Name: rapid analysis of chromosome aberrations in mouse b lymphocytes by pna-fish
Uploaded: 2014-08-19T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH at JoVE.com

この作品は、NIHの助成金R00 CA160574（SFB）でと（SMM）はラトガースバイオテクノロジートレーニングプログラムの交わりによってサポートされています。

この手順は、ラトガース、ニュージャージー州の州立大学で動物実験委員会によって承認された。マウスは、実験動物の管理と使用に関するNI​​Hガイドに従って処理した。科学者たちは、確立され、承認されたガイドラインについては、彼らの国や機関投資家、動物の組織に相談してください。 開始前に、 表1に列挙溶液を調製する。 ...

<ol>
	<li>Sancar, A., Lindsey-Boltz, L. A., Unsal-Kacmaz, K., Linn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+mammalian+DNA+repair+and+the+DNA+damage+checkpoints.">Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints.</a> Ann Rev Biochem. 73, 39-85 (2004).</li><li>Sperka, T., Wang, J., Rudolph, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+checkpoints+in+stem+cells,+ageing+and+cancer.">DNA damage checkpoints in stem cells, ageing and cancer.</a> Nature reviews Mol Cell Biol. 13 (9), 579-590 (2012).</li><li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer.">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).</li><li>Bunting, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+inhibits+homologous+recombination+in+Brca1-deficient+cells+by+blocking+resection+of+DNA+breaks.">53BP1 inhibits homologous recombination in Brca1-deficient cells by blocking resection of DNA breaks.</a> Cell. 141 (2), 243-254 (2010).</li><li>Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+karyotyping+analysis+of+human+and+mouse+chromosomes.">Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3129-3142 (2006).</li><li>Callen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+IgH-TCRalpha/delta+translocations+in+T+lymphocytes+mediated+by+RAG.">Chimeric IgH-TCRalpha/delta translocations in T lymphocytes mediated by RAG.</a> Cell Cycle. 8 (15), 2408-2412 (2009).</li><li>Boboila, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+end-joining+catalyzes+robust+IgH+locus+deletions+and+translocations+in+the+combined+absence+of+ligase+4+and+Ku70.">Alternative end-joining catalyzes robust IgH locus deletions and translocations in the combined absence of ligase 4 and Ku70.</a> Natl Acad Sci USA. 107 (7), 3034-3039 (2010).</li><li>Benn, P., Delach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lymphocyte+culture+and+chromosome+analysis.">Human lymphocyte culture and chromosome analysis.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).</li><li>Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metaphase+spreads+and+spectral+karyotyping+of+human+embryonic+stem+cells.">Metaphase spreads and spectral karyotyping of human embryonic stem cells.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).</li><li>Schreck, R. R., Disteche, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4.">Chapter 4.</a> Chromosome banding techniques. Unit 2, (2001).</li><li>Gilley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-PKcs+is+critical+for+telomere+capping.">DNA-PKcs is critical for telomere capping.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98 (26), 15084-15088 (2001).</li><li>Bolzan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+aberrations+involving+telomeres+and+interstitial+telomeric+sequences.">Chromosomal aberrations involving telomeres and interstitial telomeric sequences.</a> Mutagenesis. 27 (1), 1-15 (2012).</li><li>Bolzan, A. D., Telomeres Bianchi, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=interstitial+telomeric+repeat+sequences+and+chromosomal+aberrations.">interstitial telomeric repeat sequences and chromosomal aberrations.</a> Mutat Res. 612 (3), 189-214 (2006).</li><li>Poon, S. S., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+18.">Chapter 18.</a> Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Unit 18 14, (2001).</li><li>Morales, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+and+p53+synergize+to+suppress+genomic+instability+and+lymphomagenesis.">53BP1 and p53 synergize to suppress genomic instability and lymphomagenesis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (9), 3310-3315 (2006).</li><li>Halaby, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interaction+of+Rnf8+and+p53+in+the+protection+against+genomic+instability+and+tumorigenesis.">Synergistic interaction of Rnf8 and p53 in the protection against genomic instability and tumorigenesis.</a> PLoS Genet. 9 (1), e1003259 (2013).</li></ol>

一方、活性化Bリンパ球は、他の細胞型も使用することができ、有糸分裂染色体スプレッドの調製に特に適している。 Tリンパ球は脾臓またはリンパ節から精製することができるように、B細胞の利点の多くを共有し、そして適切なマイトジェン8を含む培地中での増殖によって刺激された場合、高い有糸分裂指数を有する。胚性幹細胞（ES細胞）は、中期染色体分析9に適してい?...

癌は、正常な細胞増殖を調節する遺伝子に影響を与える変異の蓄積によって引き起こされる。突然変異は、DNAの損傷によって引き起こされるゲノムの構造および配列の変化の結果である。 DNA損傷は、電離放射線のような外因性の薬剤を含む、プロセスのさまざまなを通して発生し、副生成物などのヌクレオチド塩基または反応性酸素種1との接触によって生じた損傷の自発的脱アミノ化などの通常の細胞代謝のようにすることができる。 哺乳動物の細胞がDNA損傷を逆転またはブレーク·サイトで順序を復元することができ、修復活動の範囲を有するが、変異は、それにもかかわらず、細胞の生涯を通じて蓄積する。 DNA損傷は、さらに、老化および老化関連疾患2に関連付けられた幹細胞を、2つの方法の効力の喪失に寄与することができる。 DNA損傷の修復を理解することは、2の符号に対処する上で、したがって、中央に重要である公衆衛生におけるificant問題。増加する証拠は、哺乳動物のDNA修復経路は、それが一層急務分子レベルでの突然変異の抑制に関与するプロセスを理解すること、癌細胞ゲノム3,4の進化に寄与し得ることを示唆している。 染色体異常の直接可視化は、特定の細胞型においてゲノム不安定性の程度を決定するための強力かつ定量的な手段である。分裂中期の細胞からの凝縮染色体を単離し、光または蛍光顕微鏡を用いて検査することができる。このような細胞遺伝学的アプローチは、数十年間実際にされており、転座またはDNA修復活性の喪失に関連する染色体異常の特定のタイプの外観を示すために使用することができる。プロトコルは、いくつかの潜在的な機能拡張に適しています：染色体は、in situハイブリダイゼーションスペクトル核型分析のためのプローブ（SKY）または多色の蛍光で標識することができる（mFISH）が転座5,6を識別します。これらの技術はまた、染色体転座の頻度と、このプロトコルで可能なものを超えて、追加情報を提供して決定することが、複雑な染色体転座の構造を、有効にします。代替的に、配列特異的なプローブが生成され、選択されたゲノム部位7においてDNA切断の頻度を試験するために用いることができる。 このプロトコルでは、中期染色体の調製は、Bリンパ球から広がる記述する。テロメア反復のための蛍光標識されたペプチド核酸（PNA）プローブを効率的に分裂中期染色体テロメアマークが使用されるが、このプロトコルはいくつかの利点を有する広がる。 B細胞は、高品質のスプレッドは一貫して製造することができるように、高い分裂指数で成長するように誘導することができる。遺伝的に改変されたマウス由来のB細胞は、はるかに少ない寄与度の分析を混乱させる可能な二遺伝的変異を含む可能性が高いゲノムの完全性の特異的な遺伝子。 PNA-FISH法は、1日で完了し、染色体切断のより正確なスコアリングを可能にすることができます。特に、このプロトコルに記載されている特定の装置と組み合わせて、このアプローチを用いることにより、非常に一貫した、高品質のスプレッドを生成し、急速に速度およびゲノム不安定性のタイプを分析することが可能である。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="679">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Name</td>
			<td style="width:116px;">Company&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:176px;">&#160;Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50% Dextran sulfate</td>
			<td>Intergen</td>
			<td>S4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deionized formamide&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pepsin (5g)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 6887&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FCS</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LPS (100mg)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IL-4 (5&#956;g)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PNA Telomere Probe</td>
			<td>PNA Bio Inc</td>
			<td>F1002</td>
			<td>(CCCTAACCCTAACCCTAA)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Colcemid</td>
			<td>Roche</td>
			<td>295892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mowiol 4-88</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>81381-50g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD43 (ly-48_) micro-beads</td>
			<td>Miltenyl Biotec.&#160;</td>
			<td>130-049-801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32670-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eclipse E800</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AxioImager.Z2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber</td>
			<td>Thermotron</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid analysis of chromosome aberrations in mouse b lymphocytes by pna-fish

不良DNA修復は、腫瘍形成につながる変異の根本的な原因であるゲノム不安定性を増加につながる。異なる細胞型における染色体異常の頻度および種類の分析は、DNA修復経路に欠陥を解明することを可能にする。哺乳動物のDNA修復生物学を理解することは、大幅に特定の遺伝子におけるノックアウトとマウスの作製に助けられてきた。このプロトコルの目的は、マウスBリンパ球におけるゲノム不安定性を定量化することである。 PNA-FISHプローブ（ペプチド核酸-蛍光in situハイブリダイゼーション ）を使用してテロメアの標識は、中期染色体スプレッドのゲノム不安定性の迅速な分析を容易にします。彼らは、正常な倍数性及びより高い分裂指数を持っているので、B細胞は、線維芽細胞に対して特有の利点を有する。 B細胞の短期培養は、したがって、より少ない二次遺伝子突然変異を有する可能性がある一次細胞集団におけるゲノム不安定性の正確な測定を可能に一般的に変換された線維芽細胞または患者の細胞株に見られるものより秒。

一つの細胞から誘導された分裂中期染色体は、染色体40（マウス細胞を用いた場合）（ 図1A）を含む別個のクラスタを形成すべきである。各染色体は、水色の球として表示されている、一方の端部に動原体を持っています。正常な染色体では、2つのテロメア信号は、各セントロメアによって染色し、二つの信号の最後に見られる。間期核は同様に、スライド上に存在することに?...

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Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

DNA修復経路は、ゲノムの完全性の維持および変異および癌を予防するために必須である。このプロトコルの目的は、中期の染色体異常の直接観察によりゲノム不安定性を定量化することであるテロメアDNA反復のためのin situハイブリダイゼーション （FISH）、 蛍光を使用して、マウスのB細胞から広がる。

PNA-FISHによるマウスのBリンパ球における染色体異常の迅速分析

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

傷害性Tリンパ球によって媒介ベータ細胞死を評価するための方法

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

マウス生殖管粘膜からのリンパ球の単離

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

ケモカインシグナリングにより誘導される細胞と分子分極の迅速かつ堅牢な分析

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

真のIgE発現するマウスB系統細胞の検出

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

簡単かつ迅速なプロトコル非酵素的に浸潤リンパ球の分析のための新鮮なヒト組織を解離

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

ヒトパラティーノ扁桃腺からBおよびTリンパ球の効率的な単離プロトコール

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

インフルエンザウイルスAおよびBの急速な分子の検出と分化

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

蛍光相関分光法により測定初代リンパ球のプラズマ膜における分子拡散

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

免疫調節薬を同定するためのTリンパ球におけるマイトジェン誘導性の幼若の迅速定量

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

マウス小腸管免疫系からリンパ球を分離すること

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...