Name: rapid analysis of chromosome aberrations in mouse b lymphocytes by pna-fish
Uploaded: 2014-08-19T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH at JoVE.com

Эта работа поддерживается NIH грант R00 CA160574 (SFB) и с помощью общения Программы Рутгерса биотехнологии подготовки (к SMM).

Эта процедура была утверждена уходу и использованию комитета Институциональная животных при университете Ратджерса, Государственного университета Нью-Джерси на. Мышей обрабатывали в соответствии с Руководством по NIH по уходу и использованию лабораторных животных. Ученые должны кон?...

<ol>
	<li>Sancar, A., Lindsey-Boltz, L. A., Unsal-Kacmaz, K., Linn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+mammalian+DNA+repair+and+the+DNA+damage+checkpoints.">Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints.</a> Ann Rev Biochem. 73, 39-85 (2004).</li><li>Sperka, T., Wang, J., Rudolph, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+checkpoints+in+stem+cells,+ageing+and+cancer.">DNA damage checkpoints in stem cells, ageing and cancer.</a> Nature reviews Mol Cell Biol. 13 (9), 579-590 (2012).</li><li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer.">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).</li><li>Bunting, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+inhibits+homologous+recombination+in+Brca1-deficient+cells+by+blocking+resection+of+DNA+breaks.">53BP1 inhibits homologous recombination in Brca1-deficient cells by blocking resection of DNA breaks.</a> Cell. 141 (2), 243-254 (2010).</li><li>Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+karyotyping+analysis+of+human+and+mouse+chromosomes.">Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3129-3142 (2006).</li><li>Callen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+IgH-TCRalpha/delta+translocations+in+T+lymphocytes+mediated+by+RAG.">Chimeric IgH-TCRalpha/delta translocations in T lymphocytes mediated by RAG.</a> Cell Cycle. 8 (15), 2408-2412 (2009).</li><li>Boboila, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+end-joining+catalyzes+robust+IgH+locus+deletions+and+translocations+in+the+combined+absence+of+ligase+4+and+Ku70.">Alternative end-joining catalyzes robust IgH locus deletions and translocations in the combined absence of ligase 4 and Ku70.</a> Natl Acad Sci USA. 107 (7), 3034-3039 (2010).</li><li>Benn, P., Delach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lymphocyte+culture+and+chromosome+analysis.">Human lymphocyte culture and chromosome analysis.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).</li><li>Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metaphase+spreads+and+spectral+karyotyping+of+human+embryonic+stem+cells.">Metaphase spreads and spectral karyotyping of human embryonic stem cells.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).</li><li>Schreck, R. R., Disteche, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4.">Chapter 4.</a> Chromosome banding techniques. Unit 2, (2001).</li><li>Gilley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-PKcs+is+critical+for+telomere+capping.">DNA-PKcs is critical for telomere capping.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98 (26), 15084-15088 (2001).</li><li>Bolzan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+aberrations+involving+telomeres+and+interstitial+telomeric+sequences.">Chromosomal aberrations involving telomeres and interstitial telomeric sequences.</a> Mutagenesis. 27 (1), 1-15 (2012).</li><li>Bolzan, A. D., Telomeres Bianchi, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=interstitial+telomeric+repeat+sequences+and+chromosomal+aberrations.">interstitial telomeric repeat sequences and chromosomal aberrations.</a> Mutat Res. 612 (3), 189-214 (2006).</li><li>Poon, S. S., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+18.">Chapter 18.</a> Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Unit 18 14, (2001).</li><li>Morales, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+and+p53+synergize+to+suppress+genomic+instability+and+lymphomagenesis.">53BP1 and p53 synergize to suppress genomic instability and lymphomagenesis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (9), 3310-3315 (2006).</li><li>Halaby, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interaction+of+Rnf8+and+p53+in+the+protection+against+genomic+instability+and+tumorigenesis.">Synergistic interaction of Rnf8 and p53 in the protection against genomic instability and tumorigenesis.</a> PLoS Genet. 9 (1), e1003259 (2013).</li></ol>

В то время как активированные лимфоциты особенно подходит для приготовления митотических хромосом спредов, другие типы клеток, также могут быть использованы. Т-лимфоциты имеют много преимуществ В-клеток, так как они могут быть очищены из селезенки или лимфатических узлов, а также имею...

Рак вызывается к накоплению мутаций, влияющих на гены, которые регулируют нормальный рост клеток. Мутация является следствием изменений в структуре и последовательности генома, связанная с повреждением ДНК. Повреждение ДНК может происходить с помощью различных процессов, в том числе экзогенных агентов, таких как ионизирующее излучение, и в качестве побочного продукта нормального клеточного метаболизма, такие как спонтанного дезаминирования нуклеотидных оснований или повреждений, возникающих при контакте с активными формами кислорода 1. Хотя клетки млекопитающих обладают ряд мероприятий по ремонту, которые могут повернуть вспять повреждение ДНК или восстановить последовательность в местах разрыва, мутации, тем не менее накапливаются в течение всей жизни клетки. Повреждение ДНК может, кроме того, способствуют старению и потере активности стволовых клеток, два процесса, которые связаны с старение-ассоциированных заболеваний 2. Понимание ремонт повреждения ДНК, таким образом, решающее значение в решении две знакificant вопросы в области общественного здравоохранения. Увеличение данные свидетельствуют о том, что млекопитающих пути репарации ДНК может способствовать эволюции раковых клеток геном 3,4, что делает его еще более важно для понимания процессов, участвующих в подавлении мутации на молекулярном уровне. Прямая визуализация хромосомных аберраций является мощным и количественные средства определения степени геномной нестабильности в конкретном типе клеток. Сокращенные хромосомы клеток в метафазе, могут быть выделены и проверены с помощью света или флуоресцентной микроскопии. Такие подходы цитогенетических был на практике в течение нескольких десятилетий и может быть использован, чтобы продемонстрировать внешний вид транслокаций или конкретных видов хромосомных аберраций, связанных с потерей репарации ДНК деятельности. Протокол поддается нескольких потенциальных расширений: хромосомы могут быть помечены зондов для спектрального кариотипирование (SKY) или многоцветной флуоресцентной гибридизации на месте(MFISH) для выявления транслокации 5,6. Эти методы также позволяют частоту хромосомных транслокаций и структуры сложных хромосомных транслокаций, которые будут определены, что обеспечивает дополнительную информацию сверх того, что можно с этим протоколом. Кроме того, последовательность конкретных зонды могут быть получены и использованы для тестирования частоты разрыва ДНК в отдельных геномных сайтов 7. В этом протоколе, мы опишем приготовление метафазных хромосом распространяется от В-лимфоцитов. Флуоресцентно-меченного пептида нуклеиновой кислоты (ПНК) зонд для теломерных повторов используется, которые эффективно отмечает теломеры в метафазе хромосомы распространяется Этот протокол имеет несколько преимуществ. В-клетки могут быть индуцированы расти при высокой митотический индекс, так что высококачественные спреды последовательно, может быть получено. В-клетки генетически модифицированных мышей, также гораздо реже содержат вторичные генетические мутации, которые могут посрамить анализ вкладаспецифических генов в геномной целостности. Подход PNA-FISH может быть завершена в течение одного дня, и позволяет более точно озвучивание разрывы хромосом. Используя этот подход, особенно в сочетании с конкретного оборудования, описанного в этом протоколе, можно производить очень последовательные, высококачественные спреды и быстро анализировать частоту и тип геномной нестабильности.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="679">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Name</td>
			<td style="width:116px;">Company&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:176px;">&#160;Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50% Dextran sulfate</td>
			<td>Intergen</td>
			<td>S4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deionized formamide&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pepsin (5g)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 6887&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FCS</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LPS (100mg)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IL-4 (5&#956;g)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PNA Telomere Probe</td>
			<td>PNA Bio Inc</td>
			<td>F1002</td>
			<td>(CCCTAACCCTAACCCTAA)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Colcemid</td>
			<td>Roche</td>
			<td>295892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mowiol 4-88</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>81381-50g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD43 (ly-48_) micro-beads</td>
			<td>Miltenyl Biotec.&#160;</td>
			<td>130-049-801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32670-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eclipse E800</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AxioImager.Z2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber</td>
			<td>Thermotron</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid analysis of chromosome aberrations in mouse b lymphocytes by pna-fish

Неисправный репарации ДНК приводит к увеличению нестабильности генома, которая является причиной мутаций, которые приводят к туморогенеза. Анализ частоты и типа хромосомных аберраций в клетках различных типов позволяет дефекты восстановления повреждений ДНК не выяснены. Понимание млекопитающих репарации ДНК биология была очень помог производства мышей с нокаутом в специфических генов. Цель этого протокола заключается в количественном геномной нестабильности в мышь-лимфоцитов. Маркировка теломер с использованием PNA-FISH зондов (пептид нуклеиновых кислот - флуоресцентные в гибридизация) способствует быстрому анализ геномной нестабильности в спредов метафазных хромосом. В-клетки имеют определенные преимущества по сравнению с фибробластами, потому что они имеют нормальную плоидности и более высокий митотический индекс. Краткосрочная культура клеток, следовательно, позволяет точное измерение геномной нестабильности в первичной клеточной популяции, которая, вероятно, имеют меньше вторичного генетическую мутациюс чем то, что, как правило, находится в трансформированных фибробластов линии клеток или пациента.

Метафазных хромосом, полученных от одной клетки должны образуют дискретный кластер, содержащий 40 хромосом (при использовании клетки мыши) (Рисунок 1А). Каждая хромосома имеет центромеры на одном конце, которая видна в виде светло-голубой шар. В нормальных хромосом, две теломер ?...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH at JoVE.com

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Восстановления повреждений ДНК имеют важное значение для поддержания геномной целостности и предотвращения мутации и рак. Цель этого протокола заключается в количественном нестабильность генома путем прямого наблюдения хромосомных аберраций в метафазных из В-клеток мыши, используя флуоресцентные в гибридизация (FISH) для повторов теломер ДНК.

Быстрое Анализ хромосомных аберраций в Mouse-лимфоцитов на PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Методы оценки бета опосредованная гибель клеток от цитотоксических Т-лимфоцитов

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Выделение лимфоцитов из половых путей мышь Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

Быстрая и надежная Анализ клеточной и молекулярной поляризации, индуцированной хемокинового сигнализации

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

Обнаружение Истинного IgE-выражения мышь B Lineage клеток

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

Простой и быстрый протокол к неферментативно Диссоциируют Свежие тканей человека для анализа разведку в лимфоцитах

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Эффективное протокол Изоляция для B и Т-лимфоциты из небных миндалин человека

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Быстрое Молекулярная Обнаружение и дифференциация вирусов гриппа А и В

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Молекулярная диффузия в плазматических мембранах первичных лимфоцитах Измеренные с помощью флуоресцентной корреляционной спектроскопии

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Быстрое Количественное митоген-индуцированной бластогенеза в Т-лимфоцитах для идентификации иммуномодулирующих препаратов

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Изоляция лимфоциты от мыши небольшой кишечной иммунной системы

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...