Name: rapid analysis of chromosome aberrations in mouse b lymphocytes by pna-fish
Uploaded: 2014-08-19T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH at JoVE.com

Bu çalışma NIH hibe R00 CA160574 (SFB) tarafından ve (SMM için) Rutgers Biyoteknoloji Eğitim Programı bursu ile desteklenmektedir.

Bu prosedür Rutgers Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu, New Jersey Eyalet Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Fareler Laboratuvar Hayvanları Bakımı ve Kullanımı için NIH Kılavuzu&#39;na uygun olarak tedavi edildi. Bilim adamları kurulan ve onaylanmış kılavuzlar için ulusal ve kurumsal hayvan kuruluşlara danışılması gerekir. Başlamadan önce, Tablo 1&#39;de listelenen çözümleri hazırlamak. 1. B Hücre İzolasyo...

<ol>
	<li>Sancar, A., Lindsey-Boltz, L. A., Unsal-Kacmaz, K., Linn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+mammalian+DNA+repair+and+the+DNA+damage+checkpoints.">Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints.</a> Ann Rev Biochem. 73, 39-85 (2004).</li><li>Sperka, T., Wang, J., Rudolph, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+checkpoints+in+stem+cells,+ageing+and+cancer.">DNA damage checkpoints in stem cells, ageing and cancer.</a> Nature reviews Mol Cell Biol. 13 (9), 579-590 (2012).</li><li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer.">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).</li><li>Bunting, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+inhibits+homologous+recombination+in+Brca1-deficient+cells+by+blocking+resection+of+DNA+breaks.">53BP1 inhibits homologous recombination in Brca1-deficient cells by blocking resection of DNA breaks.</a> Cell. 141 (2), 243-254 (2010).</li><li>Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+karyotyping+analysis+of+human+and+mouse+chromosomes.">Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3129-3142 (2006).</li><li>Callen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+IgH-TCRalpha/delta+translocations+in+T+lymphocytes+mediated+by+RAG.">Chimeric IgH-TCRalpha/delta translocations in T lymphocytes mediated by RAG.</a> Cell Cycle. 8 (15), 2408-2412 (2009).</li><li>Boboila, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+end-joining+catalyzes+robust+IgH+locus+deletions+and+translocations+in+the+combined+absence+of+ligase+4+and+Ku70.">Alternative end-joining catalyzes robust IgH locus deletions and translocations in the combined absence of ligase 4 and Ku70.</a> Natl Acad Sci USA. 107 (7), 3034-3039 (2010).</li><li>Benn, P., Delach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lymphocyte+culture+and+chromosome+analysis.">Human lymphocyte culture and chromosome analysis.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).</li><li>Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metaphase+spreads+and+spectral+karyotyping+of+human+embryonic+stem+cells.">Metaphase spreads and spectral karyotyping of human embryonic stem cells.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).</li><li>Schreck, R. R., Disteche, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4.">Chapter 4.</a> Chromosome banding techniques. Unit 2, (2001).</li><li>Gilley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-PKcs+is+critical+for+telomere+capping.">DNA-PKcs is critical for telomere capping.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98 (26), 15084-15088 (2001).</li><li>Bolzan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+aberrations+involving+telomeres+and+interstitial+telomeric+sequences.">Chromosomal aberrations involving telomeres and interstitial telomeric sequences.</a> Mutagenesis. 27 (1), 1-15 (2012).</li><li>Bolzan, A. D., Telomeres Bianchi, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=interstitial+telomeric+repeat+sequences+and+chromosomal+aberrations.">interstitial telomeric repeat sequences and chromosomal aberrations.</a> Mutat Res. 612 (3), 189-214 (2006).</li><li>Poon, S. S., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+18.">Chapter 18.</a> Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Unit 18 14, (2001).</li><li>Morales, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+and+p53+synergize+to+suppress+genomic+instability+and+lymphomagenesis.">53BP1 and p53 synergize to suppress genomic instability and lymphomagenesis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (9), 3310-3315 (2006).</li><li>Halaby, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interaction+of+Rnf8+and+p53+in+the+protection+against+genomic+instability+and+tumorigenesis.">Synergistic interaction of Rnf8 and p53 in the protection against genomic instability and tumorigenesis.</a> PLoS Genet. 9 (1), e1003259 (2013).</li></ol>

Aktifleşmiş B lenfositleri, özellikle mitotik kromozom sürülen hazırlamaya uygun olan ise, diğer hücre tipleri de kullanılabilir. T lenfositleri de dalak veya lemf nodlarından saflaştırılabilir gibi, B hücrelerinin avantajları çok paylaşan ve uygun mitojenler 8 ihtiva eden ortam içinde büyüme ile uyarıldıkları zaman, yüksek bir mitotik indeksli sahiptir. Embriyonik Kök hücreler (ES hücreleri) de metafaz kromozom analizi 9 için uygundur. Bu mevcut değilse, colcemid ile d...

Kanser, normal hücre gelişimini düzenleyen genlerin etkileyen mutasyonların birikmesine neden olur. Mutasyon DNA&#39;ya hasar görmesinden kaynaklanır genomunun yapısı ve sekansına değişikliklerin bir sonucudur. DNA hasarı örneğin iyonize edici radyasyon gibi, ekzojen maddeler de dahil olmak üzere, çeşitli işlem vasıtasıyla ortaya çıkabilir ve reaktif oksijen türleri 1 ile temas ile oluşan nükleotid baz veya hasar spontan deaminasyonu gibi normal hücresel metabolizma, bir yan ürün olarak. Memeli hücrelerinin, DNA hasarı tersine veya mola yerlerinde sırası geri yükleyebilirsiniz onarım faaliyetleri bir dizi sahip olmasına rağmen, mutasyonların yine bir hücrenin ömrü boyunca birikir. DNA hasarı, ayrıca, yaşlanma ile ilişkili hastalık 2 ile ilişkili iki işlem, yaşlılık ve kök hücre potens kaybı katkıda bulunabilir. İki işaret adresleme nedenle merkezi öneme DNA hasarının onarımı Anlamakamu sağlığı ificant konular. Artan kanıtlar memeli DNA onarım yolları daha da zorunlu moleküler düzeyde mutasyon bastırmakla alakası süreçleri anlamak için yapım, kanser hücre genomu 3,4 evrimine katkıda düşündürmektedir. Kromozom anormallikleri doğrudan görselleştirme özel bir hücre türü genomik instabilite ölçüde belirleyen güçlü ve kantitatif bir araçtır. Metafaz hücrelerinden özet kromozomları izole ve ışık veya floresan mikroskopi kullanılarak kontrol edilebilir. Bu tür yaklaşımlar, sitogenetik birkaç on yıl boyunca uygulamada olmuştur ve translokasyonları veya DNA tamir aktiviteleri kaybı ile ilgili kromozom anormallikleri belirli türleri görünümünü göstermek için kullanılabilir. Protokol birkaç potansiyel uzantıları kendisini ödünç: kromozomlar in situ hibridizasyon spektral karyotip (SKY) veya çok renkli floresan için sondalar ile etiketli olabilir(MFISH) translakosyon 5,6 tanımlamak için. Bu teknikler aynı zamanda bu protokol ile mümkündür ötesinde ek bilgi sağlar kromozom translokasyonların sıklığını ve tespit edilecek kompleks kromozom translokasyonların yapısını, etkinleştirin. Seçenek olarak ise, diziye özgü problar olarak üretilir ve seçilen genomik DNA&#39;sı sitelerinin 7 kopma frekansı test etmek için de kullanılabilir. Bu protokol, biz metafaz kromozom hazırlanması B lenfositlerden yayılır açıklar. Telomerik tekrarlar için bir fluoresan olarak işaretlenmiş peptid nükleik asit (PNA) sistemi etkin metafaz kromozomda telomerlerin işaretleyen kullanılır Bu protokol, bir çok avantaja sahiptir yayılır. B hücreleri, yüksek kaliteli sürülen sürekli olarak üretilebilir ve böylece yüksek bir mitotik indeksli, büyümesi için teşvik edilebilir. Genetiği değiştirilmiş farelerde B hücreleri de çok daha az katkı analizini bulandırabilir sekonder genetik mutasyonlar içeren muhtemeldirgenomik bütünlük belirli genler. PNA-BALIK yaklaşım bir günde tamamlanmış ve kromozom kırılmaları daha doğru puanlama veriyor olabilir. Özellikle bu protokolde tarif edilen özel ekipmanla birlikte, bu yaklaşım kullanılarak, çok tutarlı, yüksek kaliteli sürülen ürünlerin üretilmesi ve hızlı oranı ve genomik instabilite tür analiz etmek mümkündür.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="679">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Name</td>
			<td style="width:116px;">Company&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:176px;">&#160;Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50% Dextran sulfate</td>
			<td>Intergen</td>
			<td>S4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deionized formamide&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pepsin (5g)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 6887&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FCS</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LPS (100mg)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IL-4 (5&#956;g)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PNA Telomere Probe</td>
			<td>PNA Bio Inc</td>
			<td>F1002</td>
			<td>(CCCTAACCCTAACCCTAA)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Colcemid</td>
			<td>Roche</td>
			<td>295892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mowiol 4-88</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>81381-50g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD43 (ly-48_) micro-beads</td>
			<td>Miltenyl Biotec.&#160;</td>
			<td>130-049-801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32670-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eclipse E800</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AxioImager.Z2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber</td>
			<td>Thermotron</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid analysis of chromosome aberrations in mouse b lymphocytes by pna-fish

Arızalı DNA onarım tümörigeneze yol mutasyonların kök nedenidir genomik istikrarsızlık, artan yol açar. Farklı hücre tiplerinde frekans ve kromozom anormallikleri türü analizi DNA onarım geçiş yollarında bazı kusurların araştırılmasına izin verir. Anlama memeli DNA tamir biyoloji büyük ölçüde spesifik gen knock-out ile farelerin üretimi ile yardımcı olmuştur. Bu protokolün amacı, fare B lenfositleri genomik istikrarsızlık ölçümüdür. PNA-BALIK sondaları (peptid nükleik asit - in situ hibridizasyon floresan) ile telomerlerin Etiketleme metafaz kromozom yayılır genomik istikrarsızlık hızlı analiz kolaylaştırır. Normal ploidi ve daha yüksek bir mitotik indeks çünkü B hücreleri, fibroblastlar göre spesifik avantajları vardır. B hücrelerinin kısa dönemli kültür bu nedenle daha az ikincil genetik mutasyona uğramış ihtimali olan bir birincil hücre popülasyonunda genomik instabilite hassas ölçüm sağlartipik olarak transforme edilmiş fibroblastlar veya hastanın hücre soylarında bulundu olandan s.

Bir hücreden türetilen metafaz kromozomlarda (Şekil 1A) (Fare hücreleri kullanılarak gerçekleştirilen varsa) 40 kromozom içeren ayrı bir küme oluşturmak gerekir. Her kromozom bir açık mavi küre gibi görünür bir ucunda, bir sentromer vardır. Normal kromozom olarak iki telomer sinyaller her bir sentromer ile kromatidlerin ve iki sinyalin sonunda görülür. Interfaz çekirdekleri de slaytta mevcut olacaktır. Bu kırmızı telomer sinyalleri ile mavi küreler, ama hiçbir yoğunlaşmış...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH at JoVE.com

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

DNA onarım yolları genomik bütünlüğünü korumak ve mutasyon ve kanser önlenmesi için gereklidir. Bu protokolün amacı, metafaz telomerik DNA tekrarlar in situ hibridizasyon (FISH) floresan kullanılarak fare B hücreleri yayılır içinde kromozom anormallikleri doğrudan gözlem ile genomik istikrarsızlık ölçümüdür.

PNA-FISH ile Fare B Lenfositlerindeki kromozom anormallikleri hızlı Analizi

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Sitotoksik T Lenfositler Beta Hücre Ölümü aracılığı ile değerlendirin yöntemleri

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Fare Genital Sistemlerinin Mukozanin gelen Lenfosit İzolasyonu

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

Kemokin Sinyalizasyonu Bağlı Hücresel ve Moleküler Polarizasyon Hızlı ve Sağlam Analizi

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

Doğru Algılama Fare B Lineage Hücreleri IgE-ifade

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

İnfiltratif Lenfositlerinin Analiz Olmayan enzimatik ayırmak Taze İnsan Dokusuna Basit ve Hızlı Protokolü

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

İnsan Palatine Bademcikler B ve T Lenfosit için Verimli İzolasyon Protokolü

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Hızlı moleküler algılama ve Nezle Virüsleri A ve B farklılaşması

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi Ölçülen İlköğretim Lenfositler Plazma Membranlarda moleküler difüzyon

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Bağışıklık ilaçlarının tanımlanmasında T lenfositlerinde mitojen kaynaklı blastojenez hızlı bir şekilde belirlenmesini

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Lenfositler fare küçük bağırsak bağışıklık sistemi yalıtma

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...