Name: real-time imaging of endothelial cell-cell junctions during neutrophil transmigration under physiological flow
Uploaded: 2014-08-14T15:00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow at JoVE.com

The authors thank Dr. P.L. Hordijk for critically reading the manuscript. AED is supported by a Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR) fellowship (grant #1028). JK is supported by the Dutch Heart Foundation (2005T3901). JDvB is a NHS Dekker fellow (grant #2005T039).

Neutrofiler isolerades från friska frivilliga som har undertecknat ett informerat samtycke. Forskningen har utförts i enlighet med de institutionella och nationella riktlinjer för mänsklig välfärd. 1 Plating och underhåll av mänskliga navelvenendotelceller <ol><li> Kultur Human navelvenendotelceller (HUVEC) enligt tillverkarens anvisningar. Väx HUVEC på fibronektin (FN) -belagda skålar (10 ^ g / ml, upplöst i avmineraliserat vatten) med användning av medier (Endothelial Basal Medium (EBM-2)-medium kompletterat med Endothelial Growth Medium (EGM-2) singlequots). Använd cellodling mellan 4-8 passager för experiment. </li><li> Dag 1: Coat flödeskammare med 100 ul av fibronektin (10 | ig / ml i PBS) under minst 2 h vid 37 ° C och 5% CO 2. </li><li> Dag 2: När cellerna når 80-90% konfluens, trypsinize cellerna efter noggrann tvättning med RT fosfatbuffrad saltlösning (PBS) pH 7,4, centrifugera vid 800 xg och resuspendera vid 800.000 celler / ml med hjälp av media. Plate 80.000 celler i varje enskild kanal för FN-belagda flödeskammare och försiktigt pipettera cellsuspensionen upp och ner. Kultur O / N i en inkubator vid 37 ° C och 5% CO2. </li><li> Dag 3: Uppdatera medierna i flödeskammar slide genom att sakta vända bilden i 45 ° vinkel. (Se figur 1A). OBS: Vi rekommenderar att endast ta bort materialet i magasinen och inte i kanalen själv. Borttagning av medierna i kanalerna kan leda till endotelceller förlust och död på grund av att dra kraft media orsakad av pipettering. </li><li> Kontrollera genom faskontrastmikroskopi om endotelcellerna har bildat ett monolager (dvs 100% sammanflytande). Om cellerna inte är 100% konfluenta, ändra media två gånger om dagen tills de når 100% konfluens. </li><li> När cellerna har nått konfluens, stimulera cellerna med mediet (se steg1,1) innehållande inflammatorisk mediator (TNF-α (10 ng / ml)). Stimulerande HUVEC O / N (dvs., 12 tim) med TNF-α resulterar i en inflammatorisk fenotypen av endotelet, dvs., Uppreglering av celladhesionsmolekyler såsom ICAM-1 och VCAM-1 13. </li></ol> 2. Polymorfonukleära Leukocyte Isolering Använda Percoll lutningar <ol><li> Förbered N-2-hydroxietylpiperazin-N&#39;-2-etansulfonsyra (HEPES) -buffer (hädanefter kallade: flödesbuffert) före isolering av polymorfonukleära leukocyter (PMN). Flow-buffert används för att tvätta isolerade PMN och som buffert i analysflödet. För att förbereda flödes buffert: späd 7,72 g NaCl (132 mM), 4,76 g HEPES (20 mM), 0,45 g KCl (6 mM), 0,25 g MgSO 4 • 7H 2 O (1 mM), K 2 HPO 4 • 3H 2 O (1,2 mM) i en liter demineraliserat vatten och justera till pH 7,4 (detta lager kan hållas vid 4 ° C under flera veckor). </li><li> Lägg färska 100 ^ 1 M CaCl2 &amp; #160; (1 mM), 2,5 ml humant albumin från en 200 g / L lager koncentration (0,5% volym / volym) och 0,1 g glukos till 100 ml (0,1% vikt / volym) av flödesbuffert. Därefter välja flödesbuffert med användning av ett 0,45 pm filter. OBS: Detta flöde-buffert måste beredas på nytt för varje experiment. </li><li> Före isolering av PMN, förbereda 10% trinatriumcitrat (TNC) lösning i PBS, pH 7,4. </li><li> Samla 20 ml helblod i natrium heparin vacuettes från en frisk frivillig. Späd helblod 1: 1 med 10% PBS / TNC i 50 ml rör och pipettspetsar 20 ml utspätt blod försiktigt på 12,5 ml Percoll (en 23% (vikt / vikt) koUoidal lösning i vatten med en densitet av 1,130 g / ml) i ett nytt 50 ml rör. Placera försiktigt rören i centrifugen och snurra i 20 min vid 800 xg med låg acceleration och ingen rast satt vid RT. OBS: När du lägger till det utspädda blod till Percoll, luta Percoll-innehållande rör i en 45 ° vinkel och försiktigt pipet det utspädda blodet i röret with långsammast pipett boy inställning. </li><li> Ta bort all vätska och därefter fylla röret med iskall erytrocytlys-buffert (4,15 g NH4CI [0,155 M], 0,5 g KHCO3 [0,01 M] och 18,5 mg EDTA (triplex III) [0,1 mM] till 500 ml iskall H2O) för att lysera erytrocyter. Lämna rör på is, ibland vända röret, tills suspensionen stängs mörkröd, följt av centrifugering 500 xg under 5 min vid 4 ° C med raster aktiverade. OBS! Pelletfraktion innehåller PMN (neutrofiler, eosinofiler, basofiler) tillsammans med erytrocyter. </li><li> Avlägsna supernatanten och tvätta pelleten två gånger i iskall lys-buffert vid 500 xg under 5 min vid 4 ° C. </li><li> Suspendera pelleten med flödes buffert vid RT och bestämmer PMN koncentration med hjälp av antingen en hemocytometer eller automatiserad cellräknare. Häng de PMN i flödes buffert vid 1 x 10 6 celler / ml och hålla vid RT. </li></ol> 3. Märkning av Endothelial Junctional VE-cadherin och PECAM-1 <ol><li> Till PECAM Alexa Fluor 647-antikropp (klon WM59) vid en 1: 100 spädning och kalciumoberoende VE-cadherin-FITC-antikropp (klon 55-7H1) vid en 1:50 utspädning till HUVEC odlingsmedium (se steg 1.1), och inkubera under 30 minuter före start av flödesexperiment att visualisera junctionala dynamik endotelceller under neutrofil transmigration under fysiologiska flödesbetingelser. OBS: Innan du lägger de direkt-märkta antikroppar mot flödeskammare, se till att volymen i varje kanal inte överstiger 100 l. Detta hjälper till att hålla kostnaderna antikropps så lite som möjligt. </li></ol> 4. PMN TEM-analys under FLÖDE <ol><li> Placera PMNs till ett vattenbad under 15 min vid 37 ° C före injicera dem in i flödessystemet. </li><li> Anslut slangen till en tom flödeskammare och fyll med varmt (t.ex. 37 ° C) flödesbuffert (se steg 4.3) för att förhindra bildning av luftbubblor vid inställning the flödessystem. </li><li> Anslut en sida av en tom flödeskammaren till sprutpumpen flödessystem med användning av silikonslang innehållande en 20 ml spruta och placera den flödeskammaren in mikroskop scenen. </li><li> Anslut den andra sidan av en tom flödeskammaren till reservoaren kolv fylld med 37 ° C flödes-buffert (Figur 1B) och börja sprutpumpen för att fylla alla slangar med flödesbuffert. Pumpen kommer att dra flödet-bufferten från reservoaren genom flödeskammaren i sprutan. OBS: Denna slang innehåller också en in-line Luer injektionsöppning, vilket gör att PMN att injiceras med en nål i en kör experiment utan att stoppa flödet och skapa luftbubblor. </li><li> Byt ut den tomma flödeskammare med flödet-kammare som innehåller TNF-α-behandlad HUVECs ansluter flödesbuffert innehållande rör och placera den i mikroskop scenen (Figur 1C). Nyp bort rören innan kopplats från och tillm till kamrarna innehåller HUVECs, som inte nyper bort kan resultera i bildandet av luftbubblor inne i slangen och / eller flödeskammare. </li><li> Justera flödeshastigheten till en dyn / cm 2, i enlighet med fysiologiska flödeshastigheten i postkapillära venoler (1-5 dyn / cm 2). </li><li> Record Differential Interference Contrast (DIC), FITC (488 nm) och Alexa Fluor 647 (647 nm) samtidigt med hjälp av en konfokala laserskanning mikroskop. </li><li> Injicera PMN (steg 4.1) långsamt i flödessystemet via in-line Luer injektionsport (figur 1D) med 1 ml sprutor. </li><li> Efter några minuter, leukocyter visas, följa och transmigrera. Stoppa experimentet vid önskad tidpunkt genom att koppla bort slangen från flödeskammaren och pipettering fixativ (3,7% formaldehyd i PBS) i flödeskammaren. Tillåt fixering under 10 min, följt av tvättning med PBS. Data analyseras med bildbehandlingsprogram (se material och utrustning tabell). OBS: Utför han experiment med en konfokala laserskanning mikroskop utrustat med en klimatkammare med en konstant temperatur på 37 ° C, 5% CO2, och en 63X olja-objektiv. </li></ol>

<ol>
	<li>Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis--an+inflammatory+disease.">Atherosclerosis--an inflammatory disease.</a> N. Engl. J. Med. 340, 115-126 (1999).</li><li>Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell+migration+in+inflammation:+present+and+future+therapeutic+targets.">Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets.</a> Nat. Immunol. 6, 1182-1190 (2005).</li><li>Szekanecz, Z., Koch, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+involvement+in+rheumatic+diseases:+'+vascular+rheumatology.">Vascular involvement in rheumatic diseases: ' vascular rheumatology.</a> Arthritis Res. Ther. 10, 224 (2008).</li><li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial+cell+recognition:+three+(or+more)+steps+to+specificity+and+diversity.">Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67, 1033-1036 (1991).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76, 301-314 (1994).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).</li><li>Cinamon, G., Shinder, V., Shamri, R., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoattractant+signals+and+beta+2+integrin+occupancy+at+apical+endothelial+contacts+combine+with+shear+stress+signals+to+promote+transendothelial+neutrophil+migration.">Chemoattractant signals and beta 2 integrin occupancy at apical endothelial contacts combine with shear stress signals to promote transendothelial neutrophil migration.</a> J. Immunol. 173, 7282-7291 (2004).</li><li>Shulman, Z., Cohen, S. J., Roediger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transendothelial+migration+of+lymphocytes+mediated+by+intraendothelial+vesicle+stores+rather+than+by+extracellular+chemokine+depots.">Transendothelial migration of lymphocytes mediated by intraendothelial vesicle stores rather than by extracellular chemokine depots.</a> Nat. Immunol. 13, 67-76 (2012).</li><li>Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-cellular+migration:+cell-cell+contacts+get+intimate.">Trans-cellular migration: cell-cell contacts get intimate.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 20, 533-540 (2008).</li><li>Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transmigratory+cup+in+leukocyte+diapedesis+both+through+individual+vascular+endothelial+cells+and+between+them.">A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them.</a> J. Cell Biol. 167, 377-388 (2004).</li><li>Millan, J., Hewlett, L., Glyn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+transcellular+migration+occurs+through+recruitment+of+endothelial+ICAM-1+to+caveola-+and+F-actin-rich+domains.">Lymphocyte transcellular migration occurs through recruitment of endothelial ICAM-1 to caveola- and F-actin-rich domains.</a> Nat. Cell Biol. 8, 113-123 (2006).</li><li>Schulte, D., Kuppers, V., Dartsch, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+the+VE-cadherin-catenin+complex+blocks+leukocyte+extravasation+and+vascular+permeability.">Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability.</a> EMBO J. 30, 4157-4170 (2011).</li><li>Buul, J. D., Mul, F. P., van der Schoot, C. E., Hordijk, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-3+activation+modulates+cell-cell+contacts+of+human+bone+marrow+endothelial+cells.">ICAM-3 activation modulates cell-cell contacts of human bone marrow endothelial cells.</a> J. Vasc. Res. 41, 28-37 (2004).</li><li>Shaw, S. K., Bamba, P. S., Perkins, B. N., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+vascular+endothelial-cadherin+during+leukocyte+transmigration+across+endothelium.">Real-time imaging of vascular endothelial-cadherin during leukocyte transmigration across endothelium.</a> J. Immunol. 167, 2323-2330 (2001).</li><li>Su, W. H., Chen, H., Jen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+movements+of+VE-cadherin+and+PECAM-1+during+transmigration+of+polymorphonuclear+leukocytes+through+human+umbilical+vein+endothelium.">Differential movements of VE-cadherin and PECAM-1 during transmigration of polymorphonuclear leukocytes through human umbilical vein endothelium.</a> Blood. 100, 3597-3603 (2002).</li><li>Paulsson, J. M., Jacobson, S. H., Lundahl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+activation+during+transmigration+in+vivo+and+in+vitro:+A+translational+study+using+the+skin+chamber+model.">Neutrophil activation during transmigration in vivo and in vitro: A translational study using the skin chamber model.</a> J. Immunol. Methods. 361, 82-88 (2010).</li><li>Williams, M. R., Azcutia, V., Newton, G., Alcaide, P., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+mechanisms+of+neutrophil+recruitment+across+endothelium.">Emerging mechanisms of neutrophil recruitment across endothelium.</a> Trends Immunol. 32, 461-469 (2011).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

För detta protokoll är det viktigt att förhindra uppkomsten av luftbubblor i flödeskammare, eftersom detta kommer att leda till cell apoptos och en störd monolager. För att undvika detta vill vi betona att särskilt intresse för steg 4.2 och 4.5, där rören är anslutna till flödeskammaren. Ett annat viktigt steg i protokollet är priming av PMN som hålls vid RT genom att inkubera dem under 15-30 minuter vid 37 ° C före injektion dem till flödeskammaren (steg 4.1). Detta resulterar i priming av leukocyt-integriner, vilket tillåter dem att följa adhesionsmolekyler såsom ICAM-1 eller VCAM-1 på endotel. Detta protokoll är inte begränsad att studera transmigration av neutrofiler. Även andra leukocyttyper såsom monocyter eller lymfocyter kan användas. Observera att steg 4.1, det vill säga, priming leukocyterna kan skilja mellan leukocyttyper. Dessutom kan andra typer av endotelceller användas. För detta är det fortfarande kritiskatt stimulera endotelceller med lämpliga inflammatoriska stimuli såsom TNF-α eller IL-1β. Om neutrofiler inte svarar i transmigrating, kan man överväga att behandla neutrofiler kort (5 min) med N-formyl-L-metionyl-L-leucyl-L-fenylalanin (fMLP) peptid 16. Detta kommer att stimulera neutrofiler, särskilt deras integriner, ännu längre, vilket gör dem mer benägna att ansluta sig till endotelet. Typiskt 1 dyn / cm 2 flödeshastighet används. Denna flödeshastighet mäts i postkapillära venoler, platser där de flesta leukocyter transendotelial migration sker 17. Med användning av de beskrivna flödeskamrarna, är det möjligt att öka flödeshastigheten upp till 10 dyn / cm 2. Det är dock inte lämpligt att öka skjuvning ytterligare. Det kan resultera i oönskat läckage av slangen och att cellerna lossnar från den flödeskammaren. De resultat som beskrivs i figur 3 indikerar att dessaantikroppar kan användas för att visualisera och studera dynamiken i endotel cell-cell junctions under leukocyt diapedes. Särskilt utöver de befintliga Transmigration analyserna detta protokoll gör det möjligt att diskriminera paracellulär från transcellulär migration under fysiologiska flödesförhållandena i realtid. Eftersom antikropparna färga cell-cell junctions kan man poäng antalet leukocyter som korsar VE-cadherin / PECAM-1-positiva korsningar kontra ej fast VE-cadherin / PECAM-1 platser. På så sätt transcellulär migration kan särskiljas från paracellulär migration. Det är viktigt att understryka att dessa antikroppar inte stör funktionen hos de proteiner de binder till: den PECAM-1-antikropp som används i denna studie är riktade mot den andra extracellulära domänen. Endotelceller som ströks ut i närvaro av antikroppen visade inte några defekter i spridnings eller bilda ett monoskikt, vilket tyder på att antikroppen åtminstone inteinterferera med homotypiska interaktioner mellan endotelceller. i tillägg till detta, vet båda antikropparna inte försämra förmågan hos neutrofiler att migrera genom den endoteliala monoskiktet. Dessutom är antalet neutrofiler som transmigrera över endothelial monolager i frånvaro eller närvaro av antikropparna inte ändrats (data visas ej). Viktigt ger konfokal laserscanningsmikroskopi oss möjlighet att spela in olika fluorescerande kanaler och DIC samtidigt. Således gör denna analys studerar dynamiken i VE-cadherin och PECAM-1 samtidigt när en neutrofila korsar endothelial cell-cell korsning och kommer att hjälpa till att förstå varför leukocyter välja en väg över den andra, det vill säga, paracellulär kontra transcellulär.

Effektiv och hårt kontrollerad leukocyt transendotelial migration (TEM) är av central betydelse i fysiologiska processer såsom immunövervakning och akut inflammation. Under vissa patofysiologiska förhållanden, okontrollerad och överdriven TEM observeras vilket resulterar i kroniska inflammatoriska sjukdomar (t.ex. reumatoid artrit, ateroskleros, astma). Även under tumörcellmetastas, är processen för transendotelial migrering av avgörande betydelse för tumörceller att lämna cirkulationen att metastasera 1-3. För att specifikt störa alltför leukocyter eller tumörcells TEM, krävs en detaljerad förståelse av regleringen av denna process. Det antages att TEM process sker genom olika steg. Nyskapande studier omdömet två decennier sedan av Butcher och Springer, ledde till att flerstegsmodellen som beskriver processen för TEM 4,5. Modellen håller än, även om en viss annonsditionella steg har inkluderats 6. Alon et al. Beskrivna behovet av närvaro av immobiliserade kemokiner på ytan av endotelet 7. Nyligen visade de att endotelet i sig genererar kemokiner som presenteras vid den endothelial apikala ytan 8. Dessutom satte samma grupp fram vikten av flödesförhållanden under TEM 7. Nyligen, kan flera publikationer fokuserade på de två olika rutter leukocyter ta vid slut diapedes etappen av TEM. De kan antingen gå igenom cell-cell junctions, dvs, den paracellulära flyttväg eller passera den endotelceller kroppen, som kallas transcellulära migrationsvägen 9. Carman och kollegor studerade dessa vägar i detalj och kom fram till att leukocyter företrädesvis välja paracellulär migrationsvägen (90%) över transcellulär vägen (10%) när de passerar en navelven endothelial monolager 10.Men när endotelceller från annat ursprung har använts, t.ex. hjärnan eller mikrocirkulation, fler leukocyter använde transcellulär vägen (30%) 11. Den Vestweber gruppen visade nyligen att när de cell-cell junctions var oförmögna att dissociera från varandra genom användning av en knock-i djurmodell, som ersätter endogena VE-cadherin för en VE-cadherin-alfa-catenin chimären var leukocyt TEM helt blockerad 12 . Överraskande, märkte författarna att TEM blockerades i flera, men inte alla, vävnader. Sammantaget dessa eleganta experiment indikerade att leukocyter drog den paracellulära vägen över transcellulär vägen, även om de regulatoriska signaler som utlöser detta beslut är fortfarande okänd. Även om majoriteten av leukocyter föredrar paracellulär flyttväg, är det fortfarande svårt att skilja mellan de båda vägarna. Utöver det, trots flera studier som fokuserar på den roll som den endotelceller cells junctjoner, dynamiken i dessa korsningar, särskilt junctionala proteinerna VE-cadherin och PECAM-1, under leukocyt korsning är fortfarande under diskussion. Vi utvecklade en relativt enkel analys i vilken dessa kopplingsmolekyler kan övervakas i realtid under leukocyt diapedes under fysiologiska flödesbetingelser med användning av fluorescensmärkta antikroppar. Dessa antikroppar inte störa eller blockera Junktional integritet eller mobilitet av de riktade proteiner. Denna analys ger oss möjlighet att följa dynamiken i junctionala proteiner under processen för paracellulär TEM. Dessutom denna analys kan också skilja mellan de parametrar och transcellulära vandringsvägar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1251">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:471px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:365px;">Company</td>
			<td style="width:184px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#956;-Slide VI</td>
			<td style="width:365px;">IBIDI</td>
			<td style="width:184px;">80606</td>
			<td>Flow-chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.45 &#956;m filter&#160;</td>
			<td>Whatman/GE Lifesciences</td>
			<td style="width:184px;">10462100</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">1 mL syringe&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:184px;">300013</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">20 mL syringe&#160;</td>
			<td>BD Discardit II</td>
			<td style="width:184px;">366296</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">21G needle&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Microlance</td>
			<td style="width:184px;">301155</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Albumin&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Sanquin</td>
			<td style="width:184px;">15522644</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Ammunium chloride (NH4Cl)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1009245000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">449709</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:471px;">EBM-2 Basal medium + EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. &#38; Growth Factors</td>
			<td style="width:365px;">Lonza</td>
			<td style="width:184px;">CC-3156 + CC-4176</td>
			<td>media</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">EDTA (Titriplex III)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1370041000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon tubes&#160;</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:184px;">352096</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">F1141-2MG</td>
			<td>FN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Glucose</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">G7528</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">HEPES</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">H3375</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">In-line Luer Injection port&#160;</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td style="width:184px;">10820</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">105886</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PECAM-1-ALEXA-647&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:184px;">561654</td>
			<td>clone WM59 
			stock concentration 0.1mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Percoll&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:184px;">17-0891-09</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:365px;">Fresenius Kabi&#160; Nederland</td>
			<td style="width:184px;">M090001/01NL</td>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Potassium chloride (KCl)</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">P9541</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Potassium hydrogen carbonate (KHCO3)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1048540500</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Potassium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4)</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">P5504</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Silicone Tygon 3350 tubing</td>
			<td style="width:365px;">VWR</td>
			<td style="width:184px;">228-4331</td>
			<td>tubing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:365px;">Calbiochem (Millipore)</td>
			<td style="width:184px;">567441</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe pump&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>model number 55-5920</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TNF&#945;&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Peprotech</td>
			<td style="width:184px;">300-01A</td>
			<td>tumor necrosis factor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">trisodium citrate&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1.06447.5000</td>
			<td>TNC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vacuettes</td>
			<td style="width:365px;">Greiner, Germany</td>
			<td style="width:184px;">980044</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VE-Cadherin-FITC&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:184px;">560411</td>
			<td>clone 55-7H1</td>
			<td>stock concentration 0.5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zeiss LSM510 META&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Zen Software 2008</td>
			<td style="width:365px;">Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of endothelial cell-cell junctions during neutrophil transmigration under physiological flow

Under inflammation, leukocyter lämna cirkulationen och korsa endotelet att bekämpa invaderande patogener i underliggande vävnad. Denna process kallas leukocyter transendotelial migration. Två vägar för leukocyter att korsa endothelial monolager har beskrivits: den paracellulära vägen, det vill säga, genom cell-cell korsningar och transcellulära vägen, det vill säga, genom endotelceller kroppen. Däremot har det varit tekniskt svårt att skilja mellan para- och transcellulär rutt. Vi utvecklade ett enkelt in vitro-analys för att studera fördelningen av endogena VE-cadherin och PECAM-1 under neutrofila transendotelial migration under fysiologiska flödesförhållanden. Före neutrofila perfusion, endotelceller kort behandlades med fluorescensmärkta antikroppar mot VE-cadherin och PECAM-1. Dessa antikroppar har inte interfererar med funktionen av båda proteinerna, såsom bestämdes genom elektrisk cell-substrate impedans kännande och FRAP mätningar. Med hjälp av denna analys, kunde vi följa fördelningen av endogena VE-cadherin och PECAM-1 under transendotelial migration enligt flödesförhållanden och skilja mellan de parametrar och transcellulär vandringsvägar för leukocyter över endotelet.

Vi testade först om antikropparna inte interfererar med barriärfunktion av endotelet. Vi mätte motståndet i endothelial monolager med hjälp av elektrisk cell-substrat impedans avkänning (ECIS). Mer information finns i Van et al. Buul 13 Ingen förändring i resistans observerades när anti-VE-cadherin fluorescensmärkt antikropp tillsattes till cellerna (Figur 2A). En anti-VE-cadherin antikropp som är välkänd för att blockera VE-cadherin funktion minskade motståndet dramatiskt (Figur 2A). Dessutom, de antikroppar som används för avbildning inte förändrar dynamiken i VE-cadherin, som bedömdes genom mätning av fluorescerande återhämtning efter fotoblekning (FRAP) av VE-cadherin-GFP (Figur 2B). Efter 1-2 minuter, neutrofiler följs den aktiverade endothelial monolager som kan visualiseras i DIC-kanalen (figur 3A). Efter genomsökning efter 5-30 sec, den stora majoriteten av neutrofiler transmigrated genom endothelial monolager genom cell-cell junctions som märkts med antikroppar riktade mot PECAM-1 och VE-cadherin. Under processen att diapedes, fördelningen av VE-cadherin och PECAM-1 följdes i realtid (figur 3B). På platserna för neutrofila diapedes, VE-cadherin var lokalt störs och PECAM-1 visade en ringliknande struktur. Efter avslutad diapedes, korsningar nära och VE-cadherin och PECAM-1 klart flyttade vid ställena för diapedes (Figur 3C). Observera att delar av anti-PECAM-1-antikropp detekterades på ytan av neutrofila när neutrofila nådde baso-laterala sidan av endotel. Men det hindrade inte neutrofiler från att korsa endotel. De observerade dynamiken i VE-cadherin i realtid under neutrofila transendotelial migration var överens med arbetet av Shaw och kollegor somvisade, med hjälp av konfokalmikroskopi och VE-cadherin-GFP-transfekterade endotelceller, som VE-cadherin-GFP sprids i sidled när leukocyter korsade endothelial cell-cell junctions 14. Arbetar också med Su och medarbetare underströk våra observationer av PECAM-1. De visade att, intill sido VE-cadherin diffusion på leukocyt passagen, PECAM-1 var lokalt åter klassificeras i en ring runt transmigrating neutrofil 15. <img alt="Figur 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig1highres.jpg" width="400" /> Figur 1 In vitro-flödeskammaren. (A) Pil indikerar reservoar från vilken mediet behöver uppdateras. (B) Silikon slang som ansluter flödeskammare med in-line Luer injektionsöppning som används för att injicera PMN utan att koppla bort slangen (pilspets). (C) Connektion av ett tomt flödeskammaren till reservoaren kolv fylld med 37 ° C flödes-buffert (pilspets). (D) Anslutning av flödeskammaren med TNF-α-behandlade HUVEC till flödes-buffert-innehållande rör och placerades i mikroskopets objektbord (pilspets). <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig2highres.jpg" width="500" /> Figur 2 VE-cadherin antikroppar inte stör junctionala dynamik eller funktion. (A) Endothelial cellmonoskiktet impedans mäts med ECIS. Y-axeln uttrycker impedansen i ohm och x-axeln representerar tiden i timmar. VE-cadherin antikropps klon 55-7H1, märkt med ALEXA647 (blå linje) eller isotyp IgG-ALEXA647 styrning (röd linje) ändrar inte endotelceller monolager impedans, medan VE-cadherin blockerande antikropp CL75 (svart linje) sänkte impedansen . (B </strong&gt;) VE-cadherin-GFP uttrycktes i HUVEC och FRAP analys med hjälp av konfokalmikroskopi visade ingen förändring i fluorescens återhämtning i närvaro eller frånvaro av VE-cadherin 55-7H1 antikropp. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" width="500" /> Figur 3 VE-cadherin och PECAM-1 fördelning under neutrofila TEM i realtid. (A) neutrofila (markerad med vit linje) vidhäftning på endotelet och korsar cell-cell korsningen utan att påverka fördelningen av VE-cadherin och PECAM -1. (B) Neutrofil korsar endoteliala monoskiktet genom de cell-cell junctions. En lokal dispersion av VE-cadherin kan observeras och PECAM-1 när ett neutrofila sticker genom cell-cell junctions. White line illustrerar neutrofila närvaro fortfarande på toppen av endotel. Gul linje visar neutrofila membran that är redan under endotelet. (C) neutrofila har helt passerat endothelial monolager. VE-cadherin och PECAM-1 är flyttat till områden av diapedes. Gul linje illustrerar gränser transmigrated neutrofila. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow at JoVE.com

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

Realtid avbildning av endotelceller-cells Junctions Under neutrofila Trans under fysiologiska Flow

Leukocyter korsa endothelial monolager med hjälp av paracellulära eller transcellulära vägen. Vi utvecklade ett enkelt test för att följa fördelningen av endogena Junktional VE-cadherin och PECAM-1 under leukocyt transendotelial migration under fysiologiska flöde för att skilja mellan de två Transmigration vägar.

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Unit 1

Cell-Cell Interactions

SCIENTISTS IN ACTION

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin

Realtid avbildning av Leukotriene B 4 Medierad Cell Migration och BLT1 Interaktioner med β-arrestin

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Isolering av humana navelvenendotelceller och deras användning i studier av neutrofilinhibitorfaktor Transmigration Under flödesförhållanden

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Detektering av MikroRNA i Mikroglia av Real-time PCR i normala CNS och under Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Real-time Live avbildning av T-cellsignalering Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Realtid avbildning av heterotypisk blodplättar-neutrofila interaktioner på aktiverat endotel Under vaskulär inflammation och blodproppsbildning i levande möss

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Kvantitativ<em&gt; In vitro</em&gt; Analys för att mäta neutrofilvidhäftning till Aktiverade primära humana mikrovaskulära endotelceller under statiska förhållanden

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Humant neutrofilt flöde kammare Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Realtid avbildning av myeloida celler Dynamics i<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Tarmtumörer genom Spinning Disk konfokalmikroskopi

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

Realtid avbildning och kvantifiering av svamp Biofilm utveckling med hjälp av en tvåfas recirkulerande flödessystem

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Beredning av hela benmärgen för Masscytometri analys av neutrofila-Lineage celler

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...