Name: real-time imaging of endothelial cell-cell junctions during neutrophil transmigration under physiological flow
Uploaded: 2014-08-14T15:00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow at JoVE.com

The authors thank Dr. P.L. Hordijk for critically reading the manuscript. AED is supported by a Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR) fellowship (grant #1028). JK is supported by the Dutch Heart Foundation (2005T3901). JDvB is a NHS Dekker fellow (grant #2005T039).

Nøytrofile ble isolert fra friske frivillige som har signert et informert samtykke. Forskning har blitt utført i samsvar med de institusjonelle og nasjonale retningslinjer for menneskelig velferd. 1. Plating og vedlikehold av menneskelige umbilical vein endotelceller <ol><li> Kultur Menneskelig umbilical vein endotelceller (HUVECs) i henhold til produsentens instruksjoner. Grow HUVECs på fibronektin (FN)-belagt retter (10 mikrogram / ml, oppløst i demineralisert vann) ved hjelp av media (endothelial Basal Medium (EBM-2) medium supplert med endothelial growth Medium (EGM-2) singlequots). Bruk cellekultur mellom 4-8 passeringer for eksperimenter. </li><li> Dag 1: Klesstrømnings-kammer med 100 mL av fibronektin (10 ug / ml i PBS) i minst 2 timer ved 37 ° C og 5% CO2. </li><li> Dag 2: Når cellene når 80-90% sammenløp, trypsinize cellene etter grundig vasking med RT fosfatbufret saltvann (PBS) pH 7,4, sentrifuger ved 800 xg og resuspender på 800.000 celler / ml ved hjelp av media. Plate 80.000 celler i hver enkelt kanal av de FN-belagt flyt-kamre og forsiktig pipette cellesuspensjonen opp og ned. Kultur O / N i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2. </li><li> Dag 3: Oppdater media i flyten-kammer lysbilde ved å forsiktig vippe raset i 45 ° vinkel. (Se figur 1A). MERK: Det anbefales å fjerne mediet bare i reservoarene og ikke i kanalen selv. Fjerning av mediet i kanalene kan resultere i tap av endotelceller og død på grunn av den kraft å dra av mediet som følge av pipettering. </li><li> Kontroller ved fasekontrastmikroskopi hvis endotelceller har dannet et monosjikt (dvs. 100% sammenflytende). Hvis cellene er ikke 100% konfluent, endre medie to ganger om dagen til de når 100% samløpet. </li><li> Når cellene har nådd sammenflyting, stimulere cellene med medium (se trinn1.1) inneholdende inflammatorisk mediator (TNF-α (10 ng / ml)). Stimulerende HUVECs O / N (dvs. 12 timer) med TNF-α resulterer i en inflammatorisk fenotype av endotelet, dvs.. Opp-regulering av celle adhesjonsmolekyler slik som ICAM-1 og VCAM-1-13. </li></ol> 2. plymorfonukleære Leukocyte Isolation Bruke Percoll overgangar <ol><li> Forbered N-2-hydroksyetylpiperazin-N&#39;-2-etansulfonsyre (HEPES) -buffer (heretter kalt: flyt-buffer) før isolering av polymorfonukleære leukocytter (PMN). Flow-bufferen brukes for å vaske isolerte PMNs og som buffer i strømnings assay. For å fremstille strømnings-buffer: fortynne 7,72 g NaCl (132 mM), 4,76 g HEPES (20 mM), KCl 0,45 g (6 mM), 0,25 g MgSO 4 • 7H 2 O (1 mM), 2 K HPO 4 • 3H 2 O (1,2 mM) i 1 l demineralisert vann og juster til pH 7,4 (dette lager kan holdes ved 4 ° C i flere uker). </li><li> Legg fersk 100 pl 1 M CaCl 2 &amp; #160; (1 mM), 2,5 ml humant albumin, fra en 200 g / L lager konsentrasjon (0,5% v / v) og 0,1 g glukose til 100 ml (0,1% w / v) av strømnings-buffer. Deretter filtrerer flyten-buffer ved bruk av en 0,45 mikrometer filter. MERK: Denne flow-buffer må være forberedt frisk for hvert eksperiment. </li><li> Før isolering av PMN, klar 10% trinatrium-citrat (TNC) oppløsning i PBS, pH 7,4. </li><li> Samle 20 ml fullblod i natrium-heparin vacuettes fra en frisk frivillig. Fortynn helblod 1: 1 med 10% PBS / TNC i 50 ml rør og pipette 20 ml fortynnet blod forsiktig opp i 12,5 ml Percoll (en 23% (w / w) kolloidal oppløsning i vann med en densitet på 1,130 g / ml) i en ny 50 ml rør. Nøye plassere rørene i sentrifugen og spinn i 20 minutter ved 800 xg med lav akselerasjon, og ingen pause stilt ved RT. MERK: Når du legger fortynnet blod til Percoll®, vipp Percoll® holdige rør i en 45 ° vinkel og forsiktig pipette fortynnet blod i røret viddh den tregeste pipette gutten setting. </li><li> Fjern all væske og deretter fylle røret med iskald erytrocytt lysis-buffer (4,15 g NH4Cl [0,155 M], 0,5 g KHCO 3 [0,01 M] og 18,5 mg EDTA (triplex III) [0,1 mM] i 500 ml iskald H 2 O) for å lysere erytrocytter. La røret på is, av og til røret ble snudd, inntil suspensjonen blir mørk rød, etterfulgt av sentrifugering 500 xg i 5 min ved 4 ° C med pauser muliggjort. MERK: pellet fraksjonen inneholder PMNs (nøytrofile, eosinofile, basofile) sammen med erytrocytter. </li><li> Fjern supernatanten og pelleten vaskes to ganger i iskald lysis-buffer ved 500 xg i 5 min ved 4 ° C. </li><li> Resuspender pellet med flow-buffer ved RT og bestemme PMNs konsentrasjon ved hjelp av enten en hemocytometer eller automatisert celleteller. Suspender det PMNs i strømnings-buffer på 1 x 10 celler / ml 6 og holde ved RT. </li></ol> 3. Merking av Endothelial Junctional VE-cadherin og PECAM-en <ol><li> Legg til PECAM Alexa Fluor 647 antistoff (klone WM59) på en 1: 100 fortynning og kalsium-uavhengig VE-cadherin-FITC antistoff (klone 55-7H1) ved en 1:50 fortynning til HUVEC kultur medium (se trinn 1.1), og inkuberes i 30 minutter før start av strømnings eksperiment for å visualisere junctional dynamikken i endotelceller under neutrofil sjele under fysiologiske strømningsforhold. MERK: Før du legger til de direkte merkede antistoffer mot strømnings-kamre, sikre at volumet i hver kanal ikke overstiger 100 mL. Dette bidrar til å holde antistoff utgiftene så lave som mulig. </li></ol> 4. PMN TEM analysen Under Flow <ol><li> Plasser PMNs i et vannbad i 15 min ved 37 ° C før injeksjon av dem inn i flow-system. </li><li> Koble slangen til en tom strømningskammeret og fylles med varm (f.eks, 37 ° C) strømnings-buffer (se trinn 4.3) til å hindre dannelse av luftbobler ved innstilling the strømningssystem. </li><li> Koble den ene siden av en tom strømnings-kammeret til sprøytepumpen strømningssystem ved å bruke silikonslanger som inneholder en 20 ml sprøyte, og sette strømningskammeret inn i mikroskopet stadium. </li><li> Koble den andre siden av en tom strømningskammeret til reservoaret kolbe fylt med 37 ° C flyt-buffer (figur 1B), og start sprøytepumpe for å fylle hele røret med strømnings-buffer. Pumpen vil trekke strømnings-buffer fra reservoaret gjennom strømningskammeret inn i sprøyten. NB: Denne slangen inneholder også en in-line Luer injeksjonsport, som tillater PMNs som skal injiseres med en nål inn i en løpende eksperiment uten å stoppe strømmen og skape luftbobler. </li><li> Erstatt den tomme flow-kammer med flyt-kammeret inneholder TNF-α-behandlet HUVECs, koble flow-buffer holdige rør og plassere den i mikroskopet scenen (figur 1C). Knip av rørene før du kobler fra og kobler tilm til de kamre som inneholder HUVECs, som ikke knipe seg kan resultere i dannelsen av luftbobler inne i produksjonsrøret og / eller flyt-kamre. </li><li> Justere strømningshastigheten til en dyn / cm 2, i samsvar med fysiologisk strømningshastigheten i postkapillære venules (1-5 dyn / cm 2). </li><li> Record Differential Interference Kontrast (DIC), FITC (488 nm) og Alexa Fluor 647 (647 nm) samtidig bruker en konfokal laser scanning mikroskop. </li><li> Injisere PMNs (trinn 4.1) langsomt i flow-systemet via den innebygde Luer injeksjonsport (figur 1D) med 1 ml sprøyter. </li><li> Etter noen minutter, leukocytter vises, holder seg, og transmigrere. Stopp eksperiment ved hvilket som helst ønsket tidspunkt ved å kople slangen fra strømningskammeret og pipettering fikseringsmiddel (3,7% formaldehyd i PBS) inn i strømningskammeret. Tillat fiksering i 10 min, etterfulgt av vasking med PBS. Data blir analysert ved hjelp av bildebehandlingsprogrammer (se materialer og utstyr tabell). MERK: Utfør han eksperiment ved hjelp av en konfokal laser scanning mikroskop utstyrt med et klimakammer med en konstant temperatur på 37 ° C, 5% CO2, og en 63X olje-objektiv. </li></ol>

<ol>
	<li>Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis--an+inflammatory+disease.">Atherosclerosis--an inflammatory disease.</a> N. Engl. J. Med. 340, 115-126 (1999).</li><li>Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell+migration+in+inflammation:+present+and+future+therapeutic+targets.">Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets.</a> Nat. Immunol. 6, 1182-1190 (2005).</li><li>Szekanecz, Z., Koch, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+involvement+in+rheumatic+diseases:+'+vascular+rheumatology.">Vascular involvement in rheumatic diseases: ' vascular rheumatology.</a> Arthritis Res. Ther. 10, 224 (2008).</li><li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial+cell+recognition:+three+(or+more)+steps+to+specificity+and+diversity.">Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67, 1033-1036 (1991).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76, 301-314 (1994).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).</li><li>Cinamon, G., Shinder, V., Shamri, R., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoattractant+signals+and+beta+2+integrin+occupancy+at+apical+endothelial+contacts+combine+with+shear+stress+signals+to+promote+transendothelial+neutrophil+migration.">Chemoattractant signals and beta 2 integrin occupancy at apical endothelial contacts combine with shear stress signals to promote transendothelial neutrophil migration.</a> J. Immunol. 173, 7282-7291 (2004).</li><li>Shulman, Z., Cohen, S. J., Roediger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transendothelial+migration+of+lymphocytes+mediated+by+intraendothelial+vesicle+stores+rather+than+by+extracellular+chemokine+depots.">Transendothelial migration of lymphocytes mediated by intraendothelial vesicle stores rather than by extracellular chemokine depots.</a> Nat. Immunol. 13, 67-76 (2012).</li><li>Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-cellular+migration:+cell-cell+contacts+get+intimate.">Trans-cellular migration: cell-cell contacts get intimate.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 20, 533-540 (2008).</li><li>Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transmigratory+cup+in+leukocyte+diapedesis+both+through+individual+vascular+endothelial+cells+and+between+them.">A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them.</a> J. Cell Biol. 167, 377-388 (2004).</li><li>Millan, J., Hewlett, L., Glyn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+transcellular+migration+occurs+through+recruitment+of+endothelial+ICAM-1+to+caveola-+and+F-actin-rich+domains.">Lymphocyte transcellular migration occurs through recruitment of endothelial ICAM-1 to caveola- and F-actin-rich domains.</a> Nat. Cell Biol. 8, 113-123 (2006).</li><li>Schulte, D., Kuppers, V., Dartsch, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+the+VE-cadherin-catenin+complex+blocks+leukocyte+extravasation+and+vascular+permeability.">Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability.</a> EMBO J. 30, 4157-4170 (2011).</li><li>Buul, J. D., Mul, F. P., van der Schoot, C. E., Hordijk, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-3+activation+modulates+cell-cell+contacts+of+human+bone+marrow+endothelial+cells.">ICAM-3 activation modulates cell-cell contacts of human bone marrow endothelial cells.</a> J. Vasc. Res. 41, 28-37 (2004).</li><li>Shaw, S. K., Bamba, P. S., Perkins, B. N., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+vascular+endothelial-cadherin+during+leukocyte+transmigration+across+endothelium.">Real-time imaging of vascular endothelial-cadherin during leukocyte transmigration across endothelium.</a> J. Immunol. 167, 2323-2330 (2001).</li><li>Su, W. H., Chen, H., Jen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+movements+of+VE-cadherin+and+PECAM-1+during+transmigration+of+polymorphonuclear+leukocytes+through+human+umbilical+vein+endothelium.">Differential movements of VE-cadherin and PECAM-1 during transmigration of polymorphonuclear leukocytes through human umbilical vein endothelium.</a> Blood. 100, 3597-3603 (2002).</li><li>Paulsson, J. M., Jacobson, S. H., Lundahl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+activation+during+transmigration+in+vivo+and+in+vitro:+A+translational+study+using+the+skin+chamber+model.">Neutrophil activation during transmigration in vivo and in vitro: A translational study using the skin chamber model.</a> J. Immunol. Methods. 361, 82-88 (2010).</li><li>Williams, M. R., Azcutia, V., Newton, G., Alcaide, P., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+mechanisms+of+neutrophil+recruitment+across+endothelium.">Emerging mechanisms of neutrophil recruitment across endothelium.</a> Trends Immunol. 32, 461-469 (2011).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

For denne protokollen, er det viktig å unngå at det dannes luftbobler i strømningskamrene, siden dette vil resultere i celle apoptose og en avbrutt monolag. For å unngå dette, ønsker vi å understreke å være spesielt interessant for trinn 4.2 og 4.5, hvor rørene er koplet til strømningskammeret. Et annet kritisk punkt i protokollen er priming av PMNs som er holdt ved romtemperatur ved å inkubere dem i 15 til 30 min ved 37 ° C før injeksjon av dem til strømningskammeret (trinn 4.1). Dette resulterer i priming av leukocytt-integriner, som tillater dem å følge adhesjonsmolekyler slik som ICAM-1, eller VCAM-1 på endotelet. Denne protokollen er ikke begrenset til å studere sjele av nøytrofile granulocytter. Også andre typer leukocytter slik som monocytter eller lymfocytter kan anvendes. Merk at trinn 4.1, dvs. grunning leukocytter kan variere mellom leukocytter typer. Dessuten kan andre typer av endotelceller benyttes. For dette er det fortsatt kritiskfor å stimulere endotelceller med passende inflammatoriske stimuli slik som TNF-eller IL-α 1β. Hvis neutrofiler ikke reagerer i transmigrating, kan man vurdere å behandle den nøytrofile kort (5 min) med N-formyl-L-metionyl-L-leucyl-L-fenylalanin (fMLP) peptid 16. Dette vil stimulere nøytrofiler, særlig deres integriner, enda mer, noe som gjør dem mer utsatt for å overholde den endotel. Vanligvis 1 dyn / cm 2 strømningshastighet benyttes. Denne flyten hastighet måles i post-kapillære venules, steder hvor de fleste leukocytter transendothelial migrasjon oppstår 17. Ved hjelp av de beskrevne strømnings-kamre, er det mulig å øke strømningshastigheten opp til 10 dyn / cm 2. Imidlertid er det ikke anbefalt å øke skjær ytterligere. Det kan resultere i uønsket lekkasje av produksjonsrøret, og løsgjøring av celler fra strømningskammeret. Resultatene er beskrevet i figur 3 indikerer at disseAntistoffene kan anvendes til å visualisere og studere dynamikken i endotel-celle-celle kryss under leukocytt diapedesis. Spesielt, i tillegg til de eksisterende Sjele assays denne protokollen tillater å diskriminere paracellular fra transcellular migrasjon under fysiologiske strømningsforholdene i sanntid. Siden antistoffene flekken celle-celle veikryss, kan man score mange leukocytter som krysser VE-cadherin / PECAM-1-positive veikryss versus nonpositive VE-cadherin / PECAM-1 steder. På denne måten transcellular migrasjon kan bli diskriminert fra paracellular migrasjon. Det er viktig å understreke at disse antistoffene ikke forstyrre funksjonen av de proteinene binder til: den PECAM-1 antistoff som brukes i denne undersøkelsen er rettet mot den andre ekstracellulære domene. Endoteliale celler som ble platet i nærvær av antistoffet viste ingen defekter i spredning eller å danne et monosjikt, og antyder at antistoffet i det minste ikke gjordeforstyrre homotypic interaksjoner mellom endotelceller. i tillegg til at do begge antistoffer ikke svekke evnen av neutrofiler til å migrere gjennom den endoteliske monolag. I tillegg er antallet nøytrofiler som transmigrere tvers av endotelial monolag i fravær eller nærvær av antistoffene ikke endret (data ikke vist). Viktigere, konfokal laser scanning mikroskopi gir oss muligheten til å ta opp ulike fluorescerende kanaler og DIC samtidig. Dermed kan denne analysen studere dynamikken i VE-cadherin og PECAM-en på samme tid når en nøytrofile krysser endotelceller-celle krysset og vil bidra til å forstå hvorfor leukocytter velge en rute over den andre, dvs. paracellular versus transcellular.

Effektiv og kontrollert leukocytter transendothelial migrasjon (TEM) er av sentral betydning i fysiologiske prosesser som immun overvåking og akutt betennelse. Men under visse patofysiologiske forhold, ukontrollert og overdreven TEM er observert noe som resulterer i kroniske inflammatoriske sykdommer (f.eks revmatoid artritt, åreforkalkning, astma). Også i løpet av tumorcellemetastase, er prosessen transendothelial migrering instrumental for tumorceller til å forlate blodsirkulasjonen til metastasere 1-3. For å spesifikt forstyrrer dreven leukocytt eller tumorcelle TEM, er en detaljert forståelse av reguleringen av denne prosess nødvendig. Det antas at den TEM prosessen skjer gjennom forskjellige trinn. Seminal studier, anmeldt to tiår siden av Butcher og Springer, førte til flertrinns modell som beskriver prosessen med TEM 4,5. Denne modellen fortsatt gjelder, selv om noen annonsesjonelle skritt er tatt med seks. Alon et al. Beskrevet behovet for tilstedeværelse av kjemokiner immobilisert på overflaten av endotelet 7. Nylig, viste de at endotelet i seg selv genererer kjemokiner som er presentert på endotelial apikale overflate 8.. Videre har den samme gruppen fremmet betydningen av strømningsforholdene i TEM 7. Nylig, kan flere publikasjoner fokuserte på de to forskjellige ruter leukocytter ta på den endelige diapedesis stadium av TEM. De kan enten gå gjennom celle-celle veikryss, dvs. paracellular trekkrute, eller krysse gjennom endotelceller kroppen, kjent som transcellular trekkrute ni. Carman og kolleger studerte disse banene i detalj og konkluderte med at leukocytter fortrinnsvis velge paracellular trekkrute (90%) over den transcellular rute (10%) når du krysser en umbilical vein endotelceller monolayer 10.Imidlertid, når endoteliale celler fra andre opprinnelse ble anvendt, for eksempel i hjernen eller microvasculature, flere leukocytter benyttet transcellular rute (30%) 11. Den Vestweber gruppe nylig viste at når celle-celle kryss ikke var i stand til å dissosiere fra hverandre ved hjelp av et banke-i dyremodell, og erstatte endogen VE-VE cadherin for en-cadherin-alfa-catenin chimera ble leukocytt TEM fullt blokkert 12 . Overraskende, forfatterne merke til at TEM ble blokkert i flere, men ikke alle vev. Samlet er disse elegante eksperimenter indikerte at leukocytter foretrakk paracellular rute over transcellular rute, selv om de regulatoriske signaler som utløser denne beslutningen er fortsatt ukjent. Selv om majoriteten av leukocytter foretrekker paracellular trekkrute, er det fremdeles vanskelig å diskriminere mellom begge veier. I tillegg til det, til tross for flere studier som fokuserer på rollen til endotelceller-celle junctioner, dynamikken i disse knutepunkter, i særdeleshet de junctional proteiner VE-cadherin og PECAM-1, under leukocytt overgangen er fremdeles under debatt. Vi har utviklet en forholdsvis enkel analyse hvor disse koblingsmolekyler kan overvåkes i sanntid under leukocytt diapedesis under fysiologiske strømningsforhold ved hjelp av fluorescensmerket-merkede antistoffer. Disse antistoffene ikke forstyrre eller blokkere relasjonen eller mobilitet av de målrettede proteiner. Denne analysen gir oss mulighet til å følge dynamikken i junctional proteiner under prosessen av paracellular TEM. I tillegg gir denne analysen også å diskriminere mellom de para og transcellular vandringsruter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1251">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:471px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:365px;">Company</td>
			<td style="width:184px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#956;-Slide VI</td>
			<td style="width:365px;">IBIDI</td>
			<td style="width:184px;">80606</td>
			<td>Flow-chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.45 &#956;m filter&#160;</td>
			<td>Whatman/GE Lifesciences</td>
			<td style="width:184px;">10462100</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">1 mL syringe&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:184px;">300013</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">20 mL syringe&#160;</td>
			<td>BD Discardit II</td>
			<td style="width:184px;">366296</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">21G needle&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Microlance</td>
			<td style="width:184px;">301155</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Albumin&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Sanquin</td>
			<td style="width:184px;">15522644</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Ammunium chloride (NH4Cl)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1009245000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">449709</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:471px;">EBM-2 Basal medium + EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. &#38; Growth Factors</td>
			<td style="width:365px;">Lonza</td>
			<td style="width:184px;">CC-3156 + CC-4176</td>
			<td>media</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">EDTA (Titriplex III)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1370041000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon tubes&#160;</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:184px;">352096</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">F1141-2MG</td>
			<td>FN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Glucose</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">G7528</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">HEPES</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">H3375</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">In-line Luer Injection port&#160;</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td style="width:184px;">10820</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">105886</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PECAM-1-ALEXA-647&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:184px;">561654</td>
			<td>clone WM59 
			stock concentration 0.1mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Percoll&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:184px;">17-0891-09</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:365px;">Fresenius Kabi&#160; Nederland</td>
			<td style="width:184px;">M090001/01NL</td>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Potassium chloride (KCl)</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">P9541</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Potassium hydrogen carbonate (KHCO3)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1048540500</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Potassium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4)</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">P5504</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Silicone Tygon 3350 tubing</td>
			<td style="width:365px;">VWR</td>
			<td style="width:184px;">228-4331</td>
			<td>tubing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:365px;">Calbiochem (Millipore)</td>
			<td style="width:184px;">567441</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe pump&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>model number 55-5920</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TNF&#945;&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Peprotech</td>
			<td style="width:184px;">300-01A</td>
			<td>tumor necrosis factor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">trisodium citrate&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1.06447.5000</td>
			<td>TNC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vacuettes</td>
			<td style="width:365px;">Greiner, Germany</td>
			<td style="width:184px;">980044</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VE-Cadherin-FITC&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:184px;">560411</td>
			<td>clone 55-7H1</td>
			<td>stock concentration 0.5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zeiss LSM510 META&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Zen Software 2008</td>
			<td style="width:365px;">Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of endothelial cell-cell junctions during neutrophil transmigration under physiological flow

Under betennelse, leukocytter forlate sirkulasjonen og krysse endotelet å bekjempe invaderende patogener i underliggende vev. Denne prosessen er kjent som leukocytter transendothelial migrasjon. To ruter for leukocytter til endotelial krysser monolaget er blitt beskrevet: i paracellular rute, dvs. gjennom celle-celle kryss og transcellular rute, dvs. gjennom den endoteliske cellelegemet. Imidlertid har det vært teknisk vanskelig å skjelne mellom det para og transcellular rute. Vi har utviklet en enkel in vitro-analyse for å undersøke fordelingen av endogent VE-cadherin og PECAM-1 i løpet av nøytrofil migrering transendothelial under fysiologiske strømningsforhold. Før nøytrofile perfusjon ble endotelceller kort behandlet med fluorescently merkede antistoffer mot VE-cadherin og PECAM-1. Disse antistoffene ikke forstyrre funksjonen av både proteiner, som ble bestemt av elektrisk celle-substraTe impedans sensing og FRAP målinger. Ved hjelp av denne analysen, var vi i stand til å følge fordelingen av endogent VE-cadherin og PECAM-en under transendothelial migrasjon under strømningsforhold og diskriminere mellom para og transcellular trekkveier av leukocytter over endotelet.

Vi testet først hvis antistoffene ikke interferere med barrierefunksjonen til endothelium. Vi målte motstand av endotel-monolag ved bruk av elektrisk celle-substrat impedans sensing (ECIS). For detaljer, se Van Buul et al. 13 Ingen endring i motstand ble observert da den anti-VE-cadherin fluorescently-merket antistoff ble lagt inn i cellene (Figur 2A). En anti-VE-cadherin antistoff som er godt anerkjent for å blokkere VE-cadherin funksjon redusert motstanden dramatisk (Figur 2A). Også de antistoffer som brukes for bildebehandling ikke endre dynamikken i VE-cadherin, som ble vurdert ved å måle fluorescerende bedring etter foto-bleking (FRAP) av VE-cadherin-GFP (figur 2B). Etter 1-2 min, nøytrofile levd opp til den aktiverte endotelceller monolayer som kan visualiseres i DIC kanal (figur 3A). Etter kryp for 5-30 sec, det store flertallet av nøytrofile transmigrated gjennom endothelial monolayer gjennom celle-celle veikryss som var merket med antistoffer rettet mot PECAM-1 og VE-cadherin. Under prosessen med diapedesis, fordelingen av VE-cadherin og PECAM-1 ble fulgt i sanntid (Figur 3B). På områder av nøytrofile diapedesis, VE-cadherin var lokalt forstyrret og PECAM-en viste en mer ring-lignende struktur. Etter ferdigstillelse av diapedesis, veikryssene nære og VE-cadherin og PECAM-en klart flyttet på nettstedene til diapedesis (Figur 3C). Legg merke til at deler av det anti-PECAM-1-antistoff ble påvist på overflaten av den nøytrofile når nøytrofile nådd Baso-lateral side av endothelium. Men dette forhindret ikke nøytrofile fra krysset endotelet. De observerte dynamikken i VE-cadherin i sanntid under nøytrofile transendothelial migrasjon var i samsvar med arbeidet ved Shaw og kolleger somviste, ved hjelp av konfokal mikroskopi og VE-cadherin-GFP-transfektert endotelceller, som VE-cadherin-GFP diffust lateralt når leukocytter krysset endothelial celle-celle veikryss 14. Også virke ved Su og kolleger understreket våre observasjoner av PECAM-1. De viste at nest etter lateral VE-cadherin diffusjon på leukocytter passasjen, ble PECAM-en lokalt omfordeles i en ring rundt transmigrating nøytrofile 15. <img alt="Figur 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig1highres.jpg" width="400" /> Figur 1. In vitro gjennomstrømningskammeret. (A) Pil angir reservoaret hvorfra mediet må oppdateres. (B) silikon rør som forbinder strømningskammeret med in-line Luer injeksjonsport som brukes for å injisere PMNs uten å koble fra slangen (pilspiss). (C) Connection av en tom strømningskammeret til reservoaret kolbe fylt med 37 ° C flyt-buffer (pilspiss). (D) Kobling av flyten-kammer med TNF-α-behandlede HUVECs til flyten-buffer-inneholdende rør og plasseres i objektbordet (pilspiss). <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig2highres.jpg" width="500" /> Figur 2. VE-cadherin antistoffer ikke forstyrrer junctional dynamikk eller funksjon. (A) Endothelial cell monolayer impedans blir målt ved hjelp av ECIS. Y-aksen uttrykker impedans i ohm, og x-aksen representerer tid i timer. VE-cadherin antistoff klone 55-7H1, merket med ALEXA647 (blå linje) eller isotypen IgG-ALEXA647 kontroll (rød linje) ikke endre endothelial cellemonolag impedans, mens VE-cadherin blokkerer antistoff CL75 (sort linje) gjorde redusere impedans . (B </strong&gt;) VE-cadherin-GFP ble uttrykt i HUVEC og FRAP analyse ved hjelp av konfokal mikroskopi viste ingen endring i fluorescens utvinning i nærvær eller fravær av VE-cadherin antistoff 55-7H1. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" width="500" /> Figur 3. VE-cadherin og PECAM-1-fordeling under neutrofil TEM i sanntid. (A) Neutrofil (merket med hvit linje) holde på endotelet og krysser celle-celle knutepunkt uten å påvirke fordelingen av VE-cadherin og PECAM -1. (B) Neutrofil krysser endotelial monolag gjennom celle-celle kryss. En lokal spredning av VE-cadherin og PECAM-en kan observeres når en nøytrofile stikker gjennom celle-celle veikryss. Hvitt linje illustrerer nøytrofil nærvær fremdeles på toppen av endotelet. Gul linje viser nøytrofile membran that er allerede under endotel. (C) Neutrophil har fullt krysset endothelial monolayer. VE-cadherin og PECAM-en blir flyttet på områder av diapedesis. Gul linje illustrerer grenser transmigrated nøytrofile. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow at JoVE.com

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

Real-time Imaging av endotelceller-celle Junctions Under Neutrophil Sjele under fysiologiske Flow

Leukocytter krysse endothelial monolayer bruker paracellular eller transcellular rute. Vi har utviklet en enkel analyse for å følge den fordeling av endogent junctional VE-cadherin og PECAM-1 under leukocytt transendothelial migrasjon under fysiologiske strømmen til å diskriminere mellom de to Sjele ruter.

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Unit 1

Cell-Cell Interactions

SCIENTISTS IN ACTION

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Isolering av menneskelige umbilical vein endotelceller og deres bruk i studiet av Neutrofil Sjelevandring Under strømningsforhold

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Påvisning av MicroRNAs i microglia av Real-time PCR i Normale CNS og under Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Real-time Live Imaging av T-celle signalisering Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Real-time Imaging av Heterotypic Blodplate-nøytrofile interaksjoner på Aktivert Endotelet Under vaskulær inflammasjon og trombedannelse i levende mus

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Kvantitativ<em&gt; In vitro</em&gt; Analysen for å måle Neutrophil vedheft til Aktiverte primære humane mikrovaskulær endotelceller under statiske betingelser

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Menneskelig Neutrophil Flow Chamber Adhesion analysen

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Real-time Imaging av myeloide celler Dynamics i<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Tarmsvulster ved å spinne Disk Konfokalmikroskopi

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

Sanntid bildebehandling og kvantifisering av sopp Biofilm utvikling bruker en tofaset resirkulerende med System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Utarbeidelse av hele benmarg for Mass flowcytometri analyse av nøytrofile-Lineage celler

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...