Name: real-time imaging of endothelial cell-cell junctions during neutrophil transmigration under physiological flow
Uploaded: 2014-08-14T15:00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow at JoVE.com

The authors thank Dr. P.L. Hordijk for critically reading the manuscript. AED is supported by a Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR) fellowship (grant #1028). JK is supported by the Dutch Heart Foundation (2005T3901). JDvB is a NHS Dekker fellow (grant #2005T039).

Los neutrófilos se aislaron a partir de voluntarios sanos que han firmado un consentimiento informado. La investigación ha sido realizada de acuerdo con las directrices institucionales y nacionales para el bienestar humano. 1. Plating y mantenimiento de umbilical humana células endoteliales de vena <ol><li> Células de cultivo endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) según las instrucciones del fabricante. Grow HUVECs en fibronectina (FN) presenta el revestimiento platos (10 g / ml, disueltos en agua desmineralizada) usando los medios de comunicación (medio basal endotelial (EBM-2) medio suplementado con medio de crecimiento endotelial (EGM-2) SingleQuots). Utilice cultivo celular entre 4-8 pasajes para los experimentos. </li><li> Día 1: Escudo de flujo cámaras con 100 l de fibronectina (10 g / ml en PBS) durante al menos 2 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Día 2: Cuando las células alcanzan 80-90% de confluencia, las células trypsinize después de un lavado cuidadoso con solución salina tamponada con fosfato RT (PBS) pH 7,4, centrifugar a 800 xg y resuspender a 800.000 células / ml utilizando los medios de comunicación. Placa de 80.000 células en cada canal de flujo de las cámaras recubiertas con FN y suavemente pipeta la suspensión celular arriba y abajo. Cultura O / N en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Día 3: Actualiza los medios de comunicación en la diapositiva flujo cámaras inclinando suavemente el portaobjetos en un ángulo de 45 °. (Véase la Figura 1A). NOTA: Se recomienda para eliminar sólo los medios de comunicación en los embalses y no en el propio canal. La eliminación de los medios de comunicación en los canales puede resultar en la pérdida de células endoteliales y la muerte debido a la fuerza de arrastre de los medios de comunicación causados ​​por pipeteo. </li><li> Compruebe por microscopía de contraste de fase si las células endoteliales se han formado una monocapa (es decir, 100% de confluencia). Si las células no son 100% confluentes, cambiar los medios de comunicación dos veces al día hasta que alcanzan el 100% de confluencia. </li><li> Una vez que las células han alcanzado la confluencia, estimular las células con los medios de comunicación (véase el paso1,1) que contiene mediador inflamatorio (TNF-α (10 ng / ml)). Estimular HUVECs O / N (es decir, 12 horas) con resultados TNF-α en un fenotipo inflamatorio del endotelio, es decir., Sobre regulación de moléculas de adhesión celular tales como ICAM-1 y VCAM-1 13. </li></ol> 2. leucocitos polimorfonucleares Aislamiento uso de gradientes de Percoll <ol><li> Preparar N-2-hidroxietilpiperazina-N&#39;-2-etanosulfónico (HEPES) -buffer (en adelante denominado: flujo-buffer) antes de aislar los leucocitos polimorfonucleares (PMN). Flow-tampón se utiliza para lavar PMNs aislados y como tampón en el ensayo de flujo. Para preparar flujo-buffer: diluir 7,72 g NaCl (132 mM), 4,76 g de HEPES (20 mM), 0,45 g KCl (6 mM), 0,25 g MgSO 4 • 7H 2 O (1 mM), K 2 HPO 4 • 3H 2 O (1,2 mM) en 1 L de agua desmineralizada y se ajusta a pH 7,4 (esta población puede mantenerse a 4 ° C durante varias semanas). </li><li> Añadir frescos 100 l 1 M CaCl 2 y #160; (1 mM), 2,5 ml de albúmina humana a partir de una concentración de 200 g / L de stock (0,5% v / v) y 0,1 g de glucosa a 100 ml (0,1% w / v) de tampón de flujo. A continuación, un filtrado del búfer de flujo utilizando un filtro de 0,45 micras. NOTA: Este-buffer de flujo tiene que estar preparado fresco para cada experimento. </li><li> Antes de aislamiento de PMN, preparar la solución de 10% de citrato trisódico (TNC) en PBS, pH 7,4. </li><li> Recoger 20 ml de sangre total en vacuettes heparina de sodio de un voluntario sano. Diluir la sangre completa 1: 1 con 10% de PBS / TNC en tubos de 50 ml y 20 ml de pipeta sangre diluida cuidadosamente en 12,5 ml de Percoll (un 23% (w / w) solución coloidal en agua con una densidad de 1,130 g / ml) en un nuevo tubo de 50 ml. Con cuidado, coloque los tubos en la centrífuga y centrifugar durante 20 min a 800 xg con baja aceleración y ninguna rotura puesta a RT. NOTA: Cuando la adición de la sangre diluida a la Percoll, inclinar el tubo de Percoll que contiene en un ángulo de 45 ° y la pipeta suavemente la sangre diluida en el ingenio del tuboh el ajuste más lento pipeta chico. </li><li> Eliminar todo el líquido y posteriormente llenar el tubo con eritrocitos buffer de lisis enfriado con hielo (4,15 g NH 4 Cl [0,155 M], 0,5 g de KHCO3 [0,01 M] y 18,5 mg de EDTA (Triplex III) [0,1 mM] a 500 ml de helado H 2 O) para lisar los eritrocitos. Deje el tubo en hielo, de vez en cuando invirtiendo el tubo, hasta que la suspensión se vuelve rojo oscuro, seguido de centrifugación 500 xg durante 5 min a 4 ° C con descansos habilitados. NOTA: La fracción de sedimento contiene los PMN (neutrófilos, eosinófilos, basófilos) junto con los eritrocitos. </li><li> Aspirar el sobrenadante y lavar pellet dos veces en buffer de lisis enfriado con hielo a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Resuspender el sedimento con tampón de flujo a temperatura ambiente y determinar la concentración de PMNs utilizando un hemocitómetro o un contador de células automatizado. Suspender los PMNs en el flujo-tampón a 1 x 10 6 células / ml y mantenerla en RT. </li></ol> 3. Etiquetado de Endotelial Junctional VE-cadherina y PECAM-1 <ol><li> Añadir el anticuerpo 647 PECAM Alexa Fluor (clon WM59) a una dilución 1: 100 y el anticuerpo VE-cadherina-FITC independiente de calcio (clon 55-7H1) en un medio de cultivo 1:50 dilución a HUVEC (ver paso 1.1), e incubar durante 30 min antes de iniciar el experimento de flujo de visualizar la dinámica de unión de células endoteliales durante la transmigración de neutrófilos bajo condiciones de flujo fisiológicas. NOTA: Antes de añadir los anticuerpos directamente etiquetados a los flujos de cámaras, asegúrese de que el volumen de cada canal no exceda de 100 l. Esto ayuda a mantener los gastos de anticuerpo tan bajo como sea posible. </li></ol> 4. PMN TEM Ensayo de Flujo Bajo <ol><li> Coloque los PMNs en un baño de agua durante 15 min a 37 ° C antes de su inyección en el sistema de flujo. </li><li> Conecte el tubo a un flujo-cámara vacía y llénela con agua caliente (por ejemplo, 37 ° C) Caudal-buffer (véase el paso 4.3) para evitar la formación de burbujas de aire al configurar ªsistema de flujo e. </li><li> Conectar un lado de una cámara vacía de flujo para el sistema de flujo de la bomba de jeringa mediante el uso de tubo de silicona que contiene una jeringa de 20 ml, y poner la cámara de flujo en la platina del microscopio. </li><li> Conectar el otro lado de un flujo de la cámara de vacío al matraz depósito lleno de 37 ° C-tampón de flujo (Figura 1B) y comenzar la bomba de jeringa con el fin de llenar todo el tubo con tampón de flujo. La bomba se tire el flujo de tampón desde el depósito a través de la cámara de flujo dentro de la jeringa. NOTA: Este tubo también contiene un puerto de inyección en línea Luer, que permite a los PMNs a inyectar con una aguja en un experimento de funcionamiento sin detener el flujo y la creación de burbujas de aire. </li><li> Vuelva a colocar el flujo de la cámara de vacío con la cámara de flujo que contiene las HUVEC tratadas con TNF-α, conecte el tubo que contiene el flujo-buffer-y colocarla en la platina del microscopio (Figura 1C). Pellizque de los tubos antes de desconectar y volver a conectar elm a las cámaras que contienen el HUVECs, ya que no pellizcando puede resultar en la formación de burbujas de aire dentro de la tubería y / o de flujo cámaras. </li><li> Ajustar la velocidad de flujo a 1 dyn / cm 2, de acuerdo con la velocidad de flujo fisiológico en vénulas capilares enviar (1-5 dyn / cm 2). </li><li> Registro de contraste de interferencia diferencial (DIC), FITC (488 nm) y Alexa Fluor 647 (647 nm) simultáneamente usando un microscopio de escaneo láser confocal. </li><li> Inyectar los PMNs (paso 4.1) lentamente en el sistema de flujo a través de la in-line Luer puerto de inyección (Figura 1D) utilizando jeringuillas de 1 ml. </li><li> Después de unos minutos, aparecen los leucocitos, se adhieren, y transmigrar. Pare el experimento en cualquier momento deseado desconectando el tubo de la cámara de flujo y fijador de pipeteado (3,7% de formaldehído en PBS) en la cámara de flujo-. Permitir la fijación durante 10 min, seguido de lavado con PBS. Los datos se analizan usando el software de formación de imágenes (ver materiales y equipos de mesa). NOTA: Realice la que experimento usando un microscopio de barrido de láser confocal equipado con una cámara climática con una temperatura constante a 37 ° C, 5% de CO 2, y un objetivo 63X de aceite. </li></ol>

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The authors have no competing financial interests.

Para este protocolo, es crítico para evitar la formación de burbujas de aire en el flujo de cámaras, ya que esto dará como resultado la apoptosis celular y una monocapa interrumpido. Para evitar esto, queremos destacar que prestar especial interés a las medidas 4.2 y 4.5, donde los tubos están conectadas al flujo de cámaras. Otro paso crítico en el protocolo es el cebado de los PMNs que se mantienen a temperatura ambiente, mediante su incubación durante 15-30 min a 37 ° C antes de la inyección a la cámara de flujo (paso 4.1). Esto resulta en el cebado de las integrinas de leucocitos, lo que les permite adherirse a las moléculas de adhesión tales como ICAM-1 o VCAM-1 en el endotelio. Este protocolo no se limita a estudiar la transmigración de neutrófilos. Se pueden usar también otros tipos de leucocitos tales como monocitos o linfocitos. Tenga en cuenta que el paso 4.1, es decir, cebar los leucocitos pueden diferir entre los tipos de leucocitos. También, se pueden utilizar otros tipos de células endoteliales. Para ello, sigue siendo críticapara estimular las células endoteliales con estímulos inflamatorios adecuados, tales como TNF-α o IL-1β. Si los neutrófilos no responden de transmigración, se puede considerar el tratamiento de la brevemente los neutrófilos (5 min) con N-formil-L-metionil-L-leucil-L-fenilalanina (fMLP) péptido 16. Esto estimulará los neutrófilos, en particular, sus integrinas, aún más, haciéndolos más propensos a adherirse al endotelio. Por lo general se usa 1 dyn / cm 2 velocidad de flujo. Esta velocidad de flujo se mide en vénulas post-capilares, sitios donde se produce más migración transendotelial de leucocitos 17. Uso de las cámaras de flujo descritos, es posible aumentar el flujo de velocidad de hasta 10 dyn / cm 2. Sin embargo, no se recomienda aumentar la cizalla más. Puede dar lugar a fugas no deseadas de la tubería y el desprendimiento de las células del flujo-cámara. Los resultados descritos en la Figura 3 indican que estosanticuerpos se pueden usar para visualizar y estudiar la dinámica de endoteliales uniones célula-célula durante la diapedesis de leucocitos. En particular, además de los ensayos de transmigración existentes este protocolo permite discriminar paracelular de la migración transcelular en condiciones de flujo fisiológicas en tiempo real. Dado que los anticuerpos se tiñen las uniones célula-célula, se puede marcar el número de leucocitos que cruzan VE-cadherina / uniones PECAM-1-positivas frente no positiva VE-cadherina / PECAM-1 sitios. De esta manera, la migración transcelular puede ser discriminado de la migración paracelular. Es importante destacar que estos anticuerpos no interfieren con la función de las proteínas que se unen a: el anticuerpo PECAM-1 utilizado en este estudio está dirigido contra el segundo dominio extracelular. Las células endoteliales que se colocaron en placas en presencia del anticuerpo no mostró defectos en la propagación o la formación de una monocapa, lo que sugiere que el anticuerpo, al menos, no lo hizointerferir con las interacciones entre las células endoteliales homotípicos. Además de eso, ambos anticuerpos no afectan a la capacidad de los neutrófilos para migrar a través de la monocapa endotelial. Además, el número de neutrófilos que transmigrar través de la monocapa endotelial en la ausencia o presencia de los anticuerpos no se altera (datos no mostrados). Es importante destacar que, microscopía confocal de barrido láser nos da la posibilidad de grabar diferentes canales fluorescentes y DIC simultáneamente. Por lo tanto, este ensayo permite estudiar la dinámica de VE-cadherina y PECAM-1 al mismo tiempo cuando una de neutrófilos cruza la unión célula-célula endotelial y ayudará a entender por qué los leucocitos eligen una ruta sobre la otra, es decir, paracelular frente transcelular.

Eficiente y muy controlado migración transendotelial de leucocitos (TEM) es de vital importancia en los procesos fisiológicos tales como la vigilancia inmune y la inflamación aguda. Sin embargo, bajo ciertas condiciones fisiopatológicas, TEM descontrolado y excesivo se observó resultando en enfermedades inflamatorias crónicas (por ejemplo, artritis reumatoide, aterosclerosis, asma). También durante la metástasis de células tumorales, el proceso de migración transendotelial es instrumental para las células tumorales para dejar la circulación de metástasis 1-3. Con el fin de interferir específicamente con leucocitos excesivo o TEM de células tumorales, se requiere un conocimiento detallado de la regulación de este proceso. Se cree que el proceso de TEM se produce a través de diferentes pasos. Estudios seminales, crítica hace dos décadas por Butcher y Springer, llevaron al modelo de múltiples pasos que describe el proceso de TEM 4,5. Este modelo sigue siendo válida, aunque algunos adpasos tradicionales se han incluido 6. Alon et al. Describe la necesidad de la presencia de quimiocinas inmovilizadas sobre la superficie del endotelio 7. Recientemente, se demostró que el propio endotelio genera quimiocinas que se presentan en la superficie apical endotelial 8. Por otra parte, el mismo grupo planteó la importancia de las condiciones de flujo durante TEM 7. Recientemente, varias publicaciones centradas en las dos rutas diferentes leucocitos pueden tomar en la etapa de diapedesis final del TEM. Ellos pueden ir a través de las uniones célula-célula, es decir, la ruta de migración paracelular, o cruzar a través del cuerpo de la célula endotelial, conocida como la ruta de migración transcelular 9. Carman y sus colegas estudiaron estas vías en detalle y llegó a la conclusión de que los leucocitos preferentemente eligen la ruta de migración paracelular (90%) sobre la ruta transcelular (10%) al cruzar una monocapa endotelial de la vena umbilical 10.Sin embargo, cuando se utilizaron células endoteliales de otros orígenes, por ejemplo, el cerebro o la microvasculatura, más leucocitos utilizan la ruta transcelular (30%) 11. El grupo Vestweber mostró recientemente que cuando las uniones célula-célula fueron incapaces de disociar el uno del otro mediante el uso de un knock-in modelo animal, en sustitución endógena VE-cadherina para un VE-cadherina-alfa-catenina quimera, TEM de leucocitos fue bloqueada completamente 12 . Sorprendentemente, los autores notaron que TEM se bloqueó en varios, pero no todos, los tejidos. En general, estos elegantes experimentos indicaron que los leucocitos prefieren la ruta paracelular sobre la ruta transcelular, aunque las señales reguladoras que activan esta decisión aún no se conocen. A pesar de que la mayoría de los leucocitos prefieren la ruta de migración paracelular, todavía es difícil discriminar entre ambas vías. Además de que, a pesar de varios estudios que se centran en el papel de la JUNCT célula-célula endotelialiones, la dinámica de estas uniones, en particular, las proteínas de unión VE-cadherina y PECAM-1, durante el cruce de leucocitos sigue siendo objeto de debate. Hemos desarrollado un ensayo relativamente simple en el que estas moléculas de unión se pueden monitorizar en tiempo real durante la diapedesis de leucocitos en condiciones de flujo fisiológicas usando anticuerpos marcados con fluorescencia. Estos anticuerpos no interfirieron con o bloquean la integridad de la unión o de la movilidad de las proteínas específicas. Este ensayo nos permite seguir la dinámica de las proteínas de unión durante el proceso de TEM paracelular. Además, este ensayo también permite discriminar entre las rutas de migración de parámetros y transcelulares.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1251">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:471px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:365px;">Company</td>
			<td style="width:184px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#956;-Slide VI</td>
			<td style="width:365px;">IBIDI</td>
			<td style="width:184px;">80606</td>
			<td>Flow-chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.45 &#956;m filter&#160;</td>
			<td>Whatman/GE Lifesciences</td>
			<td style="width:184px;">10462100</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">1 mL syringe&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:184px;">300013</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">20 mL syringe&#160;</td>
			<td>BD Discardit II</td>
			<td style="width:184px;">366296</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">21G needle&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Microlance</td>
			<td style="width:184px;">301155</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Albumin&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Sanquin</td>
			<td style="width:184px;">15522644</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Ammunium chloride (NH4Cl)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1009245000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">449709</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:471px;">EBM-2 Basal medium + EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. &#38; Growth Factors</td>
			<td style="width:365px;">Lonza</td>
			<td style="width:184px;">CC-3156 + CC-4176</td>
			<td>media</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">EDTA (Titriplex III)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1370041000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon tubes&#160;</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:184px;">352096</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">F1141-2MG</td>
			<td>FN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Glucose</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">G7528</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">HEPES</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">H3375</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">In-line Luer Injection port&#160;</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td style="width:184px;">10820</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">105886</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PECAM-1-ALEXA-647&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:184px;">561654</td>
			<td>clone WM59 
			stock concentration 0.1mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Percoll&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:184px;">17-0891-09</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:365px;">Fresenius Kabi&#160; Nederland</td>
			<td style="width:184px;">M090001/01NL</td>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Potassium chloride (KCl)</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">P9541</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Potassium hydrogen carbonate (KHCO3)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1048540500</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Potassium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4)</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">P5504</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Silicone Tygon 3350 tubing</td>
			<td style="width:365px;">VWR</td>
			<td style="width:184px;">228-4331</td>
			<td>tubing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:365px;">Calbiochem (Millipore)</td>
			<td style="width:184px;">567441</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe pump&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>model number 55-5920</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TNF&#945;&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Peprotech</td>
			<td style="width:184px;">300-01A</td>
			<td>tumor necrosis factor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">trisodium citrate&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1.06447.5000</td>
			<td>TNC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vacuettes</td>
			<td style="width:365px;">Greiner, Germany</td>
			<td style="width:184px;">980044</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VE-Cadherin-FITC&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:184px;">560411</td>
			<td>clone 55-7H1</td>
			<td>stock concentration 0.5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zeiss LSM510 META&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Zen Software 2008</td>
			<td style="width:365px;">Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of endothelial cell-cell junctions during neutrophil transmigration under physiological flow

Durante la inflamación, los leucocitos abandonan la circulación y cruzan el endotelio para luchar contra los patógenos invasores en los tejidos subyacentes. Este proceso se conoce como migración transendotelial de leucocitos. Dos rutas para leucocitos para cruzar la monocapa endotelial se han descrito: la ruta paracelular, es decir, a través de las uniones célula-célula y la ruta transcelular, es decir, a través del cuerpo de la célula endotelial. Sin embargo, ha sido técnicamente difícil discriminar entre el párrafo y la ruta transcelular. Hemos desarrollado un sencillo ensayo in vitro para estudiar la distribución de endógeno VE-cadherina y PECAM-1 durante la migración transendotelial de neutrófilos bajo condiciones de flujo fisiológicas. Antes de la perfusión de los neutrófilos, las células endoteliales se trataron brevemente con anticuerpos marcados con fluorescencia contra VE-cadherina y PECAM-1. Estos anticuerpos no interfieren con la función de ambas proteínas, como se determinó por la célula-Substra eléctricade detección de impedancia TE y FRAP mediciones. Utilizando este ensayo, hemos sido capaces de seguir la distribución de los endógena VE-cadherina y PECAM-1 durante la migración transendotelial bajo condiciones de flujo y discrimina entre los parámetros y migración transcelular rutas de los leucocitos a través del endotelio.

Primero probamos si los anticuerpos no interfieren con la función de barrera del endotelio. Se midió la resistencia de monocapas endoteliales mediante el uso de detector de impedancia de la célula-sustrato eléctrica (ECIS). Para más detalles, véase Van Buul et al. 13 se observó ningún cambio en la resistencia cuando se añadió el anticuerpo anti-VE-cadherina marcado con fluorescencia de las células (Figura 2A). Un anticuerpo anti-VE-cadherina que está bien reconocida para bloquear VE-cadherina función reduce drásticamente la resistencia (Figura 2A). Además, los anticuerpos utilizados para la formación de imágenes no alteran la dinámica de la VE-cadherina, como se evaluó mediante la medición de la recuperación de fluorescencia después de la foto-blanqueamiento (FRAP) de VE-cadherina-GFP (Figura 2B). Después de 1-2 minutos, los neutrófilos se adhirieron a la monocapa endotelial activada como podría ser visualizado en el canal de DIC (Figura 3A). Después de arrastrarse por 5-30 en síc, la gran mayoría de los neutrófilos transmigrado través de la monocapa endotelial a través de las uniones célula-célula que se marcaron con los anticuerpos dirigidos contra PECAM-1 y VE-cadherina. Durante el proceso de diapedesis, la distribución de la VE-cadherina y PECAM-1 se siguió en tiempo real (Figura 3B). En los sitios de diapedesis de neutrófilos, VE-cadherina fue interrumpida localmente y PECAM-1 mostró una estructura más similar a un anillo. Después de la terminación de diapedesis, las uniones estrechas y VE-cadherina y PECAM-1 claramente reubicados en los sitios de diapedesis (Figura 3C). Tenga en cuenta que las partes del anticuerpo anti-PECAM-1 se detectaron en la superficie del neutrófilo una vez que el de neutrófilos alcanza el lado basolateral del endotelio. Sin embargo, esto no impidió que los neutrófilos de cruzar el endotelio. La dinámica observada de VE-cadherina en tiempo real durante la migración transendotelial de neutrófilos estaban de acuerdo con la obra de Shaw y colegas quemostró, mediante microscopía confocal y la VE-cadherina-GFP-transfectadas las células endoteliales, que VE-cadherina-GFP difundido lateralmente cuando leucocitos cruzaron las uniones entre células endoteliales 14. También trabajar por Su y compañeros de trabajo subrayaron nuestras observaciones de PECAM-1. Ellos mostraron difusión que, junto al lateral VE-cadherina tras el paso de leucocitos, PECAM-1 se redistribuyó localmente en un anillo alrededor de la transmigración de neutrófilos 15. <img alt="Figura 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig1highres.jpg" width="400" /> Figura 1 En la cámara de flujo vitro. (A) La flecha indica el depósito de la que el medio tiene que ser renovado. (B) Tubo de silicona que conecta la cámara de flujo con la in-line puerto de inyección Luer utilizado para inyectar PMN sin desconectar el tubo (punta de flecha). (C) Conexiónreflejo de un flujo-cámara vacía al matraz depósito lleno de 37 ° C el flujo-buffer (punta de flecha). (D) La conexión de la cámara de flujo con las HUVECs TNF-α-tratado a la tubería de flujo que contiene-buffer-y se coloca en la platina del microscopio (punta de flecha). <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. VE-cadherina anticuerpos no interfieren con la dinámica o la función de unión. (A) Impedancia de monocapa de células endoteliales se mide usando ECIS. Eje Y se expresa en ohmios de impedancia y el eje x representa el tiempo en horas. VE-cadherina anticuerpo clon 55-7H1, marcado con Alexa647 (línea azul) o isotipo IgG control-Alexa647 (línea roja) no alteran la impedancia monocapa de células endoteliales, mientras que la VE-cadherina bloqueando CL75 anticuerpo (línea de color negro) se reduce la impedancia . (B </strong&gt;) VE-cadherina-GFP se expresó en HUVEC y análisis FRAP usando microscopía confocal reveló ningún cambio en la recuperación de la fluorescencia en presencia o ausencia de la VE-cadherina 55-7H1 anticuerpo. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. VE-cadherina y PECAM-1 de distribución durante TEM de neutrófilos en tiempo real. (A) Neutrófilos (marcado con la línea blanca) que se adhiere sobre el endotelio y el cruce de la unión célula-célula sin afectar a la distribución de la VE-cadherina y PECAM -1. (B) de neutrófilos cruzar la monocapa endotelial a través de las uniones célula-célula. Una dispersión local de la VE-cadherina y PECAM-1 se pueden observar cuando una de neutrófilos sobresale a través de las uniones célula-célula. Línea blanca ilustra presencia de neutrófilos todavía en la parte superior del endotelio. La línea amarilla muestra Tha membrana de neutrófilost ya está por debajo del endotelio. (C) de neutrófilos ha cruzado completamente la monocapa endotelial. VE-cadherina y PECAM-1 son reubicados en sitios de diapedesis. Línea amarilla ilustra las fronteras de los neutrófilos transmigrado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

Imágenes en tiempo real de la célula-célula cruces endoteliales Durante neutrófilos Transmigración Bajo Flujo Fisiológica

Los leucocitos atraviesan la monocapa endotelial usando el paracelular o la ruta transcelular. Hemos desarrollado un ensayo sencillo para seguir la distribución de la unión endógena VE-cadherina y PECAM-1 durante la migración de leucocitos transendotelial bajo flujo fisiológico de discriminar entre las dos vías de transmigración.

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Unit 1

Cell-Cell Interactions

SCIENTISTS IN ACTION

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin

Imágenes en tiempo real de los leucotrienos B 4 La migración mediada por células y BLT1 interacciones con β-arrestina

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

Investigación

Inmunología e Infección

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Aislamiento de células endoteliales de vena umbilical y su uso en el Estudio de la transmigración de neutrófilos bajo condiciones de flujo

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

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La detección de microARNs en la microglía por PCR en tiempo real en el SNC normal y durante la neuroinflamación

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Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Cuantitativo<em&gt; In vitro</em&gt; Ensayo para medir la adhesión de neutrófilos al Activado Primaria células endoteliales microvasculares humanas en condiciones estáticas

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Ensayo de adhesión de neutrófilos Cámara de flujo humano

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Imágenes en tiempo real de las células mieloides en Dinámica<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Intestinal Tumores de Spinning disco microscopía confocal

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

Imagen en tiempo real y cuantificación del desarrollo de biopelículas fúngicas mediante un sistema recirculación de flujo bifásico

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Preparación de la médula ósea entera para el análisis de citometría de masa de células de linaje neutrófilo

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...