Name: isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells
Uploaded: 2014-08-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Grant R01 AI088209 (til KAH). Vi takker også University of Minnesota flowcytometrisystemer Resource.

I denne studien, voksen - ble (6 8 uker) kvinnelige C57BL / 6 mus brukes. Mus ble kjøpt fra National Cancer Institute og vedlikeholdt under spesifikke patogen frie forhold. The University of Minnesota Institutional Animal Care og bruk komité (IACUC) godkjent all dyreforsøk. 1. Utarbeidelse av instrumenter og buffere <ol><li> Forbered enzymløsning (RPMI1640 medium med 0,05% [w / v] over Liberase TH og 100 U / ml DNase I), albumin-rike buffer (1X PBS [2 + Ca / Mg 2 +-fri]...

<ol>
	<li>Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Launching+the+T-cell-lineage+developmental+programme.">Launching the T-cell-lineage developmental programme.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 9-21 (2008).</li><li>Anderson, G., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymic+epithelial+cells:+working+class+heroes+for+T+cell+development+and+repertoire+selection.">Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection.</a> Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).</li><li>Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+presentation+in+the+thymus+for+positive+selection+and+central+tolerance+induction.">Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 833-844 (2009).</li><li>Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+and+negative+selection+of+T+cells.">Positive and negative selection of T cells.</a> Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).</li><li>Takahama, Y., Takada, K., Murata, S., Tanaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta5t-containing+thymoproteasome:+specific+expression+in+thymic+cortical+epithelial+cells+and+role+in+positive+selection+of+CD8.">beta5t-containing thymoproteasome: specific expression in thymic cortical epithelial cells and role in positive selection of CD8.</a> T cells. Curr. Opin. Immunol. 24, 92-98 (2012).</li><li>Xing, Y., Wang, X., Igarashi, H., Kawamoto, H., Sakaguchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+subunit+G5PR+that+regulates+the+JNK-mediated+apoptosis+signal+is+essential+for+the+survival+of+CD4+and+CD8+double-positive+thymocytes.">Protein phosphatase subunit G5PR that regulates the JNK-mediated apoptosis signal is essential for the survival of CD4 and CD8 double-positive thymocytes.</a> Mol. Immunol. 45, 2028-2037 (2008).</li><li>Benoist, C., Mathis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treg+cells,+life+history,+and+diversity.">Treg cells, life history, and diversity.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, a007021 (2012).</li><li>Pobezinsky, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+deletion+and+the+fate+of+autoreactive+thymocytes+that+survive+negative+selection.">Clonal deletion and the fate of autoreactive thymocytes that survive negative selection.</a> Nat. Immunol. 13, 569-578 (2012).</li><li>Stritesky, G. L., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+self-reactive+T+cells+in+the+thymus.">Selection of self-reactive T cells in the thymus.</a> Annu. Rev. Immunol. 30, 95-114 (2012).</li><li>Xing, Y., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+tolerance:+central+and+peripheral.">T-cell tolerance: central and peripheral.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, (2012).</li><li>Anderson, G., Lane, P. J., Jenkinson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+intrathymic+microenvironments+to+establish+T-cell+tolerance.">Generating intrathymic microenvironments to establish T-cell tolerance.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 954-963 (2007).</li><li>Xing, Y., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymoproteasome+subunit-beta5T+generates+peptide-MHC+complexes+specialized+for+positive+selection.">Thymoproteasome subunit-beta5T generates peptide-MHC complexes specialized for positive selection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 6979-6984 (2013).</li><li>Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zoned+out:+functional+mapping+of+stromal+signaling+microenvironments+in+the+thymus.">Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus.</a> Annu. Rev. Immunol. 25, 649-679 (2007).</li><li>Rezzani, R., Bonomini, F., Rodella, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemical+and+molecular+overview+of+the+thymus+as+site+for+T-cells+development.">Histochemical and molecular overview of the thymus as site for T-cells development.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 43, 73-120 (2008).</li><li>Rodewald, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymus+organogenesis.">Thymus organogenesis.</a> Annu. Rev. Immunol. 26, 355-388 (2008).</li><li>Griffith, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+mapping+of+thymic+stromal+microenvironments+reveals+unique+features+influencing+T+lymphoid+differentiation.">Spatial mapping of thymic stromal microenvironments reveals unique features influencing T lymphoid differentiation.</a> Immunit. 31, 999-1009 (2009).</li><li>Guerder, S., Viret, C., Luche, H., Ardouin, L., Malissen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+processing+of+self-antigens+by+subsets+of+thymic+stromal+cells.">Differential processing of self-antigens by subsets of thymic stromal cells.</a> Curr. Opin. Immunol. 24, 99-104 (2012).</li><li>Hogquist, K. A., Xing, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+CD8++T+cells+need+diversity+when+growing+up.">Why CD8+ T cells need diversity when growing up.</a> Immunit. 32, 5-6 (2010).</li><li>Jenkinson, E. J., Parnell, S., Shuttleworth, J., Owen, J. J., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+ability+of+thymic+epithelial+cells+to+mediate+positive+selection+does+not+require+expression+of+the+steroidogenic+enzyme+p450scc.">Specialized ability of thymic epithelial cells to mediate positive selection does not require expression of the steroidogenic enzyme p450scc.</a> J. Immunol. 163, 5781-5785 (1999).</li><li>Murata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+CD8++T+cell+development+by+thymus-specific+proteasomes.">Regulation of CD8+ T cell development by thymus-specific proteasomes.</a> Science. 316, 1349-1353 (2007).</li><li>Chidgey, A. P., Pircher, H., MacDonald, H. R., Boyd, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adult+thymic+stromal-cell+suspension+model+for+in+vitro+positive+selection.">An adult thymic stromal-cell suspension model for in vitro positive selection.</a> Dev. Immunol. 6, 157-170 (1998).</li><li>Izon, D. J., Nieland, J. D., Godfrey, D. I., Boyd, R. L., Kruisbeek, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+reveals+unexpected+shared+antigens+between+histologically+defined+populations+of+thymic+stromal+cells.">Flow cytometric analysis reveals unexpected shared antigens between histologically defined populations of thymic stromal cells.</a> Int. Immunol. 6, 31-39 (1994).</li><li>Jenkinson, E. J., Anderson, G., Owen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+T+cell+maturation+on+defined+thymic+stromal+cell+populations+in+vitro.">Studies on T cell maturation on defined thymic stromal cell populations in vitro.</a> J. Exp. Med. 176, 845-853 (1992).</li><li>Klein, L., Klugmann, M., Nave, K. A., Tuohy, V. K., Kyewski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+of+the+autoreactive+T-cell+repertoire+by+a+splice+variant+of+self+protein+expressed+in+thymic+epithelial+cells.">Shaping of the autoreactive T-cell repertoire by a splice variant of self protein expressed in thymic epithelial cells.</a> Nat. Med. 6, 56-61 (2000).</li><li>Shortman, K., Vremec, D., D'Amico, A., Battye, F., Boyd, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+of+the+thymocytes+associated+with+dendritic+cells+and+macrophages+in+thymic+rosettes.">Nature of the thymocytes associated with dendritic cells and macrophages in thymic rosettes.</a> Cell. Immunol. 119, 85-100 (1989).</li><li>Volkmann, A., Zal, T., Stockinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-presenting+cells+in+the+thymus+that+can+negatively+select+MHC+class+II-restricted+T+cells+recognizing+a+circulating+self+antigen.">Antigen-presenting cells in the thymus that can negatively select MHC class II-restricted T cells recognizing a circulating self antigen.</a> J. Immunol. 158, 693-706 (1997).</li><li>Yang, S. J., Ahn, S., Park, C. S., Choi, S., Kim, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+subpopulations+of+thymic+epithelial+cells+by+flow+cytometry+using+a+new+specific+thymic+epithelial+marker,+Ly110.">Identifying subpopulations of thymic epithelial cells by flow cytometry using a new specific thymic epithelial marker, Ly110.</a> J. Immunol. Method. 297, 265-270 (2005).</li><li>Gray, D. H., Chidgey, A. P., Boyd, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thymic+stromal+cell+populations+using+flow+cytometry.">Analysis of thymic stromal cell populations using flow cytometry.</a> J. Immunol. Method. 260, 15-28 (2002).</li><li>Gray, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+analysis,+enrichment+and+purification+of+thymic+stromal+cells.">Unbiased analysis, enrichment and purification of thymic stromal cells.</a> J. Immunol. Method. 329, 56-66 (2008).</li><li>Williams, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+of+complex+thymus+stromal+cell+populations:+rapid+thymic+epithelia+preparation+characterizes+radiation+injury.">Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury.</a> Clin. Transl. Sci. 2, 279-285 (2009).</li><li>Kanof, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+T+cell+subpopulations.">Purification of T cell subpopulations.</a> Curr. Protoc. Immunol. 7 (Unit 7.3), (2001).</li><li>Mage, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractionation+of+T+cells+and+B+cells+using+panning+techniques.">Fractionation of T cells and B cells using panning techniques.</a> Curr. Protoc. Immunol. 3 (Unit 3.5), (1991).</li><li>Wekerle, H., Ketelsen, U. P., Ernst, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymic+nurse+cells.+Lymphoepithelial+cell+complexes+in+murine+thymuses:+morphological+and+serological+characterization.">Thymic nurse cells. Lymphoepithelial cell complexes in murine thymuses: morphological and serological characterization.</a> The Journal of experimental medicin. 151, 925-944 (1980).</li><li>Kyewski, B. A., Kaplan, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoepithelial+interactions+in+the+mouse+thymus:+phenotypic+and+kinetic+studies+on+thymic+nurse+cells.">Lymphoepithelial interactions in the mouse thymus: phenotypic and kinetic studies on thymic nurse cells.</a> J Immuno. 128, 2287-2294 (1982).</li><li>Nakagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymic+nurse+cells+provide+microenvironment+for+secondary+T+cell+receptor+alpha+rearrangement+in+cortical+thymocytes.">Thymic nurse cells provide microenvironment for secondary T cell receptor alpha rearrangement in cortical thymocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 20572-20577 (2012).</li><li>McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+isolation+of+adult+thymic+epithelial+cell+subsets+for+multiparameter+flow+cytometry+and+gene+expression+analysis.">Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis.</a> J. Immunol. Method. 367, 85-94 (2011).</li><li>Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+enzymes+improve+isolation+and+characterization+of+the+adult+thymic+epithelium.">Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium.</a> Journal of immunological method. 385, 23-34 (2012).</li></ol>

I protokollen, kritiske trinn er utarbeidelse av thymus stromale celler (§ 3) og berikelse av TECS (§ 4). Det anbefales sterkt at frisk enzymløsning fremstilles hver gang, og vevet blir behandlet så snart som mulig. For sammenslåtte Thymi, er å optimalisere mengden av enzym-oppløsningen som kreves avhengig av antall Thymi. Hvis en vevet rester som er igjen etter behandlingen, kan legge mer enzymløsning og forlengelse av inkubasjonstiden øke celleutbytte. Ved anrikning av TECS, full samling av supernatanten og ?...

Tidlig i T celle utvikling, er beinmargsstamcelle-avledet multipotente stamceller rekruttert til cortex i thymus, gjennomgå satsing på T avstamning og bli T-celle forløpere en. I cortex, T-celle forløper CD4 og CD8 double negative (DN) thymocytter utvide og differensieres til umoden CD4 og CD8 dobbel positive (DP) thymocytter, danner en stor pool av stamfedre med svært variabel T celle reseptorer en. Bare en velger MHC-begrenset undergruppe av DP-celler blir CD4-eller CD8-positive enkelt (SP) thymocytter, migrere til medulla av thymus, og differensiere i kompetente funksjonelt modne T-celler, en hendelse som er referert til som positiv utvelgelse 2- 6. I kontrast, kloner av auto-reaktivt thymocytter gjennomgå negativ seleksjon og fjernes via apoptose, konvertert til regulatoriske T-celler for selv toleranse, eller viderekoblet til intraepitelial lymfocytter til formål som er ennå ikke klart 3,7-10. I thymus, thymus stromale cellene danner et unikt mikromiljøet signaler tilbake til disse ulike T celle utvikling skjebner 5,11,12. Thymisk stromale celler er sammensatt av thymus epitelceller (TECS) - inkludert cortical TECS (cTECs) og marg TECS (mTECs), dendrittiske celler, makrofager, fibroblaster, endotelceller, neural crest-avledet pericytes og andre mesenchymalceller 13-15. Blant disse TECS er avgjørende på de ulike stadier av T celle utvikling 1,2,16,17. Imidlertid har mangelen på en robust måte å isolere TECS hemmet en omfattende forståelse av deres funksjoner 16. Spesielt cTECs, som danner et tredimensjonalt nettverk som omgir progenitorer i cortex, er essensielle for positiv utvelgelse 13,18,19 av grunner som ennå ikke er klar. Tidligere studier gitt ledetråder som er heterogen og rolle TECS, for det meste avhengig av morfologiske og histologiske verktøy 13 </sup&gt;. Nylig de unike roller TEC undergrupper ble behandlet av genetiske metoder i musemodeller 12,20. En robust og reproduserbar måte å isolere TECS er grunnleggende for å oppnå objektiv karakterisering av TEC undergrupper, kvantitativ og kvalitativ vurdering av TEC funksjoner, og avklaring av mekanismene hvordan cTECs støtte positiv utvelgelse. På grunn av lav TECS i thymus og stramme interaksjoner de danner i intakt organ, har isolering av TECS vært utfordrende. Protokollen er beskrevet her er basert på tidligere funn, for tiden tilgjengelig reagenser, teknikker og kunnskap om thymus struktur og stromal sammensetning. Nesten to tiår siden, ble flere prosedyrer rapportert å disaggregert thymus vev 21-27, der ulike enzymer ble brukt under fordøyelsen, inkludert Trypsin, Kollagenase og dispase. Gray et al. sammenlignet disse enzymer i deres precedure 28, og rapporterte en forbedret method med en flere-trinns fordøyelsen av enzym cocktails 29 som ble mye brukt 20,30. Imidlertid innebærer denne metoden en lang forberedelsestid og komplekse fordøyelsen trinn og resultater i variabel endelige celle tall og andeler av TECS selv i samme murine kohort 29,30. For flere år siden, Liberase forskning grade enzym, som inneholder høyt renset Kollagenase og nøytral protease begynte å bli brukt i thymus vev dissosiasjon 30.. Her beskriver vi en Liberase fordøyelsen-basert protokoll, med optimaliserte mekaniske separasjonsprosedyrer, som gir et høyt antall av levedyktige TECS fra mus thymus vev. . Å berike dissosiert stromale celler, har tidligere studier brukes enten tetthetsgradienter eller magnetiske kuler separasjon 21,29. Men begge metodene forårsake alvorlig mistet av visse populasjoner av thymus stromale celler, særlig befolkningen i cTECs 29. Cytotoksiske eliminasjon og panorering teknikker <sopp&gt; 31,32 har blitt utbredt benyttet for uttømming eller separasjon av lymfocytter i den immunologiske felt 12,31. Etter sammenligning av disse teknikkene, etablerte vi dagens panorering protokoll for anriking av TECS. Den milde tilstand under berikelse prosedyren fører til mindre celledød og saklig og økt TEC utvinning. Det isolerte thymus cellesuspensjon som er beskrevet i avsnitt 3 kan direkte brukes til å flowcytometrisk analyse for identifikasjon og karakterisering av TEC-undergrupper og dendrittiske celler. § 4 beskriver en enkel og nyttig måte å identifisere TEC undergrupper ved hjelp av multiparameter flowcytometer. For eksperimenter som søker å oppnå renset cTECs eller mTECs, TEC berikelse og celle sortering prosedyrer finnes i kapittel 5 og 6.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:487px;">Anti-mouse EpCAM</td>
			<td style="width:153px;">eBioscience</td>
			<td style="width:133px;">XX-5791-YY*</td>
			<td style="width:163px;">Clone G8.8</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-mouse MHC II</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>XX-5321-YY*</td>
			<td>Clone M5/114.15.2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-mouse Ly51</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>XX-5891-YY*</td>
			<td>Clone 6C3</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UEA-1</td>
			<td>Vector Laboratory</td>
			<td>FL-1061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>LSRFortessa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Flow cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>FACSAria</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FACS tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Flow cytometry analysis software</td>
			<td>TreeStar - Flowjo</td>
			<td>FlowJo v7/9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells

Thymus er et viktig organ for T-lymfocytter utvikling. Av thymus stromale celler, thymus epitelceller (TECS) er spesielt viktig på flere stadier av T celle utvikling: T celle engasjement, positiv utvelgelse og negativ seleksjon. Men forblir funksjonen TECS i thymus ufullstendig forstått. I artikkelen gir vi en metode for å isolere TEC undergrupper fra friske mus thymus ved hjelp av en kombinasjon av mekanisk avbrudd og enzymatisk fordøyelse. Fremgangsmåten gjør det mulig for thymus stromale celler og thymocytter effektivt skal frigjøres fra celle-celle og celle-ekstracellulær matriks-forbindelser, og for å danne en enkelt-cellesuspensjon. Ved hjelp av de isolerte celler, kan multiparameter flowcytometri anvendes til identifisering og karakterisering av TECS og dendrittiske celler. Fordi TECS er en sjelden cellepopulasjon i thymus, vi også beskrive en effektiv måte å berike og rense TECS ved tappe thymocytter, den mest tallrike celletype i thymus. Follovinge anrikning, cellesortering Tiden kan bli redusert, slik at tap av cellelevedyktighet kan minimeres ved rensing av TECS. Purified celler er egnet for ulike nedstrøms analyser som Real Time-PCR, Western blot og genuttrykk profilering. Protokollen vil fremme forskning av TEC-funksjon og så vel som utvikling av in vitro T-celle rekonstituering.

Ved hjelp av denne fremgangsmåte ble en thymus organ fjernet fra en voksen mus (del 2) og en thymisk cellesuspensjon ble fremstilt som beskrevet i del 3. Den oppnådde cellesuspensjon besto av thymocytter, hematopoetiske-avledet stromale celler og ikke-hematopoietiske stromale celler. CD45 er et hematopoietisk pan-markør uttrykt på begge thymocytter og hematopoetiske stromale celler slik som makrofager og dendrittiske celler. I kontrast, TECS er ikke av blodkreft opprinnelse og ikke uttrykker CD45 15. Cell...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells at JoVE.com

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Her beskriver vi en effektiv metode for isolering, identifisering, og rensing av mus thymisk epitelceller (TECS). Protokollen kan benyttes for studier av thymus-funksjon for normal T-celle utviklingen, thymus dysfunksjon, og T-celle rekonstituering.

Isolasjon, Identifikasjon, og rensing av Muse thymisk Epitelceller

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Anvendelse av en Mouse Ligated Peyer er Patch Intestinal Loop Assay å evaluere Bakteriell Opptak av M celler

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Flowcytometrisk Isolering av Primary Murine Type II alveolære epitelceller for Funksjonell og molekylær studier

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

Isolering, bearbeiding og analyse av Murine Gingival Cells

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Isolering av myeloid dendrittiske celler og Epitelceller fra Menneskelig Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Isolering av Murint Lymph Node stromale celler

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

Large-Scale Rensing av Svinekjøtt eller Bovine fotoreseptor Outer Segmenter for fagocytose Analyser på Retinal Pigment Epitelceller

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

Isolasjon og Transplantasjon av forskjellige alderen Murine tymisk grafts.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...

Promoting 3-D Aggregation of FACS Purified Thymic Epithelial Cells with EAK 16-II/EAKIIH6 Self-assembling Hydrogel

Fremme 3-D Aggregering av FACS Renset Thymus- Epitelceller med EAK 16-II / EAKIIH6 Self-montering Hydrogel

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing ...