Name: rapid analysis of chromosome aberrations in mouse b lymphocytes by pna-fish
Uploaded: 2014-08-19T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH at JoVE.com

Dette arbeidet støttes av NIH stipend R00 CA160574 (SFB) og av et fellesskap av Rutgers Bioteknologi Training Program (til SMM).

Denne prosedyren ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved Rutgers, State University of New Jersey. Mus ble behandlet i henhold til NIH Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr. Forskere bør konsultere sine nasjonale og institusjonelle dyrevernorganisasjoner for etablerte og vedtatte retningslinjer. Før du begynner, forberede de løsningene som er oppført i tabell 1. 1. B celleisolasjon og aktivering <p class="jove_content...

<ol>
	<li>Sancar, A., Lindsey-Boltz, L. A., Unsal-Kacmaz, K., Linn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+mammalian+DNA+repair+and+the+DNA+damage+checkpoints.">Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints.</a> Ann Rev Biochem. 73, 39-85 (2004).</li><li>Sperka, T., Wang, J., Rudolph, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+checkpoints+in+stem+cells,+ageing+and+cancer.">DNA damage checkpoints in stem cells, ageing and cancer.</a> Nature reviews Mol Cell Biol. 13 (9), 579-590 (2012).</li><li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer.">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).</li><li>Bunting, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+inhibits+homologous+recombination+in+Brca1-deficient+cells+by+blocking+resection+of+DNA+breaks.">53BP1 inhibits homologous recombination in Brca1-deficient cells by blocking resection of DNA breaks.</a> Cell. 141 (2), 243-254 (2010).</li><li>Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+karyotyping+analysis+of+human+and+mouse+chromosomes.">Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3129-3142 (2006).</li><li>Callen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+IgH-TCRalpha/delta+translocations+in+T+lymphocytes+mediated+by+RAG.">Chimeric IgH-TCRalpha/delta translocations in T lymphocytes mediated by RAG.</a> Cell Cycle. 8 (15), 2408-2412 (2009).</li><li>Boboila, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+end-joining+catalyzes+robust+IgH+locus+deletions+and+translocations+in+the+combined+absence+of+ligase+4+and+Ku70.">Alternative end-joining catalyzes robust IgH locus deletions and translocations in the combined absence of ligase 4 and Ku70.</a> Natl Acad Sci USA. 107 (7), 3034-3039 (2010).</li><li>Benn, P., Delach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lymphocyte+culture+and+chromosome+analysis.">Human lymphocyte culture and chromosome analysis.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).</li><li>Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metaphase+spreads+and+spectral+karyotyping+of+human+embryonic+stem+cells.">Metaphase spreads and spectral karyotyping of human embryonic stem cells.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).</li><li>Schreck, R. R., Disteche, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4.">Chapter 4.</a> Chromosome banding techniques. Unit 2, (2001).</li><li>Gilley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-PKcs+is+critical+for+telomere+capping.">DNA-PKcs is critical for telomere capping.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98 (26), 15084-15088 (2001).</li><li>Bolzan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+aberrations+involving+telomeres+and+interstitial+telomeric+sequences.">Chromosomal aberrations involving telomeres and interstitial telomeric sequences.</a> Mutagenesis. 27 (1), 1-15 (2012).</li><li>Bolzan, A. D., Telomeres Bianchi, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=interstitial+telomeric+repeat+sequences+and+chromosomal+aberrations.">interstitial telomeric repeat sequences and chromosomal aberrations.</a> Mutat Res. 612 (3), 189-214 (2006).</li><li>Poon, S. S., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+18.">Chapter 18.</a> Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Unit 18 14, (2001).</li><li>Morales, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+and+p53+synergize+to+suppress+genomic+instability+and+lymphomagenesis.">53BP1 and p53 synergize to suppress genomic instability and lymphomagenesis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (9), 3310-3315 (2006).</li><li>Halaby, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interaction+of+Rnf8+and+p53+in+the+protection+against+genomic+instability+and+tumorigenesis.">Synergistic interaction of Rnf8 and p53 in the protection against genomic instability and tumorigenesis.</a> PLoS Genet. 9 (1), e1003259 (2013).</li></ol>

Mens aktiverte B-lymfocytter er spesielt egnet til fremstilling av mitotiske kromosom sprer seg, kan andre celletyper kan også brukes. T-lymfocytter har mange av fordelene til B-celler, som de kan bli renset fra milt eller lymfeknuter, og har en høy mitotisk indeks ved stimulering av vekst i medium inneholdende egnede mitogener 8. Embryonale stamceller (ES-celler) er også egnet for metakromosomanalyse 9. Dersom disse ikke er tilgjengelige, kan fibroblastceller brukes, selv om en lengre behandlin...

Kreft er forårsaket av akkumulering av mutasjoner som påvirker gener som regulerer normal cellevekst. Mutasjon er en konsekvens av endringer i strukturen og sekvensen av genomet forårsaket av skade på DNA. DNA-skade kan forekomme gjennom en rekke prosess, inkludert eksogene midler slik som ioniserende stråling, og som et biprodukt av normal cellulær metabolisme, slik som spontan deaminering av nukleotid-basene eller skader som oppstår ved kontakt med reaktive oksygenforbindelser en. Selv om pattedyrceller har en rekke reparasjonsvirksomhet som kan reversere DNA skade eller gjenopprette sekvensen ved bruddsteder, mutasjoner likevel akkumuleres i løpet av levetiden til en celle. DNA-skade kan videre bidra til å senescens og tap av potens av stamceller, to prosesser som er forbundet med aldring-assosiert sykdom 2. Forstå reparasjon av DNA-skader er derfor av sentral betydning i møte to significant problemstillinger i folkehelsen. Økende bevis tyder på at pattedyr DNA-reparasjonsbaner kan bidra til utviklingen av kreftcellen genomet 3,4, noe som gjør det enda mer viktig å forstå prosessene som er involvert i å undertrykke mutasjon på molekylært nivå. Direkte synliggjøring av kromosomale aberrasjoner er en kraftig og kvantitative middel for å bestemme omfanget av genomisk instabilitet i en bestemt celletype. Kondenserte kromosomer fra celler i metafase kan isoleres og inspiseres ved hjelp av lys eller fluoriserende mikroskopi. Slike cytogenetisk tilnærminger har vært praktisert i flere tiår, og kan brukes til å påvise forekomsten av translokasjoner eller bestemte typer av kromosomforstyrrelser assosiert med tap av DNA-reparasjonsvirksomhet. Protokollen gir seg til flere potensielle utvidelser: kromosomer kan merkes med prober for spektral karyotyping (SKY) eller flerfarget fluorescerende in situ hybridisering(MFISH) for å identifisere trans 5,6. Disse teknikkene også aktivere hyppigheten av kromosomtranslokasjoner og strukturen i komplekse kromosomtranslokasjoner som skal bestemmes, noe som gir ytterligere informasjon utover det som er mulig med denne protokollen. Alternativt, kan sekvensspesifikke prober bli generert og anvendt for å teste forekomsten av DNA-brudd ved utvalgte genomiske områder 7. I denne protokollen beskriver vi utarbeidelse av meta kromosom sprer seg fra B-lymfocytter. En fluorescensmerket-merkede peptid-nukleinsyre (PNA) probe for telomeric gjentakelser er brukt, noe som effektivt markerer telomerer i metafase-kromosomer sprer Denne protokollen har flere fordeler. B-celler kan induseres til å vokse på høy mitotisk indeks, slik at høy-kvalitets sprer konsekvent kan bli produsert. B-celler fra genmodifiserte mus er også mye mindre sannsynlighet for å inneholde sekundære genetiske mutasjoner som kan skamme analysen av bidragetav spesifikke gener til genomisk integritet. PNA-FISH tilnærming kan gjennomføres på en dag, og tillater mer nøyaktig scoring av kromosom pauser. Ved å bruke denne metoden, spesielt i kombinasjon med spesielle utstyr som er beskrevet i denne protokollen, er det mulig å fremstille meget jevn og høy kvalitet og sprer seg raskt å analysere frekvensen og typen av genomisk instabilitet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="679">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Name</td>
			<td style="width:116px;">Company&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:176px;">&#160;Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50% Dextran sulfate</td>
			<td>Intergen</td>
			<td>S4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deionized formamide&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pepsin (5g)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 6887&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FCS</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LPS (100mg)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IL-4 (5&#956;g)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PNA Telomere Probe</td>
			<td>PNA Bio Inc</td>
			<td>F1002</td>
			<td>(CCCTAACCCTAACCCTAA)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Colcemid</td>
			<td>Roche</td>
			<td>295892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mowiol 4-88</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>81381-50g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD43 (ly-48_) micro-beads</td>
			<td>Miltenyl Biotec.&#160;</td>
			<td>130-049-801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32670-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eclipse E800</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AxioImager.Z2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber</td>
			<td>Thermotron</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid analysis of chromosome aberrations in mouse b lymphocytes by pna-fish

Defekt DNA-reparasjon fører til økt genomisk ustabilitet, som er roten årsaken til mutasjoner som fører til tumorigenesis. Analyse av frekvensen og typen av kromosomale aberrasjoner i forskjellige celletyper gjør det mulig defekter i DNA-reparasjonsbaner som skal belyses. Forståelse pattedyr DNA-reparasjon biologi har vært sterkt hjulpet av produksjonen av mus med knockouts i bestemte gener. Målet med denne protokollen er å kvantifisere genomisk ustabilitet i mus B-lymfocytter. Merking av telomerer bruker PNA-FISH prober (peptid nukleinsyre - fluorescerende in situ hybridisering) forenkler rask analyse av genomisk ustabilitet i metafase kromosommarginer. B-celler har bestemte fordeler i forhold til fibroblaster, fordi de har normalt ploiditet og en høyere mitotiske indeksen. Kortsiktig kultur av B-celler gjør derfor nøyaktig måling av genomisk ustabilitet i en primær cellepopulasjon som er sannsynlig å ha færre sekundære genetisk mutasjons enn det som typisk finnes i transformerte fibroblaster eller pasientcellelinjer.

Metafasekromosomer avledet fra en celle bør danne en diskret klynge inneholdende 40 kromosomer (ved bruk av museceller) (figur 1A). Hver kromosom har en cent i den ene enden, som er synlig som en lys blå kule. I normale kromosomer, er to telomere signaler sett på slutten av kromatider og to signaler ved hver cent. Fase kjerner vil være til stede på lysbildet også. Disse vil være synlig som blå kuler, med røde telomere signaler, men ingen kondenserte kromosomer (se for eksempel figur 1B)...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH at JoVE.com

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

DNA-reparasjonsbaner er avgjørende for opprettholdelse av genomisk integritet og hindre mutasjon og kreft. Målet med denne protokollen er å kvantifisere genomisk ustabilitet ved direkte observasjon av kromosomavvik i metafase sprer seg fra mus B-celler ved hjelp av fluorescerende in situ hybridisering (FISH) for telomeric DNA gjentar.

Rapid Analyse av kromosomavvik i Mouse B-lymfocytter ved PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Isolering av Lymfocytter fra Mouse kjønnsorgan Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

Rask og Robust Analyse av celle- og molekylær Polarisering indusert av kjemokinet Signa

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

Påvisning av True IgE-uttrykke Mouse B Lineage Cells

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

En enkel og Rapid-protokollen til ikke-enzymatisk distansere Ferske menneskelig vev for analyse av infiltrerende Lymfocytter

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Effektiv Isolasjon Protokoll for B og T-lymfocytter fra Menneskerettighets Palatine Mandlene

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Rapid Molecular Detection og Differensiering av influensavirus A og B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Molekylær diffusjon i plasmamembraner Primære lymfocytter målt ved fluorescens korrelasjon spektroskopi

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Rapid Kvantifisering av Mitogen-indusert blastogenese i T-lymfocytter for Identifisere Immunmodulerende legemidler

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Isolere lymfocytter fra musen liten Intestinal immunsystemet

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...