Name: 3d orbital tracking in a modified two-photon microscope: an application to the tracking of intracellular vesicles
Uploaded: 2014-10-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles at JoVE.com

This project was supported by grants NIH NIGMS 8P41 GM103540-28 and P50-GM076516

1 샘플 준비 <ol><li> 10 % 소 태아 혈청 및 페니실린 스트렙토 마이신 50 ㎍ / ml의 100 IU / ㎖로 보충 된 DMEM을 사용하여 조직 배양 플라스크에 CHOK1 세포를 유지한다. 37 ° C에서 5 % CO 2 가습 인큐베이터에있는 세포를 품어. </li><li> 수확 후 0.16 mm의면 두께 14mm 직경 마이크로 웰에 CHOK1 세포를 플레이트. 60~70% 자랄 때 주변의 이미징을위한 최적의 밀도에 대한 종자 세포. </li><li> 37 ° C에서 하룻밤 ?...

<ol>
	<li>So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+photon+excitation+fluorescence+microscopy.">Two photon excitation fluorescence microscopy.</a> Annu Rev Biomed Eng. 2, 399-429 (2000).</li><li>Dupont, A., Lamb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+three+dimensional+single+particle+tracking.">Nanoscale three dimensional single particle tracking.</a> Nanoscale. 3, 4532-4541 (2011).</li><li>Estrada, L. C., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+nanometer+images+of+biological+fibers+by+directed+motion+of+gold+nanoparticles.">3D nanometer images of biological fibers by directed motion of gold nanoparticles.</a> Nano Lett. 11, 4656-4660 (2011).</li><li>Kis-Petikova, K., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distance+measurement+by+circular+scanning+of+the+excitation+beam+in+the+two+photon+microscope.">Distance measurement by circular scanning of the excitation beam in the two photon microscope.</a> Microscopy Research and Technique. 63, 34-49 (2004).</li><li>Levi, V., Ruan, Q., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3+D+particle+tracking+in+a+two+photon+microscope+application+to+the+study+of+molecular+dynamics+in+cells.">3 D particle tracking in a two photon microscope application to the study of molecular dynamics in cells.</a> Biophys J. 88, 2919-2928 (2005).</li><li>Lund, F. W., Wustner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+single+particle+tracking+and+temporal+image+correlation+spectroscopy+for+quantitative+analysis+of+endosome+motility.">A comparison of single particle tracking and temporal image correlation spectroscopy for quantitative analysis of endosome motility.</a> Journal of Microscopy. 252, 169-188 (2013).</li><li>Nath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spreading+of+Neurodegenerative+Pathology+via+Neuron+to+Neuron+Transmission+of+beta+Amyloid.">Spreading of Neurodegenerative Pathology via Neuron to Neuron Transmission of beta Amyloid.</a> Journal of Neuroscience. 32, 8767-8777 (2012).</li><li>Balint, S., Vilanova, I. V., Alvarez, A. S., Lakadamyali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+live+cell+and+superresolution+microscopy+reveals+cargo+transport+dynamics+at+microtubule+intersections.">Correlative live cell and superresolution microscopy reveals cargo transport dynamics at microtubule intersections.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 3375-3380 (2013).</li><li>Huotari, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosome+maturation.">Endosome maturation.</a> Embo Journal. 30, 3481-3500 (2011).</li><li>Ragan, T., So, P. T., Kwon, H. S., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+particle+tracking+on+the+two+photon+microscope.">3D particle tracking on the two photon microscope.</a> Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences. 2, 247-258 (2001).</li><li>Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+response+to+near-infrared+femtosecond+laser+pulses+in+two+photon+microscopes.">Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two photon microscopes.</a> Optics Letters. 22, 135-136 (1997).</li><li>Caviston, J. P., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+motors+at+the+intersection+of+trafficking+and+transport.">Microtubule motors at the intersection of trafficking and transport.</a> Trends Cell Biol. 16, 530-537 (2006).</li><li>Cardarelli, F., Lanzano, L., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+directed+molecular+motion+in+the+nuclear+pore+complex+of+live+cells.">Capturing directed molecular motion in the nuclear pore complex of live cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 9863-9868 (2012).</li></ol>

높은 시간 분해능으로 3 차원 형광 입자의 궤적을 달성 지난 년 동안 형광 현미경 기술과 계장의 엄청난 진행됨에도​​ 불구 분야에서 도전을 유지하고있다. 높은 시간 해상도가 이차원 추적 입자를 달성 한 경우, 축 방향에 확장은 전형적으로 시스템 (10)의 주파수 응답에서의 급격한 감소를 가져온다. 이 동영상 프로토콜에서는 이광자 현미경을 사용하여 높은 시?...

방법 중 다수의 현미경을 사용 입체적으로 형광 발색 입자를 추적하는 날짜로 개발되어왔다. 대부분의 접근은 일반적으로 이상적인 축 방향으로 트래킹을 달성하기 위해 현미경 출사 광학계의 정의 수정과 조합이 차원에서 추적하기 적합한 고속 카메라의 사용에 의존한다. 이 프로세스가 적절한 시간 해상도 (10Hz의)는 일반적으로 시간 소모적이며, 얻을 수 있지만, 종래의 입자가있다 추적되는 경우에만, Z-스택의 시계열을 수행하여 형광체 입자를 추적 할 수있다 (촛점 또는 두 개의 광자 중) 레이저 주사 현미경 액티브 피드백 메커니즘 (2)에 의해 작은 래스터 촬상 영역의 중심에 있었다. 록킹에서 입자로의 개념은 궤도 추적 방법의 기초이다. 대신 래스터의 원형 궤도가 형광 입자의 주위에 수행되는 검사합니다. 따라서 형광의 강도궤도 정확하게 입자의 총수 4 편재. 입자의 국부적 위치는 현미경 스캐너 재 중심 위치에 입자 궤도를 작동하는 데 사용될 수있다. 현미경의 갈바 노 스캐너는 아날로그 전압에 의해 구동된다. 이 전압의 AC 성분은 사인 및 원 궤도를 수행 할 수 있도록 X 및 Y 스캐닝 미러에 적용 코사인 파 즉, 집속 레이저 빔의 궤도를 수행 할 수 있습니다. 신호의 DC 오프셋은 궤도의 중심 위치를 변경하는 것을 용이. 궤도주기가 결정되며, AC 신호 파형이 구성되면, 피드백 시스템은 신호의 단지 DC 성분을 업데이트 할 필요가있다. 검출기로부터 수집 된 형광 신호를 판독 할 수 소프트웨어는 DC 전원을, 스캐너 및 검출기를 제어하기 위해 입자의 위치를​​ 계산하고 갱신 할 필요설정합니다. 궤도 파라미터 (크기 및 타이밍)의 신중한 선택을 묘화 성공적인 피드백에 필요한 이들 파라미터는 추적 할 필요가 형광 물질의 특성에 기초하여 조절 될 필요가있다. 기술의 물리적 및 수학적 기초는 2D 및 3D 애플리케이션 모두에 대해 과거 4,5에 기재 하였다. 이 프로토콜에서는 간단히 셋업의 주요 하드웨어 구성 요소를 설명하고, 더욱 구체적으로 파라미터의 선택과 시료 전처리는 살아있는 세포 내의 높은 시간적 해상도 리소좀의 변위 다음 우릴 있도록 일반적인 실험에 필요한.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="525">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:197px;">Name</td>
			<td style="width:160px;">Company</td>
			<td style="width:168px;">Model</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lysotracker DND 26</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L-7526</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">tubuline tracker Green</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>T34075</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mitotracker RED</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>M7512</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Coherent Chamelon- ultra II TI</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcite polarize</td>
			<td>Melles Griot Glan&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Galvanometer-motor mirror</td>
			<td>Cambridge technologies</td>
			<td>M 6350</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma technologies</td>
			<td>700 DCSPXR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Motorized stage</td>
			<td>ASI</td>
			<td>MS2000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Piezo&#160;</td>
			<td>PI</td>
			<td>P721-LLQ</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Photomultiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>H7422P-40</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Data acquisition card</td>
			<td>IO tech</td>
			<td>PCI 1128-4000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imaging software</td>
			<td>LFD</td>
			<td>Global for images-SimFCS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d orbital tracking in a modified two-photon microscope: an application to the tracking of intracellular vesicles

이 동영상 프로토콜의 목적은 변형 된 이광자 현미경을 사용하여 1 입체 형광 입자 궤도 추적 실험을 수행하고 분석하는 방법을 설명하는 것이다. 종래의 접근 방식 (래스터 스캔 또는 프레임들의 스택에 기초하여 넓은 시야)에 대향 된 바와 같이, 3D 궤도 추적 지역화 및 높은 공간 (10 nm의 정확도) 및 시간 해상도 (50 Hz에서의 주파수 응답)의 3 차원 변위에 따라 허용 마이크론이 수백의 길이 비늘에 이동 형광 입자. 이 방법은 추적 된 대상물 주위에 원형 궤도를 수행하기 위해 두 개의 광자 레이저 스캐닝 현미경의 하드웨어를 제어하는​​ 피드백 알고리즘을 기반으로한다 : 피드백기구의 변위를 제어하여 중심에 형광 물체를 유지 주사 빔 3-5. 이 기술의 장점을 설명하기 위해, 우리는 알 내에서 빠르게 움직이는 세포 기관, 리소좀을 따라iving 셀 6,7. 세포는 표준 프로토콜에 따른 도금 및 상업적 리소좀 염료를 사용하여 염색 하였다. 우리는 살아있는 세포의 내부 3D 궤도 추적 실험을 수행하기 위해, 간단히 하드웨어 구성과보다 상세히 제어 소프트웨어를 논의한다. 우리는 상세히 주사 현미경을 제어하고 입자 주위 닫힌 궤도 빔의 움직임을 사용하기 위해 필요한 파라미터들을 논의한다. 우리는이 방법이 효과적으로 생균 내에 3 차원 미세 소관을 따라 표시된 리소좀의 빠른 움직임을 추적 할 수있는 방법을 보여줌으로써 결론. 리소좀은 일반적으로 미세 소관 네트워크 8 따라 모션을 지시 표시, 0.4-0.5 μM / 초 범위의 속도로 이동할 수있다.

이 프로토콜에 따라 고속 3D 단일 입자 추적은 형광 표지 리소좀의 변위를 추적하는 개질 이광자 현미경을 이용하여 살아있는 세포 내부에서 수행 될 수있다. 실험 수행 엔도 좀의 성숙 과정 9 후 셀 내부 이동 절연 리소좀 추적 이루어져있다. 리소좀은 녹색 형광 염료를 사용하여 염색하고 2 광자 여기 악용 930 nm에서 여기시켰다. 우리의 데이타는 32 밀리 초 (도 1A)의 시간 해상...

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3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

수정 된 두 개의 광자 현미경에서 3D 궤도 추적 : 세포 내 소포의 추적에 응용

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Tracking Hypoxic Signaling within Encapsulated Cell Aggregates

캡슐화된 세포 집계 내에서 추적 Hypoxic 신호

In Diabetes mellitus type 1, autoimmune destruction of the pancreatic &beta;-cells results in loss of insulin production and potentially lethal ...

연구

생체공학

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

입자 추적 microrheology은을 사용하여 3D 종양 모델에서 세포 외 매트릭스 강성의 경도 측정

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy

표면 형광을 가진 조직 매트릭스 구성 요소 및 두 개의 광자 현미경의 장기의 intravital 면역 형광 이미징

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

입자 추적 Microrheology에 의한 바이오 필름의 기계적 성질의 제자리 매핑에서

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Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

입자의 공간 추적을위한 멀티 플렉스 전자 감지와 미세 유체 플랫폼

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

마이크로 웰 어레이 플랫폼 내 미생물 공동체 개발의 구성 및 추적

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

실시간 3D 단일 입자 추적에 대 한 프로토콜

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

균일 한 골 재를 생산 하 오 모양의 혈관에 포유류 세포의 문화를 떨고는 궤도

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

하이드로겔 기반 3D 문화 모델을 자동화및 표준화방식으로 제조하는 오픈 소스 기술 플랫폼

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

Transplantation of a 3D Bioprinted Patch in a Murine Model of Myocardial Infarction

심근 경색의 뮤린 모델에서 3D 생체 인쇄 패치의 이식

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ...