have no conflict of interest declared.

<html> För att uppnå hög transduktionseffektiviteten vissa aspekter är kritiska. En är förbehandling av organoids med ENRWntNic media tills de antar en rund cystisk form. Detta ökar antalet stamceller och därigenom möjligheten att erhålla en stabil integrering av transgenen, såväl som att öka överlevnadsgraden för de SI organoids hela transduktion förfarandet. En annan parameter är inkubationstiden efter spinoculation. För kort eller för lång inkubationstid resulterar i dålig transduktion effektivitet och dålig överlevnad organoids, respektive. Det spinoculation steget är inte nödvändigt även om det signifikant ökar andelen omvandlade organoids. Slutligen är hög titer virus nyckel för framgångsrik transduktion. Detta är beroende av den typ av förpackning cellinje och virus. Kombinationen av platina-E cellinjen och murina stamcellviruset (MSCV), befanns producera en titer tillräckligt högt för transduktion av organoids. ve_content &quot;&gt; Här är tips för felsökning som kan bidra till att uppnå framgångsrik transduktion. första, om transfektion av packningscellinjen är dålig, se till att sammanflyt av cellerna är mellan 70-80% och att inkubationstiden för poolad PEI-DNA-blandningen är mellan 20-30 min. Överlevnaden av organoids under transduktion beror i hög grad på fragmentstorlek. För lång trypsinization orsakar majoriteten av fragment för att bestå av mindre än 3 celler och därmed minskar organoid överlevnadsförmåga. En annan faktor är aktiviteten av Wnt medium, om verksamheten för lågt öka den genom tillägg av CHIR99021 i en arbetskoncentration av 5 ^ M kan öka överlevnaden. CHIR99021 hämmar GSK3, vilket resulterar i ökad Wnt-signalering. Dessutom Y-27362, vilket förhindrar anoikis är som läggs till de överföringsmedia för att förbättra organoid överlevnads eftersom organoids störs till fragment (innehållande 1-10 celler) före transduktion.60; nämnts ovan bör inkubationstiden efter spinoculation inte överstiga 6 tim. Slutligen, om dålig transduktion observeras ovan nämnda faktorer som påverkar den virala titer och storleksgränsen av insatsen för retrovirusvektorn bör övervägas. Effektiviteten i knockdown är mycket beroende av miRNA. Eftersom verkningsgraden varierar med kombinationen av målgenen och miRNA det är värt att utföra en effektivitets skärmen för att identifiera de som fungerar bäst. Tekniken är begränsad till de epiteliala företeelser organoid systemet. I framtiden kan det bli möjligt att studera infektiösa eller immunmedierade sjukdomar genom samodling av patogener, eller rekonstitution med komponenter som härrör från immunsystemet, respektive. Dessutom kan retrovirus bara bära insatser av relativt liten storlek. Följaktligen har naturligt förekommande regulatoriska regioner som skall uteslutas och därför expressionen av transgenen inte kan efterlikna den hosden endogena genen. Såsom nämnts ovan är den knockdown effektivitet beroende målgenen och miRNA. Om man inte kan finna miRNA med lämpliga knockdown effektivitet kan begränsa användningen av tekniken för just målgen. Teoretiskt organoids är kompatibla med alla standardiserade manipulativa tekniker som används för cellinjer. Retroviral transduktion var den första metod som skall rapporteras 4, och nyligen BAC (bakteriell artificiell kromosom) -transgenesis har blivit tillgängliga 5. Med en total generationstid av 2-3 veckor, efter transfektion av det virala plasmiden in i förpacknings cellinje, är det betydligt snabbare än generering av en transgen (tg) mus. Genom att upprätthålla den in vivo-crypt-villus arkitektur medan innehållande stamceller liksom alla differentierade cellinjer av tarmepitelet, överbryggar organoid odlingssystem gapet mellan tg djur och tidigare använda cellkultur. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Protokollet som beskrivs här ger en metod för att utföra fenotypisk analys av endodermalt epitel in vitro genom GAIN- och förlustfunktionsstudier. Detta gör det möjligt att ta itu med fysiologiskt relevanta frågor inom vuxenstamcellsbiologi, med ett minimalt behov av tg möss. Till exempel kan genereringen av villkorade knockoutmöss undvikas genom användning organoids härledda från nyfödda mutanter med perinatal dödlighet 6. Dessutom kan tekniken appliceras på organoids härledda från tidigare fastställda knockoutmöss för att studera rollen av paraloger genom att utföra ytterligare knockdown 7,8. Efter inrättandet av små tarm organoids har anpassning av den ursprungliga kulturen protokollet tillät odling av bukspottkörteln, levern, kolon och magen epitel 9-11. Dessutom har människans tarm organoids och tumör organoids härletts från normala mänskliga biopsier, primär adenoma och kolorektal cancer biopsier 10. Den virusinfektion protokoll kan lätt utvidgas till dessa typer av organoids och ger en oöverträffad sätt att utföra funktionella studier i humana härledda vävnader. Sammantaget är retroviral transduktion av små tarm organoids en värdefull resurs för stamcells underhåll, differentiering och cell öde beslut, samt cellsignalering och celler cell interaktioner utreda.

Hög genomströmning funktionella genetik behövs för att öka vår biologiska förståelsen av kroppen, för att förbättra nuvarande grundvetenskap och medicin. Mus-genetik har varit den gyllene standarden för att undersöka genfunktion in vivo, även om det är både tidskrävande och kostsamt. Cellinjer, som är den andra vanligaste valet, har en högre genomströmningskapacitet samtidigt som billigare. Men de hindras av sin oförmåga att återge korrekt mikromiljö och därigenom fysiologiska reaktioner ses in vivo. Därför finns det ett otvetydigt behov av ett lätt hantera modellsystem, vilket gör att kostnaden / tidseffektiv hög genomströmning analys, samtidigt som härma de fysiologiska reaktioner som observerats i in vivo transgena (tg) mus experiment. För endodermalt epitel ett sådant modellsystem dök upp i 2009 1. Bland kunskap från upptäckten av Lgr5-positiva intestinala stamceller varinformation om den nisch som motsvarar de extracellulära matrix och tillväxtfaktorer som är nödvändiga för stamcells underhåll. Med hjälp av denna information blev det möjligt att upprätta &quot;mini guts&quot; även känd som organoids 2. Nyligen konsensus nomenklatur för in vitro-kulturer, där organoids benämns &quot;enteroids&quot;, föreslogs 3. Liksom cellinjer, de organoids är ständigt växande och lätt att behandla med ligander och inhibitorer. Men istället för att vara tvådimensionell de är tredimensionella självorganiserande strukturer som behåller kryptan-villus organisation samt stamceller och differentierade cellinjer i tunntarmen (SI). Organoids bestå av ett enda skikt av epitelceller som omger en luminal yta. Utskjutande spirande strukturer motsvarar små tarm kryptor som innehåller stamceller. Utgående från spetsen på knoppstrukturen progenitorceller differentiera som de migaller mot epitelbeklädnaden där terminalt differentierade celler skjul i lumen. Jämfört med cellinjer, denna ex vivo-system rekapitulerar närmare den normala fysiologin och är därför en lovande modellsystem för tunntarmens epitel. I den här videon protokoll av retroviral transduktion, presenterar vi en metod som gör det möjligt för ex vivo gen funktionsstudier i denna roman organoid odlingssystem. Vi börjar med att beskriva organoid kultur i en steg-för-steg sätt, och fortsätter genom att visa generering av retrovirus följt av transduktion förfarandet. Slutligen finns det en avdelning för ytterligare råd för felsökning. En fördel med denna teknik är att den kan kombineras med levande avbildning eller drogscreening för att studera homeostasis, beslut cell öde och cell-cell interaktioner i tarmepitelet. På grund av sin enkla arkitektur och snabb omsättningshastighet, organoids utgör en ideal modell ssystemprogram för att studera vuxna stamcellsbiologi. Dessutom kan tillämpas retroviral transduktion till organoids härrör från förutbestämda transgena möss samt humana patientprover. Som knock-in och knock-out metoder inte kan utvidgas till människor, de mänskliga SI organoids utgör ett attraktivt alternativ. Sammanfattningsvis genmanipulation genom retroviral transduktion möjliggör fenotypisk analys i små intestinala organoids härledda från möss eller vävnadsprover mänskliga och därmed komplettera mus genetik och cellinjer samtidigt öppna nya vägar för studier i mänskliga härrör vävnader. Retroviral transduktion möjliggör GAIN- och förlust av funktionsstudier som ska utföras i organoid odlingssystemet 4. Detta gör den till en värdefull resurs för att undersöka geners funktion, vuxna stamcellsbiologi och sjukdomar samtidigt vara i enlighet med de tre R (minskning, förfining, och ersättnings).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1090">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:220px;">Advanced DMEM/F12&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12634-034</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Glutamax 100x&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">35050-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Hepes 1M&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin- Streptomycin 100x</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">B27 supplement 50x</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">N2 supplement 100x&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">n-Acetylcysteine 500 mM&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse EGF 500 &#181;g/ml</td>
			<td>Invitrogen Biosource</td>
			<td>PMG8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse Noggin 100 &#181;g/ml&#160;&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">R-Spondin conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The conditioned media is generated&#160; from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Wnt conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The conditioned media is generated&#160; from L cells, for details see Sato and Clevers 2013</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Nicotinamide 1 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Y-27632 10 &#181;M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polybrene 8 &#181;g/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;">Standard BD Matrigel matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td style="width:595px;">Basement Matrix Extract (Cultrex PathClear BME Reduced Growth Factor Type 2, 3533-005-02 ) 
			supplied by AMSBIO can be used as an alterntive.</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:220px;">24 well plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>662960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">48 well plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>677980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">CHIR99021</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3734-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Platinum- E cells</td>
			<td>Cell biolabs</td>
			<td>RV-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Puromycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Blasticidin</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A1113902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Polyethyleneimine (PEI)</td>
			<td style="width:157px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">opti-MEM</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">51985-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">TrypLE</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Parafilm</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P7793-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">4-OHT</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H7904</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture

Lgr5-positiva stamceller kan kompletteras med den väsentliga tillväxtfaktorer EGF, Noggin, och R-Spondin, som tillåter oss att kulturen ständigt växande primära 3D epitelceller strukturer in vitro. Både arkitektur och fysiologiska egenskaperna hos dessa &quot;mini guts&quot;, även kallade organoids, mycket lika deras in vivo motsvarigheter. Detta gör dem till ett attraktivt modellsystem för tunntarmens epitel. Använda retroviral transduktion, kan funktionella genetik nu utföras av villkor gen överuttryck eller knockdown. Denna video visar proceduren i organoid kultur, generering av retrovirus, och den retrovirala transduktion av organoids att bistå fenotypisk analys av tunntarmens epitel in vitro. Denna nya organotypisk modellsystem i kombination med retroviral medierad genuttryck ger ett värdefullt verktyg för snabb analys av geners funktion in vitro utan behov av costly och tidskrävande generation för transgena djur.

Organoids är klara att delas när den centrala lumen är mörkare på grund av närvaron av döda celler (Figur 2). Efter 2-3 dagar av förbehandlings organoids bör anta en rund cystisk morfologi (Figur 3). Detta ökar antalet stamceller, förbättra chanserna att få en stabil integration. Storleken av den virala pelleten kan variera efter centrifugering av den virala supematanten, sannolikt på grund av varierande bidrag av celldebris till pelletstorlek. Ingen tydlig korrelation till transduktionseffektiviteten har observerats. Under urvalsförfarandet icke omvandlade organoids kommer att dö, medan de som har en stabil integration kommer att förbli. Den fluorescerande protein från MSCV-EGFP retrovirus kan observeras i celler som härrör från överlevande organoids, som har en cystisk morfologi, inom 2-3 dagar efter transduktion (Figur 4). <img alt<html> = &quot;Bild 1&quot; fo: content-width = &quot;6in&quot; src = &quot;/ filer / ftp_upload / 51765 / 51765fig1highres.jpg&quot; width = &quot;600&quot; /&gt; Figur 1 En schematisk ritning av den retrovirala transduktion förfarandet. Före infektion organoids är förbehandlade med användning ENRWntNic tills de antar en cystisk struktur (steg 1). Platina-E celler används som den förpackande cellinjen och odlas tills de når 70 till 80% konfluens. Därefter de transfekteras med retroviral konstruktion med hjälp av PEI. Virus skördas två dagar senare (steg 2). Organoids trypsineras till fragment innehållande 1-10 celler (steg 3), och sedan smittade (steg 4). Efter spinoculation att öka infektionseffektiviteten (steg 5), är de infekterade organoid fragmenten seedade (steg 6) och 2-3 dagar senare val för positiva kloner med stabil integration kan utföras (steg 7). 1765fig2highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figur 2 Representant bild av organoids efter 4-6 dagars odling. Lumen är fylld med döda celler, vilket gör det verkar mörkt. Organoids i detta skede är redo att passe. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig3highres.jpg" width="500" /> Figur 3 Representant bild av små tarm organoids odlade i ENRWntNic media för 3-4 dagar. De organoids anta en cystisk morfologi. <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig4highres.jpg" width="500" /> Figur 4 Representant bild av små tarm organoids (a) som visar viral transgenuttryck (b, eGFP). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Advanced DMEM / F12 +++ </td></tr><tr><td colspan="2"> Förvara vid 4 ° C under 4 veckor </td></tr><tr><td> Avancerad DMEM / F12 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Glutamax 100x </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Hepes 1 M </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Antibiotika 100x </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> ENRWntNic medium (20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Förvara vid 4 ° C under 2 veckor </td></tr><tr><td> Avancerad DMEM / F12 +++ </td><td> 7,2 ml </td></tr><tr><td> B27 supplement (50x) </td><td> 400 | il </td></tr><tr><td> N2 tillägg (100x) </td><td> 200 | il </td></tr><tr><td> N-acetylcystein (500 mM) </td><td> 50 | il </td></tr><tr><td> mus EGF (500 ng / ml) </td><td> 2 | il </td></tr><tr><td> mus Noggin (100 pg / ml) </td><td> 20 | il </td></tr><tr><td> R-Spondin Conditioned mediet </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> Wnt3a konditionerat medium </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> Nikotinamid (1 M) </td><td> 200 | il </td></tr><tr><td colspan="2"> Transduktion medium (20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Bered en färsk </td></tr><tr><td> ENRWntNic mediet </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> Y-27632 (10 pM) </td><td> 20 | il </td></tr><tr><td> Polybrene (8 ng / ml) </td><td> 20 | il </td></tr><tr><td colspan="2"> ENR-medium (för 20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Förvara vid 4 ° C under 4 veckor </td></tr><tr><td> Avancerad DMEM / F12 +++ </td><td> 17,4 ml </td></tr><tr><td> B27 supplement (50x) </td><td> 400 | il </td></tr><tr><td> N2 tillägg (100x) </td><td> 200 | il </td></tr><tr><td> N-acetylcystein (500 mM) </td><td> 50 | il </td&gt; </tr><tr><td> mus EGF (500 ng / ml) </td><td> 2 | il </td></tr><tr><td> mus Noggin (100 pg / ml) </td><td> 20 | il </td></tr><tr><td> R-Spondin konditionerat medium </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Media för Platinum-E-celler (för 500 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Förvara vid 4 ° C under 12 veckor </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 449,45 ml </td></tr><tr><td> Fetalt bovint serum (FBS) </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> Puromycin (1 ng / ml) </td><td> 50 | il </td></tr><tr><td> Blasticidin (10 pg / ml) </td><td> 500 | il </td></tr></tbody></table> Tabell 1 Medie komposition för Advanced DMEM / F12 +++, ENRWntNic medium, Transduction medium, ENR medium och medium för Platinum-E-celler.

Watch this Scientific Journal Video about A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture at JoVE.com

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

En video-protokollet av retroviral infektion i Primär Intestinal organoid kultur

Detta protokoll förklarar primära Lgr5-positve organoid kulturen och den efterföljande prestanda retroviral transduktion. Detta gör att Cre-inducerbart överuttryck eller knockdown av den levererade transgenen och tillåter funktionella studier som skall utföras i romanen in vitro organotypisk modellsystem.

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Research

JoVE Journal

Biology

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Protokoll för Dengue Infektioner i Myggor (A. aegypti) och infektion Fenotyp Fastställande

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

Primär Kultur och Plasmid elektroporation av Murine organ Corti.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolering och Primär kultur av celler Rat Hepatiska

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analys av Metabolic profil i<em&gt; Ex vivo</em&gt; Mouse Intestinal Crypt organoid kulturer

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Ett protokoll för Lentiviral Transduction och Nedströms Analys av Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Isolering och kultur av primära muskeratinocyter från neonatal och vuxen mushud

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Apoptos induktion och detektion i en primär kultur av hav gurka tarmceller

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

Organoid-härledd epitelial monolager: En kliniskt relevant in vitro-modell för tarmbarriärfunktion

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...

Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models

Odlingsmetoder för att studera apical-specifika interaktioner med hjälp av intestinala organoidmodeller

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...