Name: hydrogel nanoparticle harvesting of plasma or urine for detecting low abundance proteins
Uploaded: 2014-08-07T20:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins at JoVE.com

Michael Henry, Dublin City University, vänligen hjälp med datainsamling och analys visas i Figur 5. Detta arbete stöddes delvis av (1) George Mason University, (2) den italienska IstitutoSuperiore di Sanita &quot;inom ramen för Italien / USA samarbetsavtal mellan US Department of Health och Human Services, George Mason University, och det italienska hälsoministeriet, (3) NIH, Imat programbidrag 1R21CA137706-01 och 1R33CA173359-01 till LAL, och (4) Ceres Nanovetenskap, Inc .

Human plasma och urin samlades från friska frivilliga givare, med skriftligt informerat samtycke, efter George Mason University Institutional Review Board godkända protokoll. Givarna var jämnt fördelade mellan kaukasiska män och kvinnor i åldrarna 25 och 42 prov analyserades var för sig och var inte samman. 1. Nanoparticle Bearbetning av serum eller plasmaprover Potentiella låga rikliga biomarkörer i plasma fångas, i lösning, med hydrogel nanopartiklar. ...

<ol>
	<li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics.">Mass spectrometry-based proteomics.</a> Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).</li><li>Gerszten, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+translating+plasma+proteomics+from+bench+to+bedside:+update+from+the+NHLBI+Clinical+Proteomics+Programs.">Challenges in translating plasma proteomics from bench to bedside: update from the NHLBI Clinical Proteomics Programs.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295 (1), L16-L22 (2008).</li><li>Merrell, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+low-abundance,+low-molecular-weight+serum+proteins+using+mass+spectrometry.">Analysis of low-abundance, low-molecular-weight serum proteins using mass spectrometry.</a> J Biomol Tech. 15 (4), 238-248 (2004).</li><li>Petricoin, E. F., Belluco, C., Araujo, R. P., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood+peptidome:+a+higher+dimension+of+information+content+for+cancer+biomarker+discovery.">The blood peptidome: a higher dimension of information content for cancer biomarker discovery.</a> Nat Rev Cancer. 6 (12), 961-967 (2006).</li><li>Camerini, S., Polci, M. L., Liotta, L. A., Petricoin, E. F., Zhou, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+selective+isolation+and+enrichment+of+carrier+protein-bound+low-molecular+weight+proteins+and+peptides+in+the+blood.">A method for the selective isolation and enrichment of carrier protein-bound low-molecular weight proteins and peptides in the blood.</a> Proteomics Clin Appl. 1 (2), 176-184 (2007).</li><li>Geho, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractionation+of+serum+components+using+nanoporous+substrates.">Fractionation of serum components using nanoporous substrates.</a> Bioconjug Chem. 17 (3), 654-661 (2006).</li><li>Sennels, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+human+blood+serum+using+peptide+library+beads.">Proteomic analysis of human blood serum using peptide library beads.</a> J Proteome Res. 6 (10), 4055-4062 (2007).</li><li>Zheng, X., Baker, H., Hancock, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+low+molecular+weight+serum+peptidome+using+ultrafiltration+and+a+hybrid+ion+trap-Fourier+transform+mass+spectrometer.">Analysis of the low molecular weight serum peptidome using ultrafiltration and a hybrid ion trap-Fourier transform mass spectrometer.</a> J Chromatogr A. 1120 (1-2), 173-184 (2006).</li><li>Marshall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+serum+proteins+underlies+the+mass+spectral+fingerprinting+of+myocardial+infarction.">Processing of serum proteins underlies the mass spectral fingerprinting of myocardial infarction.</a> J Proteome Res. 2 (4), 361-372 (2003).</li><li>Fredolini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+and+Preservation+of+Very+Low+Abundance+Biomarkers+in+Urine,+such+as+Human+Growth+Hormone+(hGH),+by+Cibacron+Blue+F3G-A+Loaded+Hydrogel+Particles.">Concentration and Preservation of Very Low Abundance Biomarkers in Urine, such as Human Growth Hormone (hGH), by Cibacron Blue F3G-A Loaded Hydrogel Particles.</a> Nano Res. 1 (6), 502-518 (2008).</li><li>Luchini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart+hydrogel+particles:+biomarker+harvesting:+one-step+affinity+purification,+size+exclusion,+and+protection+against+degradation.">Smart hydrogel particles: biomarker harvesting: one-step affinity purification, size exclusion, and protection against degradation.</a> Nano Lett. 8 (1), 350-361 (2008).</li><li>Patanarut, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+hydrogel+particles+containing+Cibacron+Blue+F3G-A.">Synthesis and characterization of hydrogel particles containing Cibacron Blue F3G-A.</a> Colloids Surf A Physicochem Eng Asp. 362 (1-3), 8-19 (2010).</li><li>Tamburro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+core-shell+nanoparticles:+discovery+of+previously+invisible+biomarkers.">Multifunctional core-shell nanoparticles: discovery of previously invisible biomarkers.</a> J Am Chem Soc. 133 (47), 19178-19188 (2011).</li><li>Anderson, N. L., Anderson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+plasma+proteome:+history,+character,+and+diagnostic+prospects.">The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects.</a> Mol Cell Proteomics. 1 (11), 845-867 (2002).</li><li>Fredolini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+technology:+amplifying+the+effective+sensitivity+of+biomarker+detection+to+create+a+urine+test+for+hGH.">Nanoparticle technology: amplifying the effective sensitivity of biomarker detection to create a urine test for hGH.</a> Drug Test Anal. 1 (9-10), 447-454 (2009).</li><li>Longo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core-shell+hydrogel+particles+harvest,+concentrate+and+preserve+labile+low+abundance+biomarkers.">Core-shell hydrogel particles harvest, concentrate and preserve labile low abundance biomarkers.</a> PLoS One. 4 (3), e4763 (2009).</li><li>Luchini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+technology:+addressing+the+fundamental+roadblocks+to+protein+biomarker+discovery.">Nanoparticle technology: addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery.</a> Curr Mol Med. 10 (2), 133-141 (2010).</li><li>Luchini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Analyte+Harvesting+Nanoparticle+Technology+to+the+Measurement+of+Urinary+HGH+in+Healthy+Individuals.">Application of Analyte Harvesting Nanoparticle Technology to the Measurement of Urinary HGH in Healthy Individuals.</a> J Sports Med Doping Stud. 2 (6), (2012).</li><li>Eslami, A., Lujan, J., Western, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=blotting:+sample+preparation+to+detection.">blotting: sample preparation to detection.</a> J Vis Exp. (44), (2010).</li><li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoblot+analysis.">Immunoblot analysis.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li><li>Penna, A., Cahalan, M., , <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+Blotting+using+the+Invitrogen+NuPage+Novex+Bis+Tris+minigels.">Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels.</a> J Vis Exp. (7), 264 (2007).</li><li>Bosch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+urinary+human+growth+hormone+(hGH)+using+hydrogel+nanoparticles+and+isoform+differential+immunoassays+after+short+recombinant+hGH+treatment:+preliminary+results.">Analysis of urinary human growth hormone (hGH) using hydrogel nanoparticles and isoform differential immunoassays after short recombinant hGH treatment: preliminary results.</a> J Pharm Biomed Anal. 85, 194-197 (2013).</li><li>Fredolini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+ovarian+and+prostate+cancer+peptidome+for+candidate+early+detection+markers+using+a+novel+nanoparticle+biomarker+capture+technology.">Investigation of the ovarian and prostate cancer peptidome for candidate early detection markers using a novel nanoparticle biomarker capture technology.</a> AAPS J. 12 (4), 504-518 (2010).</li><li>Longo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+biomarker+harvesting+nanotechnology+identifies+Bak+as+a+candidate+melanoma+biomarker+in+serum.">A novel biomarker harvesting nanotechnology identifies Bak as a candidate melanoma biomarker in serum.</a> Exp Dermatol. 20 (1), 29-34 (2010).</li><li>Luchini, A., Longo, C., Espina, V., Petricoin, E. F., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+technology:+Addressing+the+fundamental+roadblocks+to+protein+biomarker+discovery.">Nanoparticle technology: Addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery.</a> J Mater Chem. 19 (29), 5071-5077 (2009).</li><li>Douglas, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+hydrogel+microparticles+to+sequester+and+concentrate+bacterial+antigens+in+a+urine+test+for+Lyme+disease.">The use of hydrogel microparticles to sequester and concentrate bacterial antigens in a urine test for Lyme disease.</a> Biomaterials. 32 (4), 1157-1166 (2010).</li><li>Prakash, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlaboratory+reproducibility+of+selective+reaction+monitoring+assays+using+multiple+upfront+analyte+enrichment+strategies.">Interlaboratory reproducibility of selective reaction monitoring assays using multiple upfront analyte enrichment strategies.</a> J Proteome Res. 11 (8), 3986-3995 (2012).</li><li>Choi, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+lipocalin-2+and+visfatin+levels+in+patients+with+coronary+heart+disease.">Implication of lipocalin-2 and visfatin levels in patients with coronary heart disease.</a> Eur J Endocrinol. 158 (2), 203-207 (2008).</li><li>Hughes, A. D., Clunn, G. F., Refson, J., Demoliou-Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-derived+growth+factor+(PDGF):+actions+and+mechanisms+in+vascular+smooth+muscle.">Platelet-derived growth factor (PDGF): actions and mechanisms in vascular smooth muscle.</a> Gen Pharmacol. 27 (7), 1079-1089 (1996).</li><li>Izycki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+levels+of+IGF-I+and+IGF-II+in+patients+with+lung+cancer+during+chemotherapy.">Serum levels of IGF-I and IGF-II in patients with lung cancer during chemotherapy.</a> Exp Oncol. 26 (4), 316-319 (2004).</li><li>Jalosinski, M., Karolczak, K., Mazurek, A., Glabinski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+methylprednisolone+and+mitoxantrone+on+CCL5-induced+migration+of+lymphocytes+in+multiple+sclerosis.">The effects of methylprednisolone and mitoxantrone on CCL5-induced migration of lymphocytes in multiple sclerosis.</a> Acta Neurol Scand. 118 (2), 120-125 (2008).</li><li>Kitazume, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+insights+into+beta-galactoside+alpha2,6-sialyltransferase+secretion+in+vivo.">Molecular insights into beta-galactoside alpha2,6-sialyltransferase secretion in vivo.</a> Glycobiology. 19 (5), 479-487 (2009).</li><li>Saito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+hepatic+NKT+cells+in+leukocyte+cell-derived+chemotaxin+2-deficient+mice+contributes+to+severe+concanavalin+A-induced+hepatitis.">Increase in hepatic NKT cells in leukocyte cell-derived chemotaxin 2-deficient mice contributes to severe concanavalin A-induced hepatitis.</a> J Immunol. 173 (1), 579-585 (2004).</li><li>Struyf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARC/CCL18+is+a+plasma+CC+chemokine+with+increased+levels+in+childhood+acute+lymphoblastic+leukemia.">PARC/CCL18 is a plasma CC chemokine with increased levels in childhood acute lymphoblastic leukemia.</a> Am J Pathol. 163 (5), 2065-2075 (2003).</li><li>Michael, I. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+tissue+kallikrein+5+is+a+member+of+a+proteolytic+cascade+pathway+involved+in+seminal+clot+liquefaction+and+potentially+in+prostate+cancer+progression.">Human tissue kallikrein 5 is a member of a proteolytic cascade pathway involved in seminal clot liquefaction and potentially in prostate cancer progression.</a> J Biol Chem. 281 (18), 12743-12750 (2006).</li></ol>

Klinisk Relevans Ett serum eller plasmaprov tros innehålla låga överflöd cirkulerande proteiner och peptider som kan ge en rik källa till information om tillståndet i organismen som helhet. Trots löftet om serum proteomik, det finns tre grundläggande och allvarliga fysiologiska hinder stävja biomarkörer och översättning till klinisk nytta 10, 11, 16, 25. 1. Viktiga diagnostiska biomarkörer kan finnas i extremt låg föreko...

Trots slutförandet av det mänskliga genomet sekvensering, har betydande framsteg inte lyckats identifiera biomarkörer prediktiva för tidiga sjukdomsstadier, eller som korrelerar med terapeutiska resultat, eller prognos 1. En orsak till denna brist på framsteg är att många potentiellt viktiga biomarkörer existerar vid en mängd som ligger under detektionsgränsen för konventionell masspektrometri och andra biomarkörer plattformar. Masspektrometri (MS) och Multiple Reaction Monitoring (MRM) har en detektionskänslighet typiskt större än 50 ng / ml medan majoriteten av de analyter mätas genom immunanalyser i ett kliniskt laboratorium faller inom intervallet mellan 50 pg / ml och 10 ng / ml . Detta innebär att många biomarkörer, särskilt i ett tidigt skede av en sjukdom som inte kan detekteras med konventionell MS och MRM 2. Dessutom närvaron av hög förekomst proteiner såsom albumin och immunoglobulin i komplexa biologiska vätskor ofta mask med miljarder gånger excess låg överflöd, lågmolekylära proteiner och peptider 3, 4. Därför flera prov förberedande steg krävs innan masspektrometri sekvensering och identifiering. En sådan förberedande steg sysselsätter utarmningen av hög förekomst proteiner med kommersiellt tillgängliga utarmning kolumnerna 5-8. Tyvärr detta steg leder till en minskning av utbytet av tänkbara biomarkörer eftersom de ofta är icke-kovalent associerat med bärarproteiner som håller på att avlägsnas. En annan utmaning representeras av stabiliteten i kandidat biomarkörer ex-vivo när proven samlas. Proteiner är föremål för nedbrytning av endogena eller exogena proteaser 9. Hydrogel nanopartiklar kan överskrida dessa kritiska utmaningar genom att förstärka den förmodade biomarkörer koncentrationen till en nivå inom området för analysen, och samtidigt skydda proteinet från nedbrytning 10-13. Det är viktigt att notera thpå LMW proteiner i blodet är en blandning av små intakta proteiner samt fragment av stora proteiner. Vävnadshärledda proteiner större än 60 kDa är för stora för att passivt in i blodomloppet genom det vaskulära basalmembranet, men de kan vara representerade i blod såsom peptider eller proteinfragment 14. Vårt mål är att mäta nya cirkulerande biomarkörer som kan vara kandidater för tidig upptäckt av sjukdomen, patientens stratifiering för terapi, och övervakning av behandlingssvar. Våra nanopartiklar skapas för att selektivt utesluta hög förekomst immunoglobuliner och albumin, medan samtidigt fånga mindre proteiner och peptider och koncentrera dem upp till 100-faldig beroende på utgångsvolymen. Vår grupp identifierat en uppsättning av små organiska färgämnen som framgångsrikt kan fungera som hög affinitet molekylära beten för proteiner och peptider. Protein-dye bindning tros bero på en kombination av hydrofoba och elektrostatisk växelverkanar. De aromatiska ringarna på färgämnet interfoliera med proteiner via hydrofoba fickor på proteinytan 11. Betet, beroende på deras kemi, visar en särskild affinitet för valda klasser av analyter. Betet konkurrera med bärarproteiner, såsom albumin, för de proteiner eller peptider. De lågmolekylära proteiner / peptider bli instängd i partikeln. Högmolekylära proteiner, såsom albumin och immunoglobulin förhindras från att komma in i partikeln på grund av siktningsförmåga på grund av det begränsande porstorlek av hydrogelen 11 (figur 1). Hydrogel nanopartiklar syntetiseras av utfällningspolymerisation initierats av ammoniumpersulfat 11. N-isopropylakrylamid (NIPAm), är co-monomerer av akrylsyra (AAC) och allylamin (AA) och tvärbindare N.N&#39;-Methylenebisacrylamide (BIS) reagera vid 70 ° C under 6 timmar i utspädda villkor 11, 13. Det höga proteinbindningsaffinitet av poly (N-isopropylakrylamid-sam-akrylsyra) (poly (NIPAm-sam-AAC) nanoparticlesis uppnås genom kovalent införlivande av aminoinnehållande färgämnen (dvs.., Sulfonatedanthraquinonetriazine färgämnen) i nanopartiklar genom en amideringsreaktion utföras i vattenhaltiga eller organiska lösningsmedel, beroende på de hydrofila / hydrofoba egenskaper hos färgämnena 11, 13. nukleofil substitution av amingrupperna i nanopartikeln med kloridatomen hos en anthraquinonetriazine färgämne används för att skapa färgämnesinnehållande poly (NIPAm -CO-allylamin) (AA) nanopartiklar 11, 12. En två-stegs polymerisationsprocess utnyttjas för att skapa hydrogel nanopartiklar som innehåller ett yttre skal av vinylsulfonsyra (VSA) 11, 13. Hydrogel nanopartiklar kan appliceras på olika biologiska vätskor, däribland helblod, plasma, serum, cerebrospinalvätska, svett och urin. I ett steg, i lösning, den n:anoparticles utföra en snabb (inom minuter) beslag och koncentration av lågmolekylära analyter 10, 11, 13, 15-18. Proteiner därefter elueras från nanopartiklar och detekteras med hjälp av Western blotting 19-21, masspektrometri 10, 11, 13, 15, 18, ​​22, 23, immun / ELISA 10, 11, 15, 18, ​​eller omvänd fas proteinmicroarray 16, 24 analyser. Nanopartiklar funktion med kemisk bete, och presentera en kärna eller kärn skal arkitektur, fånga och koncentrera proteiner baserade på bete / skal fysikalisk-kemiska egenskaper. Olika färgämnen införlivas i nanopartiklarna kommer därför fånga olika undergrupper av proteiner med varierande effektivitet baserat på färgämnesaffinitet, lösningens pH och närvaron / frånvaron av konkurrerande hög-flödande proteiner 13. Vidare kommer mängden av nanopartiklar i förhållande till volymen av lösningen påverka proteinutbytet från nanopartiklarna. Dessa aspekter avhydrogel nanopartiklar skörd demonstreras med hjälp av tre olika nanopartiklar beten skörd proteiner från plasmaprover som innehåller höga halter av protein, och från urinprover som vanligtvis inte innehåller stora mängder protein. I detta protokoll visar vi skörd och koncentrering tumörnekrosfaktor alfa (TNFa) från plasmaprover med användning av poly (NIPAm-sam-AAC), Poly (NIPAm / färgämne) och kärn- shell nanopartiklar (Poly (NIPAm-sam-VSA)) . Poly (NIPAm / färgämne) nanopartiklar visat att koncentrera Mycobacterium arter antigen som tillsattes till humana urinprov, för att efterlikna Mycobacterium tuberculosis-infekterade individer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="957">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">hydrogel nanoparticles</td>
			<td style="width:187px;">Ceres Nanoscience</td>
			<td style="width:119px;">CS003</td>
			<td style="width:336px;">NanoTrap ESP particles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">18 M&#937;-cm water</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Type 1 reagent grade water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris HCl, 50mM pH7.0</td>
			<td style="width:187px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">IC816116</td>
			<td>50mM, pH 7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:187px;">BDH</td>
			<td style="width:119px;">BDH1103-4LP</td>
			<td>available from VWR</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Ammonium Hydroxide NH4OH</td>
			<td style="width:187px;">BDH</td>
			<td style="width:119px;">BDH3014</td>
			<td>available from VWR, assayed at 28-30% NH3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium thiocyanate 25mM</td>
			<td style="width:187px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">419675000</td>
			<td>for serum/plasma samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multi-analyte Urine Reagent Strips</td>
			<td style="width:187px;">Siemens</td>
			<td style="width:119px;">2161</td>
			<td style="width:336px;">for urine samples</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X)</td>
			<td style="width:187px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">LC2676</td>
			<td style="width:336px;">use at room temperature to prevent SDS from precipitating</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Dry bath incubator (100 oC) with heating block</td>
			<td style="width:187px;">Barnstead</td>
			<td>11-715-125DQ</td>
			<td>do not substitute a boiling water bath</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nitrogen evaporator manifold</td>
			<td style="width:187px;">Organomation Associates</td>
			<td>Microvap118</td>
			<td>for serum/plasma samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Centrifuge, swing-out rotor</td>
			<td style="width:187px;">Sorvall</td>
			<td style="width:119px;">Legend series</td>
			<td>50ml tube capacity, rcf 3700 x g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Centrifuge, fixed angle rotor</td>
			<td style="width:187px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5424</td>
			<td>1.7ml microcentrifuge capacity, rcf 16,000 x g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">50ml conical centrifuge&#160;tubes</td>
			<td style="width:187px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-432-22</td>
			<td>with screw caps for urine samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">1.5ml microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:187px;">Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Disposable plastic transfer pipettes</td>
			<td style="width:187px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-711-7M</td>
			<td>at least 1ml capacity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:187px;">Fisher Scientific</td>
			<td>50-949-755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Timer</td>
			<td style="width:187px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S04782</td>
			<td>seconds/minutes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hydrogel nanoparticle harvesting of plasma or urine for detecting low abundance proteins

Novel biomarkörer spelar en avgörande roll för att ge mer känsligt och specifikt påvisande sjukdom. Tyvärr har många låg-överflöd biomarkörer som finns i biologiska vätskor kan inte vara lätt upptäckas med masspektrometri eller immun eftersom de förekommer i mycket låga koncentrationer, är labila och ofta maskerade med hög förekomst proteiner såsom albumin eller immunglobulin. Bete innehållande poly (N-isopropylakrylamid) (NIPAm) baserade nanopartiklar är i stånd att övervinna dessa fysiologiska barriärer. I ett steg de kan fånga, koncentrera och bevara biomarkörer från kroppsvätskor. Lågmolekylära analyter in i kärnan i nanopartikel och fångas upp av olika organiska kemiska färgämnen, som fungerar som hög affinitetsprotein beten. Nanopartiklarna kan koncentrera proteinerna av intresse genom flera tiopotenser. Denna koncentrationsfaktor är tillräcklig för att öka proteinnivån, så att proteinerna är inomdetektionsgränsen för nuvarande masspektrometrar, western blotting och immunanalyser. Nanopartiklar kan inkuberas med en uppsjö av biologiska vätskor och de har möjlighet att i hög grad anrika koncentrationen av lågmolekylära proteiner och peptider medan exklusive albumin och andra högmolekylära proteiner. Våra data visar att en 10.000-faldig amplifiering av koncentrationen av en särskild analyt kan åstadkommas, vilket möjliggör masspektrometri och immunoanalyser för att detektera tidigare odetekterbara biomarkörer.

Hydrogel nanopartiklar Storlek och likformighet Poly (NIPAm-AAC) partiklar har tillverkats med extremt hög avkastning och reproducerbarhet mellan och inom partier. Partiklarna har väldigt bra kolloidalt stabilitet vid RT under den tid som krävs för avskiljning, lagring och eluering av proteiner (minst 48 h) och nanopartiklar nederbörden har inte observerats (figur 1) 11. Den kolloidala stabiliteten kan vara mycket viktig för snabb protein / ...

Watch this Scientific Journal Video about Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins at JoVE.com

Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.

Hydrogel nanopartiklar Skörd av plasma eller urin för att upptäcka låg förekomst Proteiner

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Inkapsling av Cardiomyocytes i en Fibrin Hydrogel för hjärtvävnad Engineering

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

Odling av mänskliga neurala stamceller i en 3-dimensionell självorganiserande Peptide Hydrogel

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Design och konstruktion av artificiell Extracellular Matrix (AECM) Proteiner från<em&gt; Escherichia coli</em&gt; För hudvävnad Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

Rod-based Fabrication of Customizable Soft Robotic Pneumatic Gripper Devices for Delicate Tissue Manipulation

Rod-baserade Tillverkning av Anpassningsbara Soft Robotic Pneumatisk gripare enheter för känsliga vävnaden Manipulation

Soft compliant gripping is essential in delicate surgical manipulation for minimizing the risk of tissue grip damage caused by high stress concentrations ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

Riktade Plasma Membrane Leverans av en hydrofob Cargo inkapslad i en Liquid Crystal nanopartiklar Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

Mönstring bioaktiva proteiner eller peptider på Hydrogel med fotokemi för biologiska tillämpningar

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Retroductal Nanoparticle Injection to the Murine Submandibular Gland

Retroductal nanopartiklar injektion till murina Submandibular körtel

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally ...

Apparatus for Harvesting Tissue Microcolumns

Apparater för upptagning vävnad Microcolumns

This manuscript describes the production process for a laboratory apparatus, made from off-the-shelf components, that can be used to collect microcolumns ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Fabricera en njure Cortex extracellulära Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation

Fotodegraderbara Hydrogelgränssnitt för bakteriescreening, urval och isolering

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to ...