Name: rapid analysis of chromosome aberrations in mouse b lymphocytes by pna-fish
Uploaded: 2014-08-19T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH at JoVE.com

Diese Arbeit wird von NIH R00 CA160574 (SFB) und durch eine Gemeinschaft der Rutgers Biotechnologie Training Program (SMM) unterstützt.

Dieses Verfahren wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee an der Rutgers, der State University of New Jersey genehmigt. Die Mäuse wurden in Übereinstimmung mit der NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren behandelt. Wissenschaftler sollten ihre nationalen und institutionellen Tierorganisationen für etablierte und genehmigten Richtlinien konsultieren. Bevor Sie beginnen, bereiten die in Tabelle 1 aufgeführten Lösungen. <p class="j...

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	<li>Sancar, A., Lindsey-Boltz, L. A., Unsal-Kacmaz, K., Linn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+mammalian+DNA+repair+and+the+DNA+damage+checkpoints.">Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints.</a> Ann Rev Biochem. 73, 39-85 (2004).</li><li>Sperka, T., Wang, J., Rudolph, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+checkpoints+in+stem+cells,+ageing+and+cancer.">DNA damage checkpoints in stem cells, ageing and cancer.</a> Nature reviews Mol Cell Biol. 13 (9), 579-590 (2012).</li><li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer.">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).</li><li>Bunting, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+inhibits+homologous+recombination+in+Brca1-deficient+cells+by+blocking+resection+of+DNA+breaks.">53BP1 inhibits homologous recombination in Brca1-deficient cells by blocking resection of DNA breaks.</a> Cell. 141 (2), 243-254 (2010).</li><li>Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+karyotyping+analysis+of+human+and+mouse+chromosomes.">Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3129-3142 (2006).</li><li>Callen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+IgH-TCRalpha/delta+translocations+in+T+lymphocytes+mediated+by+RAG.">Chimeric IgH-TCRalpha/delta translocations in T lymphocytes mediated by RAG.</a> Cell Cycle. 8 (15), 2408-2412 (2009).</li><li>Boboila, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+end-joining+catalyzes+robust+IgH+locus+deletions+and+translocations+in+the+combined+absence+of+ligase+4+and+Ku70.">Alternative end-joining catalyzes robust IgH locus deletions and translocations in the combined absence of ligase 4 and Ku70.</a> Natl Acad Sci USA. 107 (7), 3034-3039 (2010).</li><li>Benn, P., Delach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lymphocyte+culture+and+chromosome+analysis.">Human lymphocyte culture and chromosome analysis.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).</li><li>Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metaphase+spreads+and+spectral+karyotyping+of+human+embryonic+stem+cells.">Metaphase spreads and spectral karyotyping of human embryonic stem cells.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).</li><li>Schreck, R. R., Disteche, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4.">Chapter 4.</a> Chromosome banding techniques. Unit 2, (2001).</li><li>Gilley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-PKcs+is+critical+for+telomere+capping.">DNA-PKcs is critical for telomere capping.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98 (26), 15084-15088 (2001).</li><li>Bolzan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+aberrations+involving+telomeres+and+interstitial+telomeric+sequences.">Chromosomal aberrations involving telomeres and interstitial telomeric sequences.</a> Mutagenesis. 27 (1), 1-15 (2012).</li><li>Bolzan, A. D., Telomeres Bianchi, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=interstitial+telomeric+repeat+sequences+and+chromosomal+aberrations.">interstitial telomeric repeat sequences and chromosomal aberrations.</a> Mutat Res. 612 (3), 189-214 (2006).</li><li>Poon, S. S., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+18.">Chapter 18.</a> Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Unit 18 14, (2001).</li><li>Morales, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+and+p53+synergize+to+suppress+genomic+instability+and+lymphomagenesis.">53BP1 and p53 synergize to suppress genomic instability and lymphomagenesis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (9), 3310-3315 (2006).</li><li>Halaby, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interaction+of+Rnf8+and+p53+in+the+protection+against+genomic+instability+and+tumorigenesis.">Synergistic interaction of Rnf8 and p53 in the protection against genomic instability and tumorigenesis.</a> PLoS Genet. 9 (1), e1003259 (2013).</li></ol>

Wohingegen aktivierte B-Lymphozyten sind besonders zur Herstellung von mitotischen Chromosomen-Spreads geeignet, können andere Zelltypen verwendet werden. T-Lymphozyten zu teilen viele der Vorteile von B-Zellen, wie sie aus der Milz oder den Lymphknoten gereinigt werden, und haben einen hohen mitotischen Index, wenn durch das Wachstum in Medium mit geeigneter Mitogene 8 stimuliert. Embryonale Stammzellen (ES-Zellen) sind auch für Metaphasechromosom Analyse 9 geeignet. Wenn diese nicht vorhanden s...

Krebs wird durch die Akkumulation von Mutationen, die Gene, die die normale Zellwachstum regulieren verursacht. Mutation ist eine Folge von Änderungen in der Struktur und Sequenz des Genoms von DNA-Schäden verursacht. DNA-Schädigungen können durch eine Vielzahl von Verfahren, einschließlich exogener Agenzien wie ionisierende Strahlung auftritt, und als ein Nebenprodukt des normalen Zellstoffwechsels, wie zum Beispiel spontane Desaminierung von Nukleotidbasen oder Beschädigung durch Kontakt mit reaktiven Sauerstoffspezies 1 auftritt. Obwohl Säugetierzellen besitzen eine Reihe von Aktivitäten, die Reparatur von DNA-Schäden rückgängig zu machen oder wiederherzustellen die Reihenfolge Bruchstellen können Mutationen dennoch während der gesamten Lebensdauer einer Zelle akkumulieren. DNA-Schädigungen können ferner dazu beitragen, Seneszenz und Verlust der Potenz von Stammzellen, zwei Verfahren, die mit dem Altern verbundene Erkrankung 2 zugeordnet sind. Das Verständnis der Reparatur von DNA-Schäden ist daher von zentraler Bedeutung bei der Bewältigung zwei Zeichenificant in der öffentlichen Gesundheit. Zunehmende Hinweise darauf, dass Säugetier-DNA Reparaturwege können auf die Entwicklung der Krebszellgenom 3,4 beitragen, so dass es umso wichtiger, die Prozesse bei der Unterdrückung Mutation auf molekularer Ebene zu verstehen. Direkte Visualisierung von Chromosomenaberrationen ist ein leistungsfähiges und quantitative mittels Bestimmung des Ausmaßes der genomische Instabilität in einem bestimmten Zelltyp. Kondensierte Chromosomen von Zellen in der Metaphase kann isoliert und untersucht unter Verwendung von Licht oder Fluoreszenzmikroskopie. Solche zytogenetische Ansätze wurden in der Praxis seit Jahrzehnten und kann verwendet werden, um das Auftreten von Translokationen oder spezifische Typen von Chromosomenaberrationen unter Verlust von DNA-Reparatur-Aktivitäten assoziiert nachzuweisen. Das Protokoll eignet sich für mehrere potenzielle Erweiterungen: Chromosomen können mit Sonden zur spektralen Karyotypisierung (SKY) oder mehrfarbige Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung gekennzeichnet werden(MFISH) für die Umsiedlung 5,6 identifizieren. Diese Techniken ermöglichen auch die Häufigkeit der Chromosomentranslokationen und die Struktur komplexer Chromosomentranslokationen zu bestimmen, die über das mit diesem Protokoll ist es möglich zusätzliche Informationen bietet. Alternativ können sequenzspezifische Sonden erzeugt und verwendet, um die Häufigkeit von DNA-Bruch an ausgewählten Standorten genomischen 7 getestet werden. In diesem Protokoll beschreiben wir Herstellung von Metaphasen-Chromosomen-Spreads von B-Lymphozyten. Ein fluoreszenzmarkierten Peptid-Nukleinsäure (PNA) Sonde für Telomerabschnitten verwendet wird, die wirksam markiert Telomere in Metaphase-Chromosomen verteilt Dieses Protokoll hat mehrere Vorteile. B-Zellen induziert werden kann, um bei hohen Mitoseindex wachsen, so dass hochwertige Spreads konsistent hergestellt werden. B-Zellen von genetisch veränderten Mäusen sind auch viel weniger wahrscheinlich, dass sekundäre genetische Mutationen, die die Analyse des Beitrags verwechseln können, enthaltenspezifischer Gene zu genomischen Integrität. Die PNA-FISH-Ansatz kann in einem Tag abgeschlossen werden, und ermöglicht eine genauere Wertung der Chromosomenbrüche. Durch die Nutzung dieser Ansatz, insbesondere in Kombination mit in diesem Protokoll beschriebenen spezifischen Geräten ist es möglich, sehr konsequent, hochwertige Brotaufstriche produzieren und schnell analysieren die Geschwindigkeit und Art der genomische Instabilität.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="679">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Name</td>
			<td style="width:116px;">Company&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:176px;">&#160;Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50% Dextran sulfate</td>
			<td>Intergen</td>
			<td>S4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deionized formamide&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pepsin (5g)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 6887&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FCS</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LPS (100mg)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IL-4 (5&#956;g)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PNA Telomere Probe</td>
			<td>PNA Bio Inc</td>
			<td>F1002</td>
			<td>(CCCTAACCCTAACCCTAA)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Colcemid</td>
			<td>Roche</td>
			<td>295892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mowiol 4-88</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>81381-50g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD43 (ly-48_) micro-beads</td>
			<td>Miltenyl Biotec.&#160;</td>
			<td>130-049-801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32670-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eclipse E800</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AxioImager.Z2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber</td>
			<td>Thermotron</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid analysis of chromosome aberrations in mouse b lymphocytes by pna-fish

Defekten DNA-Reparatur zu genomischer Instabilität, die die Ursache für Mutationen, die zu Tumorentstehung führen wird erhöht. Analyse der Häufigkeit und Art der Chromosomenaberrationen in verschiedenen Zelltypen ermöglicht Defekte in DNA-Reparaturwege aufgeklärt werden. Verständnis Säugetierbiologie DNA-Reparatur hat sich stark durch die Produktion von Mäusen mit Knockouts in bestimmten Genen geholfen. Das Ziel des Protokolls ist es, genomische Instabilität in Maus-B-Lymphozyten zu quantifizieren. Kennzeichnung der Telomere mit PNA-FISH-Sonden (Peptid-Nukleinsäure - Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung) ermöglicht die schnelle Analyse von genomischen Instabilität in Metaphasechromosom Spreads. B-Zellen haben spezifische Vorteile gegenüber Fibroblasten, weil sie normale Ploidie und eine höhere mitotische Index haben. Kurzzeitkultur von B-Zellen ermöglicht daher eine genaue Messung der genomischen Instabilität in einer primären Zellpopulation, die voraussichtlich weniger Neben genetische Mutation ists als das, was in der Regel in transformierten Fibroblasten oder Patientenzelllinien gefunden.

Metaphase-Chromosomen aus einer Zelle stamm eine diskrete Cluster, die 40 Chromosomen (bei ​​Verwendung von Mauszellen) (1A) zu bilden. Jedes Chromosom hat einen Zentromer an einem Ende, die als Licht blaue Kugel sichtbar ist. Im normalen Chromosomen sind zwei Telomer Signale am Ende der Chromatiden und zwei Signale, die von jedem Romer gesehen. Interphase-Kernen auf der Folie zugegen sein. Diese werden als blaue Kugeln, mit rotem Telomer-Signale, aber keine kondensierten Chromosomen (siehe zum Beis...

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Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

DNA-Reparaturwege sind wichtig für die Erhaltung der genomischen Integrität und Mutation verhindert und Krebs. Das Ziel des Protokolls ist es, genomische Instabilität durch direkte Beobachtung von Chromosomenaberrationen in Metaphase-Spreads Quantifizierung von Maus-B-Zellen unter Verwendung von Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) für Telomer-DNA-Wiederholungen.

Schnelle Analyse von Chromosomenaberrationen in Maus-B-Lymphozyten durch PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Methoden zur Beta Cell Death vermittelt durch zytotoxische T-Lymphozyten Beurteilung

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Isolierung von Lymphozyten aus Maus Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

Schnelle und robuste Analyse Zelluläre und Molekulare Polarisation durch Chemokine Signaling Induced

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

Der Nachweis von IgE-Wahre exprimierenden Maus B Lineage Cells

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

Eine einfache und schnelle Protokoll zum Nicht enzymatisch Dissociate Frische menschlichen Geweben zur Analyse der infiltrierenden Lymphozyten

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Effiziente Isolation Protokoll für die B- und T-Lymphozyten von Menschengaumenmandeln

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Schnelle molekulare Erkennung und Differenzierung von Influenza-Viren A und B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Molekulare Diffusion in Plasmamembranen von primären Lymphozyten mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie gemessen

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Schnelle Quantifizierung von Mitogen-induzierte Blastogenese in T-Lymphozyten zur Identifizierung von immunmodulatorische Drogen

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Isolieren von Lymphozyten aus der Maus kleinen intestinalen Immunsystems

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...