Name: rapid analysis of chromosome aberrations in mouse b lymphocytes by pna-fish
Uploaded: 2014-08-19T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH at JoVE.com

Este trabalho é apoiado pelo NIH conceder R00 CA160574 (SFB) e por uma bolsa do Programa de Formação Biotecnologia Rutgers (a SMM).

Este procedimento foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso Animal Institucional da Universidade Rutgers, a Universidade Estadual de Nova Jersey. Ratos foram tratados de acordo com o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Os cientistas devem consultar as suas organizações nacionais de animais, e institucionais para as diretrizes estabelecidas e aprovadas. Antes de começar, preparar as soluções listadas na Tabela 1. 1. B...

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	<li>Sancar, A., Lindsey-Boltz, L. A., Unsal-Kacmaz, K., Linn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+mammalian+DNA+repair+and+the+DNA+damage+checkpoints.">Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints.</a> Ann Rev Biochem. 73, 39-85 (2004).</li><li>Sperka, T., Wang, J., Rudolph, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+checkpoints+in+stem+cells,+ageing+and+cancer.">DNA damage checkpoints in stem cells, ageing and cancer.</a> Nature reviews Mol Cell Biol. 13 (9), 579-590 (2012).</li><li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer.">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).</li><li>Bunting, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+inhibits+homologous+recombination+in+Brca1-deficient+cells+by+blocking+resection+of+DNA+breaks.">53BP1 inhibits homologous recombination in Brca1-deficient cells by blocking resection of DNA breaks.</a> Cell. 141 (2), 243-254 (2010).</li><li>Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+karyotyping+analysis+of+human+and+mouse+chromosomes.">Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3129-3142 (2006).</li><li>Callen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+IgH-TCRalpha/delta+translocations+in+T+lymphocytes+mediated+by+RAG.">Chimeric IgH-TCRalpha/delta translocations in T lymphocytes mediated by RAG.</a> Cell Cycle. 8 (15), 2408-2412 (2009).</li><li>Boboila, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+end-joining+catalyzes+robust+IgH+locus+deletions+and+translocations+in+the+combined+absence+of+ligase+4+and+Ku70.">Alternative end-joining catalyzes robust IgH locus deletions and translocations in the combined absence of ligase 4 and Ku70.</a> Natl Acad Sci USA. 107 (7), 3034-3039 (2010).</li><li>Benn, P., Delach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lymphocyte+culture+and+chromosome+analysis.">Human lymphocyte culture and chromosome analysis.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).</li><li>Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metaphase+spreads+and+spectral+karyotyping+of+human+embryonic+stem+cells.">Metaphase spreads and spectral karyotyping of human embryonic stem cells.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).</li><li>Schreck, R. R., Disteche, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4.">Chapter 4.</a> Chromosome banding techniques. Unit 2, (2001).</li><li>Gilley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-PKcs+is+critical+for+telomere+capping.">DNA-PKcs is critical for telomere capping.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98 (26), 15084-15088 (2001).</li><li>Bolzan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+aberrations+involving+telomeres+and+interstitial+telomeric+sequences.">Chromosomal aberrations involving telomeres and interstitial telomeric sequences.</a> Mutagenesis. 27 (1), 1-15 (2012).</li><li>Bolzan, A. D., Telomeres Bianchi, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=interstitial+telomeric+repeat+sequences+and+chromosomal+aberrations.">interstitial telomeric repeat sequences and chromosomal aberrations.</a> Mutat Res. 612 (3), 189-214 (2006).</li><li>Poon, S. S., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+18.">Chapter 18.</a> Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Unit 18 14, (2001).</li><li>Morales, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+and+p53+synergize+to+suppress+genomic+instability+and+lymphomagenesis.">53BP1 and p53 synergize to suppress genomic instability and lymphomagenesis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (9), 3310-3315 (2006).</li><li>Halaby, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interaction+of+Rnf8+and+p53+in+the+protection+against+genomic+instability+and+tumorigenesis.">Synergistic interaction of Rnf8 and p53 in the protection against genomic instability and tumorigenesis.</a> PLoS Genet. 9 (1), e1003259 (2013).</li></ol>

Considerando que os linfócitos B activados são particularmente adequados para a preparação de barrar cromossómicas mitóticas, outros tipos de células podem também ser utilizados. Linfócitos T partilhar muitas das vantagens de células B, uma vez que podem ser purificadas a partir dos gânglios linfáticos ou do baço, e têm um elevado índice mitótico, quando estimulada por crescimento em meio contendo mitogénios adequadas 8. As células-tronco embrionárias (células ES) também são adequados pa...

O cancro é causado pela acumulação de mutações que afectam os genes que regulam o crescimento de células normais. A mutação é uma conseqüência de alterações na estrutura e seqüência do genoma causada por danos ao DNA. Danos do ADN pode ocorrer através de uma variedade de processos, incluindo agentes exógenos, tais como radiação ionizante e, como um subproduto do metabolismo celular normal, tal como a desaminação espontânea de bases de nucleótidos que ocorram danos ou por contacto com espécies de oxigénio reactivas 1. Embora as células de mamíferos possuem uma gama de actividades de reparação, que pode reverter danos ao DNA ou restaurar a seqüência em locais de quebra, no entanto, mutações se acumulam ao longo do tempo de vida de uma célula. Danos de DNA pode, além disso, contribuir para a senescência e a perda de potência de células-tronco, dois processos que estão associados com a doença associada ao envelhecimento 2. Compreender a reparação de danos ao DNA é, portanto, de importância central na abordagem de dois sinalquestões ificant em saúde pública. Uma evidência crescente sugere que as vias de reparação do ADN de mamíferos pode contribuir para a evolução do genoma de células de cancro de 3,4, o que torna ainda mais fundamental para compreender os processos envolvidos na supressão da mutação a nível molecular. A visualização direta de aberrações cromossômicas é um meio poderoso e quantitativos de determinar a extensão da instabilidade genômica em um tipo particular de célula. Cromossomos condensados ​​de células em metáfase pode ser isolado e inspecionados utilizando luz ou microscopia fluorescente. Tais abordagens citogenéticas têm sido, na prática há várias décadas e pode ser utilizado para demonstrar a aparência de translocação ou de determinados tipos de aberrações cromossómicas relacionadas com a perda de actividade de reparação de ADN. O protocolo presta-se a várias extensões possíveis: os cromossomas podem ser marcadas com sondas para cariotipagem espectral (CÉU) ou multicolor hibridização in situ fluorescente(MFISH) para identificar translocações 5,6. Essas técnicas também permitem a frequência de translocações cromossômicas ea estrutura de translocações cromossômicas complexas para ser determinada, que fornece informações adicionais para além do que é possível com este protocolo. Alternativamente, as sondas específicas para a sequência pode ser gerada e utilizada para testar a frequência de quebra de ADN em locais genómicos seleccionados 7. Neste protocolo, descrevemos a preparação do cromossomo metaphase espalha a partir de linfócitos B. Um ácido nucleico (PNA) péptido sonda fluorescente marcada por repetições teloméricas é utilizado, de forma eficiente, que marca telómeros em cromossomas da metafase espalha Este protocolo tem várias vantagens. As células B podem ser induzidas a crescer em alto índice mitótico de modo que os diferenciais de alta qualidade pode ser produzido de forma consistente. Células B de camundongos geneticamente modificados também são muito menos propensos a conter mutações genéticas secundárias que podem confundir a análise da contribuiçãode genes específicos para a integridade genómica. A abordagem PNA-FISH pode ser concluído em um dia, e permite marcar mais precisa de quebras cromossômicas. Usando essa abordagem, particularmente em combinação com equipamento específico descrito no presente protocolo, é possível produzir muito consistentes, spreads de alta qualidade e analisar rapidamente a taxa eo tipo de instabilidade genômica.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="679">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Name</td>
			<td style="width:116px;">Company&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:176px;">&#160;Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50% Dextran sulfate</td>
			<td>Intergen</td>
			<td>S4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deionized formamide&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pepsin (5g)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 6887&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FCS</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LPS (100mg)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IL-4 (5&#956;g)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PNA Telomere Probe</td>
			<td>PNA Bio Inc</td>
			<td>F1002</td>
			<td>(CCCTAACCCTAACCCTAA)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Colcemid</td>
			<td>Roche</td>
			<td>295892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mowiol 4-88</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>81381-50g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD43 (ly-48_) micro-beads</td>
			<td>Miltenyl Biotec.&#160;</td>
			<td>130-049-801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32670-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eclipse E800</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AxioImager.Z2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber</td>
			<td>Thermotron</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid analysis of chromosome aberrations in mouse b lymphocytes by pna-fish

Reparo do DNA defeituoso leva ao aumento da instabilidade genômica, que é a causa de mutações que levam à tumorigênese. A análise da frequência e tipo de aberrações cromossômicas em diferentes tipos de células permite defeitos nas vias de reparo de DNA a ser elucidado. Biologia de reparo do DNA em mamíferos Entendimento foi muito ajudado pela produção de camundongos com nocautes em genes específicos. O objetivo deste protocolo é quantificar instabilidade genômica em linfócitos B de ratinho. Rotulagem dos telômeros, utilizando sondas PNA-FISH (ácido nucleico peptídico - hibridização in situ fluorescente) facilita a análise rápida de instabilidade genômica dos spreads metáfase de cromossomos. As células B têm vantagens específicas em relação a fibroblastos, porque eles têm ploidia normal e um índice mitótico elevado. Cultura de curto prazo das células B, portanto, permite a medição precisa da instabilidade genômica em uma população celular primária que é susceptível de ter menos mutação genética secundários do que o que é normalmente encontrado em fibroblastos transformados ou linhas celulares de doentes.

Cromossomos metafásicos derivadas de uma célula devem formar um conjunto discreto contendo 40 cromossomos (se estiver usando células de camundongo) (Figura 1A). Cada cromossoma tem um centrómero em uma extremidade, que é visível como uma esfera de luz azul. Em cromossomos normais, dois sinais dos telômeros são vistos no fim das cromátides e dois sinais de cada centrômero. Os núcleos interfásicos vai estar presente na lâmina bem. Estes serão visíveis como esferas azuis, com os sinais dos t...

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Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Vias de reparo de DNA são essenciais para a manutenção da integridade genômica e mutação prevenção e câncer. O objetivo deste protocolo é quantificar instabilidade genômica por observação direta de aberrações cromossômicas em metáfase se espalha a partir de células de rato B usando hibridização in situ fluorescente (FISH) para repetições de DNA telomérico.

Rápida análise de aberrações cromossômicas em linfócitos B mouse por PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Métodos para avaliar Mediated Beta Morte celular por linfócitos T citotóxicos

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Imunologia e Infecção

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

O isolamento de linfócitos de rato Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

Análise rápida e robusta de Celular e Molecular Polarização Induzida por Chemokine Signaling

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

Detecção de True IgE-expressando Rato B células da linhagem

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

Um protocolo simples e rápido para não enzimática Separar frescos Tecidos Humanos para a Análise de infiltrar Linfócitos

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Protocolo de isolamento eficiente para linfócitos B e T a partir de tonsilas palatinas Humanos

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Rápida Detecção Molecular e diferenciação de Influenza vírus A e B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Difusão molecular em membranas plasmáticas de linfócitos primários medida por fluorescência Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Quantificação rápida de blastogénese induzida por Mitogénio em linfócitos T para identificar drogas imunomoduladoras

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Isolando os linfócitos de rato pequeno Intestinal sistema imunológico

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...