Name: culturing caenorhabditis elegans in axenic liquid media and creation of transgenic worms by microparticle bombardment
Uploaded: 2014-08-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von den National Institutes of HealthGrants DK85035 und DK074797 (IH) unterstützt.

1. Worm Stämme <ol><li> Erhalten C. elegans Wildtyp N2 Bristol-Sorten von Caenorhabditis Genetics Center (CGC) (http://www.cbs.umn.edu/cgc) und halten sie auf NGM-Platten ausgesät mit E. coli-Stamm OP50 7. Hinweis: Transgene Wurm Stämme IQ6011 (Phrg-1 :: GFP) verwendet wurden, wie zuvor beschrieben, erzeugt 11. IQ6011 können aus dem entsprechenden Autor angefordert werden. </li></ol> 2. Herstellung des modifizierten <...

<ol>
	<li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi.">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421, 231-237 (2003).</li><li>Nass, R., Blakely, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+dopaminergic+system:+opportunities+for+insights+into+dopamine+transport+and+neurodegeneration.">The Caenorhabditis elegans dopaminergic system: opportunities for insights into dopamine transport and neurodegeneration.</a> Annual review of pharmacology and toxicology. 43, 521-544 (2003).</li><li>Lapierre, L. 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Current protocols in toxicology editorial board, Mahin D. Maines. , (2007).</li><li>Schweinsberg, P. J., Grant, B. D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+gene+transformation+by+microparticle+bombardment+WormBook+the+online+review+of+C.">elegans gene transformation by microparticle bombardment WormBook the online review of C.</a> elegans biology. , 1-10 (2013).</li><li>Rao, A. U., Carta, L. K., Lesuisse, E., Hamza, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+heme+synthesis+in+a+free-living+eukaryote.">Lack of heme synthesis in a free-living eukaryote.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4270-4275 (2005).</li><li>Szewczyk, N. J., Kozak, E., Conley, C. 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In diesem Protokoll präsentieren wir eine modifizierte axenischen flüssigen Medien, die für eine schnelle mCeHR C erlaubt elegans Generation mit der Produktion einer großen Anzahl von Würmern. Dieses Bild zeigt mehrere Vorteile, wie die Würmer ohne Kontamination E. gewachsen coli oder bakteriellen Nebenprodukten und in Ernährungs-und toxikologischen Untersuchungen genutzt werden. Die Verwendung von E. coli oder anderen Bakterien in solchen Studien hat mehrere Nachteile...

Der Boden Fadenwurm Caenorhabditis elegans ist ein leistungsfähiges Modellorganismus in zahlreichen Studien von der Genetik zur Toxikologie verwendet. Als Ergebnis der 1 mm Größe, Generationszeit von vier Tagen Kultivierung einfache schnelle und große Zahlen Nachkommen haben diese Nematoden in einer Reihe von pharmakologischen und genetischen Bildschirme 1, 2 verwendet wurden. Forscher nutzen diese Wurm-Moleküle und Signalwege in Wirbelsysteme erhalten zu identifizieren. Diese Wege sind Zelltod-Signale, Wege des Alterns und der Stoffwechsel und das Nervensystem 6.3. Zusätzlich wird die Transparenz der C elegans können für die Erzeugung von transgenen Linien mit fluoreszierenden Reporter-Proteins, die direkt sichtbar ist, um die Genexpression und Proteinlokalisation Muster analysieren. In vielen Studien auf einem festen Agar-basierte Oberfläche mit Nematoden Wachstumsmedium (NGM) Platten oder in l dieser Nematoden gezüchtetiquid Kulturen ausgesät mit Escherichia coli als Nahrungsquelle 7,8. Diese bakteriellen Nahrungsquellen können biochemischen und toxikologischen Studien mit Störungen von bakteriellen Nebenprodukten, die die Interpretation der Ergebnisse zu verwechseln. Um diese Effekte zu vermeiden Compoundierung, C. elegans kann in einer keimfreien flüssigen Medien, die frei von Bakterien als Nahrungsquelle kultiviert werden. Mit Hilfe dieser Medien, erfolgreich wir Millionen von hochsynchrone Würmer für viele Standard-C kultiviert elegans Protokolle wie Microarray-Analyse von differentiell regulierten Gene in C. elegans ausgesetzt, um verschiedene Häm-Konzentrationen und Herstellung von transgenen Würmer Verwendung von Gen-Bombardement. Dieses Medium ist chemisch definiert und von einem Original-Rezept von Dr. Eric Clegg 9 formuliert modifiziert. Mit dieser mCeHR Medien, haben wir erfolgreich Gene in Häm-Homöostase beteiligt identifiziert, die als Häm-responsive Gene (HRG n) 10, was wärewurden nicht in regulären Wachstumsbedingungen, die NGM-Agar-Platten mit E. ausgesät nutzen möglich coli. In diesem Protokoll beschreiben wir das Verfahren zur Einführung und Beibehaltung C. elegans auf E. gewachsen coli auf die axenischen mCeHR und nutzen diese Methode, um eine große Anzahl von Würmern zur Herstellung von transgenen C zu erhalten elegans Linien mit Mikropartikelbeschuss. Außerdem präsentieren wir Studien, die den Nutzen der Verwendung axenischen Medien für die Bestimmung der Nährstoffbedarf von C. zeigen elegans mit Häm als Beispiel. Diese Studien zeigen, dass die Verwendung mCeHR Medien ermöglicht schnelle Wachstum von einer großen Anzahl von C elegans für viele Forscher von Wurm genutzt Downstream-Anwendungen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="754">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">MgCl2.6H2O</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">M-2393</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium citrate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">S-4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium citrate.H2O</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P-1722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CuCl2.2H2O</td>
			<td style="width:108px;">Fisher</td>
			<td style="width:121px;">C455-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MnCl2.4H2O</td>
			<td style="width:108px;">Fisher</td>
			<td style="width:121px;">M87-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">ZnCl2</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">Z-0152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">F-1018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2.2H2O</td>
			<td style="width:108px;">Fisher</td>
			<td style="width:121px;">C70-500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adenosine 5 -monophosphate, sodium salt</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">A-1752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytidine 5 -phosphate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">C-1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guanosine 2 - and3&#160; -monophosphate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">G-8002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uridine 5 -phosphate, disodium salt</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">U-6375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thymine&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">T0376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">N-Acetylglucosamine</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td>A3286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">DL-Alanine</td>
			<td style="width:108px;">Fisher</td>
			<td>S25648&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">p-Aminobenzoic Acid</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">A-9878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Biotin</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">B-4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Cyanocobalamine (B-12)</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">V-2876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Folinate (Ca)&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">F-7878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Niacin</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">N-0761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Niacinamide</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">N-3376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Pantetheine</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P-2125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Pantothenate (Ca)</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P-6292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Pteroylglutamic Acid (Folic Acid)</td>
			<td style="width:108px;">ACRCS</td>
			<td style="width:121px;">21663-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Pyridoxal 5&#39;-phosphate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P-3657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Pyridoxamine.2HCl</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P-9158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Pyridoxine.HCl</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P-6280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">Riboflavin 5-PO4(Na)</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">R-7774</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Thiamine.HCl</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">T-1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">DL-6,8-Thioctic Acid</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">T-1395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P-5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Choline di-acid citrate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">C-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">myo-Inositol</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">I-5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">G-7520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lactalbumin enzymatic hydrolysate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">L-9010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Brain Heart Infusion</td>
			<td style="width:108px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">211065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Hemin chloride</td>
			<td style="width:108px;">Frontier Scientific</td>
			<td style="width:121px;">H651-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">HEPES, Na salt</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">H-3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:108px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:121px;">F676-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td style="width:108px;">Invitrogen</td>
			<td>11140-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Amino Acids Solution</td>
			<td style="width:108px;">Invitrogen</td>
			<td>11130-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nalidixic acid sodium salt</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td>N4382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetracycline Hydrochloride</td>
			<td style="width:108px;">MP Biomedicals</td>
			<td>2194542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biolistic Delivery System</td>
			<td style="width:108px;">BioRad</td>
			<td>165-2257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Gold particles (Au Powder)&#160;</td>
			<td style="width:108px;">&#160;Ferro Electronic Material Systems</td>
			<td style="width:121px;">6420 2504, JZP01010KM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">or</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gold Particles 1.0 &#956;m</td>
			<td style="width:108px;">BioRad</td>
			<td>&#160;165-2263</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing caenorhabditis elegans in axenic liquid media and creation of transgenic worms by microparticle bombardment

In diesem Protokoll stellen wir die benötigten Materialien und das Verfahren zur Herstellung von modifizierten C. E legans Gewöhnung und Wiedergabemedien (mCeHR). Darüber hinaus sind die Schritte zum Belichten Akklimatisierung und C. elegans auf E. gewachsen coli, um flüssige Medien axenischen beschrieben. Schließlich abwärts Experimente, die axenischen C nutzen elegans veranschaulichen die Vorteile dieses Verfahrens. Die Fähigkeit, zu analysieren und festzustellen, C. elegans Nährstoffbedarf wurde durch den Anbau von N2 Wildtyp-Würmer in axenischen flüssigen Medien mit unterschiedlichen Häm-Konzentrationen dargestellt. Dieses Verfahren kann mit anderen Nährstoffen repliziert werden, um die optimale Konzentration für Schnecken Wachstum und Entwicklung zu bestimmen, oder, um die toxikologischen Wirkungen von medizinischen Behandlungen zu bestimmen. Die Auswirkungen von verschiedenen Häm-Konzentrationen auf das Wachstum von Wildtyp-Würmer wurden durch qualitative mikroskopische Beobachtung und Quantifizierung von t bestimmter Anzahl der Würmer, die in jedem Häm-Konzentration wuchs. Zusätzlich kann die Wirkung von verschiedenen Nährstoffkonzentrationen durch Verwendung Würmer, Fluoreszenzsensoren, die auf Änderungen in den Nährstoff von Interesse reagieren auszudrücken getestet werden. Darüber hinaus wurde eine große Anzahl von Würmern leicht zur Erzeugung von transgenen C. elegans mittels Mikropartikelbeschuss erzeugt.

Kultivierung C. elegans in flüssigem Medium axenic Hilfsmittel bei der Bestimmung von Nährstoffen, die von Würmern erforderlich sind, ohne Störung durch von E. sekundäre Stoffwechselprodukte coli. Wildtyp N2 Würmer zu akklimatisieren mCeHR Medien innerhalb von drei Generationen und zeigen Wachstum vergleichbar Würmer auf NGM Bakterienplatten gewachsen. In der Tat, diese Würmer geworden schwangeren innerhalb von 4 Tagen im Vergleich zu 3,5 Tage für Würmer auf OP50 Bakterien gewachsen....

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Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

C. elegans ist in der Regel auf festen Agarplatten oder in Flüssigkulturen ausgesät mit E. coli. Um bakterielle Nebenprodukte aus Verwechslung toxikologischen und Ernährungsstudien zu verhindern, verwendeten wir eine axenischen flüssigen Medium, CEHR, um für eine Reihe von nachgelagerten Anwendungen wachsen und synchronisieren Sie eine große Anzahl von Würmern.

Die Züchtung<em&gt; Caenorhabditis elegans</em &gt; In Axenic Flüssige Medien und Erstellung von transgenen Worms durch Mikropartikelbeschuss

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

Research

JoVE Journal

Biology

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

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Messung Caenorhabditis elegans Life Span auf festen Medien

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Forschung

Biologie

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

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Erzeugung von transgenen C. elegans Nach Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

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Isolation und In-vitro- Aktivierung von Caenorhabditis elegans Sperma

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

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Zeitraffer-Mikroskopie der frühen Embryogenese in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

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Grundlegende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisation und Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

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Prostaglandin Extraktion und Analyse in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

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In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

Ein screenbaren<em&gt; In-vivo-</em&gt; Assay für Mitochondriale Modulatoren Verwendung transgener Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

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der Anbau von<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; In drei Dimensionen im Labor

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

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Kombinierte Nukleotid- und Protein Extraktionen in Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...