Name: hydrogel nanoparticle harvesting of plasma or urine for detecting low abundance proteins
Uploaded: 2014-08-07T20:45:00
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친절하게 그림 5의 데이터 수집 및 분석을 지원 마이클 헨리, 더블린 시립 대학은,.이 작품은에 의해 부분적으로 지원되었다 (1) 조지 메이슨 대학 (George Mason University), (2) 이탈리아 / 미국의 틀에서 이탈리아어 IstitutoSuperiore 디 SANITA &#39; 건강의 미국과 복지부, 조지 메이슨 대학 (George Mason University), 그리고 공중 보건의 이탈리아어 자원부, (3) NIH, IMAT 프로그램 보조금 1R21CA137706-01 및 LAL에 1R33CA173359-01, (4) 세레스 Nanosciences, Inc의 협력 계약 .

인간의 혈장과 소변은 조지 메이슨 대학위원회 (Institutional Review Board)가 프로토콜을 승인 한 다음, 동의서와 함께, 건강한 자원 봉사 기증자로부터 수집되었다. 기증자는 동일하게 개별적으로 분석 하였다 25, 42 샘플 세 사이의 백인 남성과 여성 사이에 분포하고 풀링되지 않았다. 혈청 또는 혈장 샘플의 1 나노 입자 처리 플라즈마의 잠재적 낮은 풍부한 바...

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임상 관련성 혈청 또는 혈장 시료 전체적으로 유기체의 상태에 관한 정보의 다양한 소스를 제공 할 수있는 단백질 및 펩티드를 순환 미량을 포함하는 것으로 생각된다. 혈청 단백질 체학의 약속에도 불구하고, 임상 적 이익을 10, 11, 16, 25로 바이오 마커의 발견과 번역을 훼방 세 가지 기본 심각한 생리적 장벽이있다. 1 중요한 진단 ?...

인간 게놈 시퀀싱의 완성에도 불구하고 상당한 진전은 초기 질환의 예측 식별 생체 제되지 않았거나 그 치료 결과, 1 또는 예후와 상관 관계. 진행의 부족이 이유 중 하나는 많은 중요한 잠재적 바이오 마커는 종래의 질량 분석 등의 바이오 마커 발견 플랫폼의 검출 한계 이하의 농도로 존재한다는 것이다. 질량 분석법 (MS)과 다중 반응 모니터링 (MRM)을 전형적으로 검출 감도가 50 이상 / ㎖ 겨 동안 50 PG / ㎖ 및 10 NG / ㎖ 사이의 범위에있는 임상 화학 가을 면역 분석법에 의해 측정 된 분석 물의 대부분 . 특히 질병의 초기 단계에서 많은 바이오 마커는, 종래와 MRM MS (2)에 의해 검출 될 수 없다는 것을 의미한다. 또한 이러한 복잡한 생물학적 유체에서 알부민 및 글로불린 같은 고 풍부 단백질의 존재는 종종 억 배 EXC 의해 마스크ESS 미량, 저 분자량의 단백질 및 펩티드 3, 4. 따라서 여러 샘플 준비 작업 단계가 질량 분석 시퀀싱 및 식별에 앞서 요구된다. 하나는 이러한 준비 단계는 상업적으로 이용 가능한 고갈 열 5-8로 높은 풍부한 단백질의 고갈을 고용하고있다. 그들은 종종 비공유 제거되는 캐리어 단백질과 연관되어 있기 때문에 불행하게도이 공정은 바이오 마커 후보의 수율의 감소를 이끈다. 샘플이 수집되면 또 다른 문제는 바이오 마커 후보의 전 생체을의 안정성으로 표시됩니다. 단백질은 내인성 또는 외인성 단백질 분해 효소 (9)에 의해 분해 될 수 있습니다. 10-13 열화로부터 단백질을 보호하는 동시에 하이드로 겔 나노 입자, 분석의 범위 내의 수준으로 바이오 마커 추정 농도를 증폭함으로써 이러한 중요한 과제를 초월 할 수있다. 그것은 일을 주목해야합니다LMW에서 혈액 내 단백질은 작은 그대로 단백질뿐만 아니라 큰 단백질 단편의 혼합물이다. 60 kDa의보다 큰 조직 유래 단백질은 수동적으로 혈관 기저막을 통해 혈류에 들어가기에 너무 클 수 있지만 그것들은 펩티드 또는 단백질의 단편 (14)과 같은 혈액에서 표현 될 수있다. 우리의 목표는 질병의 조기 진단, 치료에 대한 환자 층화하고, 치료에 대한 반응을 모니터링하기위한 후보가 될 수있는 신규 한 생체 순환을 측정하는 방법이다. 우리의 나노 입자를 동시에 작은 단백질과 펩타이드를 캡처하고 시작 볼륨에 따라 100 배에 그들을 집중하면서 선택적으로, 높은 풍부한 면역 글로불린과 알부민을 제외 만들어집니다. 우리 그룹이 성공적으로 단백질 및 펩타이드에 대해 높은 친 화성 분자 미끼 작용할 수 작은 유기 염료의 세트를 식별. 결합 단백질 염색으로 인해 소수성 및 정전 기적 상호 작용의 조합에 의한 것으로 생각된다의. 염료에 방향족 고리는 단백질의 소수성면 (11)에 포켓을 통해 단백질 인터리빙. 미끼는 자신의 화학에 따라 분석의 선택된 클래스에 대한 특별한 친화력을 보여줍니다. 미끼는 단백질 또는 펩티드, 알부민과 같은 담체 단백질과 경쟁. 저 분자량 단백질 / 펩타이드는 입자에 포획된다. 알부민과 글로불린과 같은 고 분자량의 단백질 때문에 하이드로 겔 (11) (도 1)의 제한으로 인해 기공 체질 능력 입자 들어가는 것이 방지된다. 하이드로 겔 나노 입자 (11) 황산 암모늄 침전에 의해 개시 중합에 의해 합성된다. N-이소 프로필 아크릴 아미드 (NIPAM)은 아크릴산 (AAC) 및 알릴 아민 (AA)와 가교제 N, N&#39;-메틸렌 비스 (BIS)의 코 모노머는 희석 조건 (1)에서 6 시간 동안 70 ° C에서 반응하도록 허용1, 13. 폴리 높은 단백질 결합 친화도 (N-이소 프로필 아크릴 아미드 - 코 - 아크릴산) 공유 (아미노 - 함유 염료를 통합 즉., sulfonatedanthraquinonetriazine 염료)를 나노 입자로를 통해 달성 (폴리 (NIPAM-CO-AAC) nanoparticlesis 염료의 친수성 / 소수성 특성에 따라 수용성 또는 유기 용매에서 수행 아미드 화 반응은 11 anthraquinonetriazine 염료의 염소 원자를 가진 나노 입자의 아민 기의 13. 친 핵성 치환은 염료 - 함유 폴리 (NIPAM를 만드는 데에 이용된다 -CO-알릴 아민) (AA)는, 나노 입자 (11) 12. 두 단계의 중합 방법은 비닐 술폰산 (VSA) (11), (13)의 외부 쉘 나노 입자를 함유하는 하이드로 겔을 생성하는 데에 이용된다. 하이드로 겔 나노 입자는 전체 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 땀, 뇨 등의 다양한 생물학적 유체에 적용될 수있다. 한 단계에서, 용액, Nanoparticles는 (분 이내) 신속한 격리 및 저 분자량의 농도는 10, 11, 13, 15-18 수행 분석 물. 단백질이 후속하여 나노 입자로부터 용출 검출 웨스턴 분석법 10, 11, 13, 15, 18, ​​22 질량 19-21 블롯, 23, 면역 / ELISA 10, 11, 15, 18, ​​또는 역상 단백질 마이크로 어레이 (16), 24 분석. 나노 입자는 화학 미끼로 작용하고, 코어 또는 코어 쉘 구조, 캡처를 제시하고 미끼 / 쉘 물리 화학적 특성에 따라 단백질을 집중한다. 나노 입자에 혼입 다른 염료 따라서 염료 선호도에 기초하여 효율, 용액의 pH, 및 고 단백질 풍부 (13)를 경쟁의 존재 / 부재를 가변으로 단백질의 상이한 서브 세트를 캡처한다. 또한, 용액의 부피에 관련하여 나노 입자의 양은 나노 입자에서 단백질 수율에 영향을 미칠 것이다. 이러한 측면하이드로 겔 나노 수확 단백질을 다량 함유 혈장 샘플로부터 수확하는 세 가지 단백질 나노 입자를 사용하여 입증 베이트, 전형적으로 많은 양의 단백질을 포함하지 않는 소변 샘플에서된다. 이 프로토콜에서는 수확 및 폴리 (NIPAM-CO-AAC), 폴리 (NIPAM / 염료), 및 코어 - 쉘 나노 입자를 사용하여 혈장 샘플에서 종양 괴사 인자 알파 (TNFα)를 집중을 설명 (폴리 (NIPAM-CO-VSA)) . 폴리 (NIPAM / 염료) 나노 입자는 결핵균에 감염된 개인을 모방하기 위해 인간의 소변 샘플에 추가 된 마이 코박 테 리움 종의 항원을 집중 표시됩니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="957">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">hydrogel nanoparticles</td>
			<td style="width:187px;">Ceres Nanoscience</td>
			<td style="width:119px;">CS003</td>
			<td style="width:336px;">NanoTrap ESP particles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">18 M&#937;-cm water</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Type 1 reagent grade water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris HCl, 50mM pH7.0</td>
			<td style="width:187px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">IC816116</td>
			<td>50mM, pH 7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:187px;">BDH</td>
			<td style="width:119px;">BDH1103-4LP</td>
			<td>available from VWR</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Ammonium Hydroxide NH4OH</td>
			<td style="width:187px;">BDH</td>
			<td style="width:119px;">BDH3014</td>
			<td>available from VWR, assayed at 28-30% NH3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium thiocyanate 25mM</td>
			<td style="width:187px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">419675000</td>
			<td>for serum/plasma samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multi-analyte Urine Reagent Strips</td>
			<td style="width:187px;">Siemens</td>
			<td style="width:119px;">2161</td>
			<td style="width:336px;">for urine samples</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X)</td>
			<td style="width:187px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">LC2676</td>
			<td style="width:336px;">use at room temperature to prevent SDS from precipitating</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Dry bath incubator (100 oC) with heating block</td>
			<td style="width:187px;">Barnstead</td>
			<td>11-715-125DQ</td>
			<td>do not substitute a boiling water bath</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nitrogen evaporator manifold</td>
			<td style="width:187px;">Organomation Associates</td>
			<td>Microvap118</td>
			<td>for serum/plasma samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Centrifuge, swing-out rotor</td>
			<td style="width:187px;">Sorvall</td>
			<td style="width:119px;">Legend series</td>
			<td>50ml tube capacity, rcf 3700 x g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Centrifuge, fixed angle rotor</td>
			<td style="width:187px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5424</td>
			<td>1.7ml microcentrifuge capacity, rcf 16,000 x g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">50ml conical centrifuge&#160;tubes</td>
			<td style="width:187px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-432-22</td>
			<td>with screw caps for urine samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">1.5ml microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:187px;">Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Disposable plastic transfer pipettes</td>
			<td style="width:187px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-711-7M</td>
			<td>at least 1ml capacity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:187px;">Fisher Scientific</td>
			<td>50-949-755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Timer</td>
			<td style="width:187px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S04782</td>
			<td>seconds/minutes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hydrogel nanoparticle harvesting of plasma or urine for detecting low abundance proteins

새로운 바이오 마커 발견에 더 민감하고 특정 질환 검출을 제공하는데 결정적인 역할을한다. 생물학적 유체에 존재 불행히도 많은 미량 생체 용이 질량 분석법 또는 그들이 매우 낮은 농도로 존재 불안정성이며, 종종 알부민 또는 면역 글로불린과 같은 높은 풍부한 단백질에 의해 마스킹되기 때문에 면역 분석법으로 검출 될 수 없다. 미끼 함유 폴리 (N-이소 프로필 아크릴 아미드)는 (NIPAM) 기반 나노 입자는 이러한 생리적 장벽을 극복 할 수있다. 한 단계에서 그들은 캡처 집중 체액에서 바이오 마커를 보존 할 수 있습니다. 저 분자량 분석은 나노 입자의 코어를 선택하고 높은 친 화성 단백질 베이트 행동 다른 유기 화학 염료에 의해 포착된다. 나노 입자는 몇 배에 의해 관심의 단백질을 집중 할 수 있습니다. 이 집중 계수는 단백질 내에되도록 단백질 수준을 증가시키기에 충분한현재 질량 분석기, 웨스턴 블롯 및 면역 분석법의 검출 한계. 나노 입자는 생체 체액의 과다와 함께 배양 할 수 있고, 그들은 알부민 및 기타 고 분자량 단백질을 제외하고 크게하면서 저 분자량의 단백질 및 펩티드의 농도로 농축 할 수있다. 우리의 데이타는 특정 분석 물질의 농도가 10,000 배 증폭 이전에 탐지 바이오 마커를 검출하는 질량 분석 및 면역 분석을 가능하게 달성 될 수 있음을 보여준다.

하이드로 겔 나노 입자 크기와 균일 폴리 (NIPAM-AAC) 입자 사이의 일괄 처리 내에서 매우 높은 수율과 재현성으로 제작되었다. 입자는 캡처, 저장, 및 단백질의 용출 (적어도 48 시간)에 필요한 시간 동안 RT에서 매우 좋은 콜로이드 안정성을 가지고 있고, 나노 입자가 석출 (도 1) (11)이 관찰되지 않았다. 콜로이드 안정성은 나노 입자에 의한 신속...

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Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.

낮은 풍부 단백질을 검출하기위한 플라즈마 또는 소변의 하이드로 겔 나노 입자 수확

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

심장 조직 공학을위한 섬유소 히드로겔에 Cardiomyocytes의 캡슐

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

연구

생체공학

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

3 차원 자기 조립 펩티드 히드로겔에서 인간 신경 전구 세포의 배양

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

설계 및 인공 세포 외 기질의 건설 (aECM) 단백질에서<em&gt; 대장균</em&gt; 피부 조직 공학

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

Rod-based Fabrication of Customizable Soft Robotic Pneumatic Gripper Devices for Delicate Tissue Manipulation

섬세한 조직 조작을위한 사용자 정의 소프트 로봇 공압 그리퍼 장치의로드 기반의 제조

Soft compliant gripping is essential in delicate surgical manipulation for minimizing the risk of tissue grip damage caused by high stress concentrations ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

액정 나노 입자 캐리어의 소수성화물 캡슐화의 대상 플라즈마 멤브레인 배달

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

생리 활성 단백질 또는 펩 티 드 히드로 광화학을 사용 하 여 생물 학적 응용에 대 한에 패턴화

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Retroductal Nanoparticle Injection to the Murine Submandibular Gland

Retroductal 나노 Murine Submandibular 동맥에 주입

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally ...

Apparatus for Harvesting Tissue Microcolumns

조직 Microcolumns 수확 용

This manuscript describes the production process for a laboratory apparatus, made from off-the-shelf components, that can be used to collect microcolumns ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

날조는 신장 피 질 세포 외 매트릭스 파생 하이드로 겔

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation

박테리아 스크리닝, 선택 및 격리를 위한 광분해성 하이드로겔 인터페이스

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to ...