Name: production and isolation of axons from sensory neurons for biochemical analysis using porous filters
Uploaded: 2014-07-08T23:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters at JoVE.com

This project was supported by grant MOP62827 from the Canadian Institutes of Health Research.

NOTA: Os seguintes procedimentos estão em conformidade com as directrizes aprovadas pelo Conselho Canadense de Cuidado Animal. Todos os esforços são para minimizar a dor eo sofrimento dos animais durante os procedimentos. 1. Revestimento de Filtros Nota: Quando as inserções de filtro de cultura são colocadas em poços de placas de poços múltiplos, dois compartimentos são definidos: o compartimento de cima é a região superior da inserção e do compartime...

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	<li>Conde, C., Caceres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+assembly,+organization+and+dynamics+in+axons+and+dendrites.">Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10, 319-332 (2009).</li><li>Rasband, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axon+initial+segment+and+the+maintenance+of+neuronal+polarity.">The axon initial segment and the maintenance of neuronal polarity.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 552-562 (2010).</li><li>Lingor, P., Koch, J. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+mRNA+in+uninjured+and+regenerating+cortical+mammalian+axons.">Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons.</a> J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).</li><li>Minis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+transcriptomics-Dissection+of+the+mRNA+composition+in+the+axonal+compartment+of+sensory+neurons.">Subcellular transcriptomics-Dissection of the mRNA composition in the axonal compartment of sensory neurons.</a> Dev. Neurobiol. , (2013).</li><li>Niekerk, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumoylation+in+axons+triggers+retrograde+transport+of+the+RNA-binding+protein+La.">Sumoylation in axons triggers retrograde transport of the RNA-binding protein La.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 12913-12918 (2007).</li><li>Huang, E. J., Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophins:+roles+in+neuronal+development+and+function.">Neurotrophins: roles in neuronal development and function.</a> Annu. Rev. Neurosci. 24, 677-736 (2001).</li><li>Vargas, M. E., Barres, B. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection,+Plating,+and+Maintenance+of+Dorsal+Root+Ganglion+Neurons+for+Monoculture+and+for+Coculture+with+Dorsal+Horn+Neurons.">Dissection, Plating, and Maintenance of Dorsal Root Ganglion Neurons for Monoculture and for Coculture with Dorsal Horn Neurons.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).</li><li>Leach, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+culture+of+primary+motor+and+sensory+neurons+in+defined+media+on+electrospun+poly-L-lactide+nanofiber+scaffolds.">The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li><li>Sasaki, Y., Araki, T., Milbrandt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+nicotinamide+adenine+dinucleotide+biosynthetic+pathways+delays+axonal+degeneration+after+axotomy.">Stimulation of nicotinamide adenine dinucleotide biosynthetic pathways delays axonal degeneration after axotomy.</a> J. Neurosci. 26, 8484-8491 (2006).</li></ol>

Parâmetros importantes a ter em conta aquando da adaptação desta técnica incluem a população neuronal que vai ser estudado, o substrato, o tamanho dos poros do filtro e área de superfície. Todos estes parâmetros terá impacto sobre a especificidade, qualidade e quantidade da preparação neurite obtido e deve ser analisada com cuidado pelo usuário final. Nos exemplos apresentados neste protocolo, o uso de neurônios DRG tem a vantagem de estender apenas axônios, dando assim um puro preparação axonal (espec?...

O compartimento axonal de neurônios mostra um elevado grau de independência funcional do compartimento do somato-dendrítica. Em neurônios de projeção, os axônios conter a maior parte do 1,2 proteína neuronal. O estudo da fisiologia e fisiopatologia dos axônios ganhou força na comunidade da neurociência porque estudos recentes têm mostrado que a disfunção axonal no início parece ser uma característica comum de doenças neurodegenerativas e distúrbios neuropsiquiátricos 3. Parece provável que uma melhor compreensão dos mecanismos axonal exclusiva em condições normais e patológicas vai lançar luz sobre os eventos iniciais que levam a disfunção. O presente protocolo descreve como utilizar inserções de cultura tendo uma membrana porosa (filtro) para obter grandes quantidades de material axonal puro que é adequado para análises bioquímicas e imunocitoquímica. O uso de filtro insere estudar biologia axonal foi implementado pela primeira vez por Steward e4 colegas e desenvolvido por Twiss e colegas 5 a sua configuração actual. A técnica é agora de uso corrente por parte de grupos que estudam diferentes aspectos da biologia axonal e dendritos, com ligeiras modificações, em cada caso para acomodar a população de neurônios estudados, os tratamentos realizados eo tipo de análises bioquímicas usadas 6-9. O presente protocolo não pretende acomodar todas as alternativas para uma tal variedade de aplicações, mas sim fornecer uma abordagem simples que é adequado para a maioria das aplicações. Em particular, o protocolo descrito aqui utiliza uma camada tripla que maximiza o rendimento axonal para análises bioquímicas e é o mais apropriado para estudar revestimentos degeneração axonal outros descritos na literatura produziu menos axónios que retraem e degeneram mais rápido quando privados de factores tróficos 9. Neste procedimento, os corpos celulares neuronais permanecer isolada sobre os filtros de whaxônios ile passar através dos poros e crescer ao longo de sua superfície inferior. Axónios puros (livres de células da glia e os contaminantes do corpo da célula neuronal), que crescem sobre a superfície inferior do filtro pode ser recolhido para análises bioquímicas ou pode ser fixada in situ e examinadas por meio de técnicas de imunocitoquímica 9. O procedimento baseia-se na utilização de neurónios sensoriais embrionárias a partir de gânglios da raiz dorsal (DRG). DRGs embrionárias são amplamente usados ​​para o estudo da biologia axonal porque neurites a partir dessas células sofrem um crescimento rápido e robusto, in vitro, quando mantidos em factor de crescimento do nervo (NGF), e porque rapidamente sofrer degeneração quando privados deste factor. Além disso, os neurónios DRG falta dendritos, de modo que todas as neurites recolhidos por este método são meramente axónios. Filtrar inserções representam uma grande vantagem em comparação com outras abordagens utilizadas para estudar os axônios. Estudos que dependem da utilização de microscopia de diferenciar os processos que ocorrem na célula do soma daquelas numaXONs fornecer informação bioquímica limitado. Como outro exemplo, os sistemas de cultura (por exemplo, em compartimentos, câmaras Campenot 10 ou dispositivos de microfluidos 11) são úteis para abordagens de imagem e para o tratamento diferencial de compartimentos celulares, mas fornecer apenas pequenas quantidades de material axonal, impedindo o uso destas técnicas para análises bioquímicas que requerem quantidades relativamente grandes de amostra. Além disso, seu uso requer treinamento significativo, bem como dispositivos especializados, e eles são demorados. Outra abordagem frequentemente usada para isolar os axônios a partir de explantes é remover manualmente um centro de explante (contendo corpos celulares neuronais) antes da coleta de amostra axonal. Embora este pode produzir grandes quantidades de preparações enriquecidas dos axónios, os axônios nesta preparação pode ser envolto em células gliais e removendo rapidamente corpos 20 do explante consecutivamente a partir de 6 poços (como um exemplo de uma experiência mínima) é demorado e no limite de viabilidade. Em contraste, o método aqui apresentado produz preparações axonais abundante e pura, que pode, então, ser analisados ​​por virtualmente qualquer técnica bioquímica que é vulgarmente utilizado para analisar os lisados ​​de células inteiras, como Western blot, imunoprecipitação 6, northern blot 5 espectrometria de massa 6, a purificação de ARN 7,12,13, entre outros. Além disso, o protocolo pode ser aplicado para imunofluorescência (IF) de técnicas, como é possível a fixação de axónios em crescimento no lado inferior do filtro para os examinar ainda por IF. Esta abordagem facilita muito a análise dos processos específicos de axonal já que não há corpos celulares na preparação final. Esta é uma vantagem significativa uma vez que um sinal de alta imunofluorescência de corpos celulares muitas vezes prejudica o exame e análise de um sinal mais fraco proveniente de estruturas finas, tais como axónios. Duas aplicações do método de cultura para estudar axonal ar degeneraçãoe descritos; um modelo de poda de desenvolvimento e um modelo de degeneração induzida por lesão (comumente referido como degeneração Walleriana). A modelagem da poda de desenvolvimento baseia-se no fato de que os neurônios sensoriais in vivo competem para limitar a quantidade de NGF derivado do alvo e aqueles não receber suficiente neurotrófico degenerado apoio 14. Este fenómeno pode ser mimetizado em culturas de DRG embrionárias mediante a retirada do NGF do meio de cultura, o que, como acontece in vivo, inicia a degeneração axonal seguida da destruição de células do corpo. Para modelar a degeneração Wallerina, o lado superior do filtro com os corpos celulares é raspado. Os axônios que tinham crescido para o lado inferior do filtro tornar-se fisicamente separados dos corpos celulares e, posteriormente, submeter-se ao processo degenerativo rápido e estereotipado conhecida como degeneração Walleriana 15, em homenagem a A. Waller que primeiro relatou o fenômeno em 1850 16.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="972">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">CD-1 mouse, E13 timed pregnancy</td>
			<td style="width:140px;">Charles River</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:416px;">In house timed pregnancies can be done by mating mice and checking for vaginal plugs (Day E0)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Cell Culture Inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353102</td>
			<td>1 &#181;m pore size, fits 6-well receiving plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Cell Culture Companion Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353502</td>
			<td>Receiving plates for inserts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6407</td>
			<td>Used at 1 mg/ml in water. Can re-use once.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td style="width:416px;">Used at 10 ug/ml in water. Take 100X stock from -80 &#176;C and thaw overnight at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PureCol Bovine Collagen Solution</td>
			<td>Advanced Biomatrix</td>
			<td>5005-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11415-064</td>
			<td>Can be replaced by DMEM.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-27 Serum-Free Supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-Fluoro-2&#8242;-deoxyuridine (FDU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NGF (2.5S, beta subunit)</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CLMCNET-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="88">
			<td height="109" rowspan="2" style="height:109px;width:297px;">Anti-NGF Antibody</td>
			<td style="width:140px;">Prepared in-house</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:416px;">As described in: Acheson, A., Barker, P.A., Alderson, R.F., Miller, F.D. &#38; Murphy, R.A. Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF. Neuron.7, 265-75, (1991)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alomone Labs</td>
			<td style="width:119px;">AN-240</td>
			<td>Commercial option</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Tubulin Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB5564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DRG culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:297px;">Neurobasal Medium 
			2 % B27 Neurobasal Supplement 
			2 mM l-Glutamine 
			1 % Penicillin-Streptomysin 
			10 &#181;M FDU 
			15 ng/ml NGF (bottom compartment only)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Laemmli Sample Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:297px;">10 % SDS 
			0.5 M DTT 
			0.5 M Tris (pH 6.8) 
			5 % Glycerol 
			0.01 % (w/v) Bromophenol blue</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production and isolation of axons from sensory neurons for biochemical analysis using porous filters

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is required to shape functional neuronal circuits. The protocol described here explains how to use cell culture inserts bearing a porous membrane (filter) to obtain large amounts of pure axonal preparations suitable for examination by conventional biochemical or immunocytochemical techniques. The functionality of these filter inserts will be demonstrated with models of developmental pruning and Wallerian degeneration, using explants of embryonic dorsal root ganglion. Axonal integrity and function is compromised in a wide variety of neurodegenerative pathologies. Indeed, it is now clear that axonal dysfunction appears much earlier in the course of the disease than neuronal soma loss in several neurodegenerative diseases, indicating that axonal-specific processes are primarily targeted in these disorders. By obtaining pure axonal samples for analysis by molecular and biochemical techniques, this technique has the potential to shed new light into mechanisms regulating the physiology and pathophysiology of axons. This in turn will have an impact in our understanding of the processes that drive degenerative diseases of the nervous system.

Explantes gânglio da raiz dorsal de ratos E13.5 crescer extensivamente sobre filtros sequencialmente revestidas com poli-D-lisina, laminina e colágeno (Figura 1B, à esquerda), atingindo até 2 mm de dentro de 2 dias em cultura. Esta combinação de substrato produz um crescimento particularmente exuberante; outras combinações produzir axónios que são consideravelmente mais curto (Figura 1B, à direita). Além disso, os GDH mantidos em filtros estender mais e mais longos do que os...

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Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration.

Produção e Isolamento de axônios de neurônios sensoriais para análise bioquímica Usando filtros porosos

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Respostas análise de rato Olfactory neurônios sensoriais Usando a gravação Electroolfactogram Air fase

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Neurociência

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Análise morfológica de Drosophila Larval sensorial periférica Dendrites Neuron e axônios Usando Mosaicos Genéticos

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Flash Fotólise de Compostos Caged no Cilia de Olfactory neurônios sensoriais

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Isolamento e Cultura de neurônios do hipocampo de ratos pré-natal

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

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Tensão sensível Gravação Dye de axônios, dendritos e espinhas dendríticas de neurônios individuais em fatias de cérebro

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

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Isolamento de neurônios sensoriais de<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Para Remendo Recordings Grampo de Correntes glutamatérgicos

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

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Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Isolamento e Cultura de Dissociated neurônios sensoriais de Chick Embriões

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Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

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Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...

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zebrafish<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Preparação para gravações eletrofisiológicas da Spinal Sensorial e Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...