Name: rapid analysis of chromosome aberrations in mouse b lymphocytes by pna-fish
Uploaded: 2014-08-19T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH at JoVE.com

Dette arbejde er støttet af NIH tilskud R00 CA160574 (SFB) og ved et fællesskab af Rutgers Bioteknologi Training Program (til SMM).

Denne procedure blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på Rutgers, State University of New Jersey. Musene blev behandlet i overensstemmelse med NIH Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr. Forskere bør konsultere deres nationale og institutionelle animalske organisationer for etablerede og godkendte retningslinjer. Inden du begynder, forberede de løsninger, der er anført i tabel 1. 1. B celleisolering og aktivering <...

<ol>
	<li>Sancar, A., Lindsey-Boltz, L. A., Unsal-Kacmaz, K., Linn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+mammalian+DNA+repair+and+the+DNA+damage+checkpoints.">Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints.</a> Ann Rev Biochem. 73, 39-85 (2004).</li><li>Sperka, T., Wang, J., Rudolph, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+checkpoints+in+stem+cells,+ageing+and+cancer.">DNA damage checkpoints in stem cells, ageing and cancer.</a> Nature reviews Mol Cell Biol. 13 (9), 579-590 (2012).</li><li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer.">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).</li><li>Bunting, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+inhibits+homologous+recombination+in+Brca1-deficient+cells+by+blocking+resection+of+DNA+breaks.">53BP1 inhibits homologous recombination in Brca1-deficient cells by blocking resection of DNA breaks.</a> Cell. 141 (2), 243-254 (2010).</li><li>Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+karyotyping+analysis+of+human+and+mouse+chromosomes.">Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3129-3142 (2006).</li><li>Callen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+IgH-TCRalpha/delta+translocations+in+T+lymphocytes+mediated+by+RAG.">Chimeric IgH-TCRalpha/delta translocations in T lymphocytes mediated by RAG.</a> Cell Cycle. 8 (15), 2408-2412 (2009).</li><li>Boboila, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+end-joining+catalyzes+robust+IgH+locus+deletions+and+translocations+in+the+combined+absence+of+ligase+4+and+Ku70.">Alternative end-joining catalyzes robust IgH locus deletions and translocations in the combined absence of ligase 4 and Ku70.</a> Natl Acad Sci USA. 107 (7), 3034-3039 (2010).</li><li>Benn, P., Delach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lymphocyte+culture+and+chromosome+analysis.">Human lymphocyte culture and chromosome analysis.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).</li><li>Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metaphase+spreads+and+spectral+karyotyping+of+human+embryonic+stem+cells.">Metaphase spreads and spectral karyotyping of human embryonic stem cells.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).</li><li>Schreck, R. R., Disteche, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4.">Chapter 4.</a> Chromosome banding techniques. Unit 2, (2001).</li><li>Gilley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-PKcs+is+critical+for+telomere+capping.">DNA-PKcs is critical for telomere capping.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98 (26), 15084-15088 (2001).</li><li>Bolzan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+aberrations+involving+telomeres+and+interstitial+telomeric+sequences.">Chromosomal aberrations involving telomeres and interstitial telomeric sequences.</a> Mutagenesis. 27 (1), 1-15 (2012).</li><li>Bolzan, A. D., Telomeres Bianchi, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=interstitial+telomeric+repeat+sequences+and+chromosomal+aberrations.">interstitial telomeric repeat sequences and chromosomal aberrations.</a> Mutat Res. 612 (3), 189-214 (2006).</li><li>Poon, S. S., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+18.">Chapter 18.</a> Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Unit 18 14, (2001).</li><li>Morales, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+and+p53+synergize+to+suppress+genomic+instability+and+lymphomagenesis.">53BP1 and p53 synergize to suppress genomic instability and lymphomagenesis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (9), 3310-3315 (2006).</li><li>Halaby, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interaction+of+Rnf8+and+p53+in+the+protection+against+genomic+instability+and+tumorigenesis.">Synergistic interaction of Rnf8 and p53 in the protection against genomic instability and tumorigenesis.</a> PLoS Genet. 9 (1), e1003259 (2013).</li></ol>

Betragtninger aktiverede B-lymfocytter er særligt velegnede til fremstilling af mitotiske kromosom opslag, kan andre celletyper også anvendes. T-lymfocytter deler mange af fordelene ved B-celler, som de kan oprenses fra milt eller lymfeknuder, og har et højt mitotisk indeks, når de stimuleres ved vækst i medium indeholdende passende mitogener 8. Embryonale stamceller (ES-celler) er også velegnet til metafase kromosomanalyse 9. Hvis disse ikke er tilgængelige, kan fibroblastceller anvendes, s...

Kræft er forårsaget af ophobning af mutationer påvirker gener, som regulerer normal cellevækst. Mutation er en konsekvens af ændringer i strukturen og rækkefølgen af ​​genomet forårsaget af skader på DNA. DNA-beskadigelse kan forekomme gennem en række, herunder exogene midler, såsom ioniserende stråling, og som et biprodukt af normal cellulær metabolisme, såsom spontan deaminering af nukleotidbaser eller skader, der forekommer ved kontakt med reaktive oxygenarter 1. Selv pattedyrceller i besiddelse af en række reparations aktiviteter, der kan vende DNA skader eller genoprette sekvensen ved brud steder, mutationer alligevel ophobes i hele deres levetid af en celle. DNA-skader kan desuden bidrage til fremadskridende alderdom og tab af styrke af stamceller, to processer, der er forbundet med aldring-associeret sygdom 2. Forståelse reparation af DNA-skader er derfor af central betydning i håndteringen to tegnvæsentlig in dvirknin g spørgsmål i folkesundheden. Stigende tyder på, at pattedyr DNA-reparation veje kan bidrage til udviklingen af kræft cellegenomet 3,4, hvilket gør det endnu mere nødvendigt at forstå de involverede i at undertrykke mutation på det molekylære niveau processer. Direkte visualisering af kromosomafvigelser er en kraftfuld og kvantitative midler til at bestemme omfanget af genomisk instabilitet i en bestemt celletype. Kondenserede kromosomer fra celler ved metafase kan isoleres og inspiceres ved hjælp af lys eller fluorescerende mikroskopi. Sådanne cytogenetiske tilgange har været i praksis i flere årtier og kan anvendes til at påvise forekomsten af ​​translokationer eller specifikke typer kromosomafvigelser forbundet med tab af DNA reparation aktiviteter. Protokollen egner sig til flere potentielle udvidelser kromosomerne kan mærkes med prober for spektral karyotypering (SKY) eller flerfarvet fluorescerende in situ-hybridisering(MFISH) for at identificere omplantning 5,6. Disse teknikker gør det også muligt hyppigheden af ​​kromosom translokationer og strukturen af ​​komplekse kromosom translokationer, der skal bestemmes, som giver yderligere oplysninger ud over, hvad der er muligt med denne protokol. Alternativt kan sekvensspecifikke prober genereres og anvendes til at teste hyppigheden af DNA-brud på udvalgte genomiske steder 7. I denne protokol, vi beskriver fremstilling af metafase kromosom spreder sig fra B-lymfocytter. En fluorescens-mærket peptid-nukleinsyre (PNA) probe til telomer gentagelser anvendes, som effektivt markerer telomerer i metafase kromosom spreder Denne protokol har flere fordele. B-celler kan induceres til at vokse ved høje Mitoseindekset så høj kvalitet smørematerialer kan konsekvent fremstilles. B-celler fra genetisk modificerede mus er også langt mindre tilbøjelige til at indeholde sekundære genetiske mutationer, der kan forvirre analysen af ​​bidragetspecifikke gener til genomisk integritet. PNA-FISH tilgang kan afsluttes på én dag, og giver mulighed for mere præcis scoring af kromosombrug. Ved at bruge denne fremgangsmåde, især i kombination med særligt udstyr, der er beskrevet i denne protokol, er det muligt at fremstille meget konsekvent høj kvalitet spænd og hurtigt analysere hastigheden og typen af ​​genomisk ustabilitet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="679">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Name</td>
			<td style="width:116px;">Company&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:176px;">&#160;Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50% Dextran sulfate</td>
			<td>Intergen</td>
			<td>S4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deionized formamide&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pepsin (5g)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 6887&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FCS</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LPS (100mg)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IL-4 (5&#956;g)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PNA Telomere Probe</td>
			<td>PNA Bio Inc</td>
			<td>F1002</td>
			<td>(CCCTAACCCTAACCCTAA)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Colcemid</td>
			<td>Roche</td>
			<td>295892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mowiol 4-88</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>81381-50g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD43 (ly-48_) micro-beads</td>
			<td>Miltenyl Biotec.&#160;</td>
			<td>130-049-801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32670-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eclipse E800</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AxioImager.Z2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber</td>
			<td>Thermotron</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid analysis of chromosome aberrations in mouse b lymphocytes by pna-fish

Defekt DNA-reparation fører til øget genomisk ustabilitet, som er den egentlige årsag til mutationer, der fører til tumorigenese. Analyse af hyppighed og type af kromosomafvigelser i forskellige celletyper tillader defekter i DNA-reparation veje til at blive belyst. Forståelse pattedyr DNA-reparation biologi er blevet stærkt hjulpet af produktion af mus med huller i specifikke gener. Målet med denne protokol er at kvantificere genomisk ustabilitet i mus B-lymfocytter. Mærkning af telomerer anvender PNA-FISH prober (peptidnukleinsyreenheder - fluorescerende in situ hybridisering) letter hurtig analyse af genomisk instabilitet i metafase kromosom opslag. B-celler har specifikke fordele i forhold til fibroblaster, fordi de har normal ploiditet og en højere mitotisk indeks. Kortsigtet kultur af B-celler muliggør derfor præcis måling af genomisk instabilitet i en primær celle befolkning, der er tilbøjelige til at have færre sekundær genetisk mutations, end hvad der typisk findes i transformerede fibroblaster eller patientens cellelinier.

Metafasekromosomer afledt fra en celle skal danne en diskret klynge indeholder 40 kromosomer (hvis der anvendes museceller) (figur 1A). Hvert kromosom har en centromer i den ene ende, som ses som en lys blå kugle. I normale kromosomer er to telomere signaler ses i slutningen af ​​kromatider og to signaler ved hver centromer. Interfasen kerner vil være til stede på diaset så godt. Disse vil være synlig som blå kugler, med røde telomer signaler, men ingen kondenserede kromosomer (se for eksempe...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH at JoVE.com

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

DNA-reparation veje er afgørende for opretholdelse af genomisk integritet og forhindre mutation og kræft. Målet med denne protokol er at kvantificere genomisk ustabilitet ved direkte observation af kromosomafvigelser i metafasespredninger fra muse-B-celler ved hjælp af fluorescerende in situ-hybridisering (FISH) til telomeriske DNA gentagelser.

Hurtig analyse af kromosomafvigelser i Mouse B lymfocytter ved PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Isolering af lymfocytter fra Mouse Genital Tract mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

Hurtig og robust analyse for Cellulær og Molekylær polarisering induceret af kemokinsignalering

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

Påvisning af True IgE-udtrykkende muse-B-afstamningsceller

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

En enkel og hurtig protokol til ikke-enzymatisk dissociere frisk humant væv til analyse af lymfocytter

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Effektiv Isolation Protokol for B og T lymfocytter fra Human Palatine tonsiller

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Hurtig Molekylær Detection og Differentiering af Influenza Virus A og B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Molekylær diffusion i plasma Membraner af primær lymfocytter målt ved fluorescenskorrelationsspektroskopi

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Hurtig Kvantificering af mitogen-induceret blastogenese i T-lymfocytter til Identifikation Immunmodulerende narkotika

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Isolere lymfocytter fra mus Small Intestinal immunsystemet

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...