Name: enhanced northern blot detection of small rna species in drosophila melanogaster
Uploaded: 2014-08-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster at JoVE.com

وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للسانتيه آخرون ميديكال للبحوث، والمركز الوطني للبحوث العلمية، وجامعة دي ستراسبورغ، دخلت المستشفى دي ستراسبورغ، وجمعية صب لا SUR LE بحوث السرطان، والمعهد الوطني للسرطان، الوكالة الوطنية للبحوث ومنطقة الألزاس. وقد تم دعم بيترو انيف من قبل مؤسسة بحوث صب لا ميديكال. حاليا، فهو حاصل على الزمالة ISTITUTO ايطالي TECNOLOGIA (IIT). معتمدة تكاليف النشر من قبل الشبكة Neurex (TriNeuron - برنامج INTERREG الرابع الراين العليا)

مجموعة 1. عينة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 فصل خلايا شبه ملتصقة شنايدر، (1-5 × 10 6 خلايا في المتوسط)، من قبل pipetting وحصادها بواسطة الطرد المركزي (100 x ج لمدة 1 دقيقة). في حالة في المختبر الخلايا الملتصقة مثقف، يعرض للتريبسين لهم في الظروف الق?...

على الرغم من تقديرنا للالمحنك المتشابكة من خلالها RNA ينظم تكوين الخلايا العصبية في تزايد مستمر، والآثار الميكانيكية للcircuitries القائم على RNA العصبي التي تؤثر بيولوجيا الخلايا الجذعية، وتمايز الخلايا العصبية / التكامل الوظيفي، وتطوير الأمراض العصبية والسرطان لا تزال ?...

شهدت RNA الكيمياء الحيوية تقدمات مذهلة في السنوات الماضية 1. وقد انفجر فهمنا من إمكانات RNA في السيطرة على التعبير الجيني من خلال تحديد قوية غير المكودة RIBO المنظمين 2، من خلال اكتشاف آليات جديدة على أساس RNA 3،4 التنظيمية وتوصيف أعمق من الأحداث آخر النسخي المعروف بالفعل 5. كل ذلك معا وقد سمحت هذه الدراسات البيولوجيا RNA لجعل المشهد بشكل كبير، وأصبح موضوع البحث الرئيسي في المشهد العلمي الحالي. على وجه الخصوص، خلال السنوات الأخيرة أننا نحصل على الشعور تأثير المتفشي من &quot;عالم RNA&quot; في بيولوجيا الأعصاب الجزيئية 6، واحدة من المجالات البحثية الأكثر ديناميكية في علوم الحياة الحديثة. في العقد الأخير من القرن الماضي، وقد أحدثت ثورة في السيناريو العلمي الشامل قبل اكتشاف تدخل الحمض النووي الريبي و7،8 من الرنا التنظيمية صغيرة 9،10مع إيلاء اهتمام خاص لالرنا الميكروية 11، عن التطور الطبيعي الرنا غير مكود صغيرة المتورطين في السيطرة على جميع الوظائف الخلوية ما يقرب من المنظمين عديد المظاهر واندماجي في التعبير الجيني. بعد ما يقرب من 10 عاما ميرنا الاكتشاف الأولي في ايليجانس انواع معينة من أمبروس ومختبرات Ruvkun، وتحولت اهتماما متجددا إلى الميدان عندما تم تحديد أعداد كبيرة من miRNAs في ذبابة الفاكهة وفي الخلايا البشرية فضلا 12-15. منذ ذلك الحين، وذلك بفضل النهج المعدلة وراثيا تنوعا، وقفت ذبابة الفاكهة السوداء البطن بها باعتبارها السياق البيولوجي قيما للالخوض ميرنا الحيوي والنشاط. كشفت ذبابة الفاكهة miRNAs ظائف متميزة في عمليات الحشرات محددة أو الحفظ تطويريا، والتي تمتد من الشيخوخة وحتى التمثيل الغذائي، مما يشير إلى مسارات والسلوك، وبطبيعة الحال، تكوين الخلايا العصبية. على طول هذا الاتجاه، فإننا كشف مؤخرا وجود صلة رواية 16 في التعاون فضولrrelation التي تحدث بين الجينات سيد صناع التغيير العالمي / وأنسل من مسار RNA. عامل ذبابة النسخ GCM / الإنزلاق 17-19 يشكل نموذجا فريدا من المحددات مصير الخلية، والتي تملي الدبقية مقابل خيار مصير الخلايا العصبية في متعدد القدرات تطير السلائف العصبية 20. عام البحوث والعشرين طويلة حول هذا الموضوع وأكدت بشكل واضح وقوع مدخلات متعددة ومتداخلة من الجين تنظيم التعبير تتلاقى على صناع التغيير العالمي / أنسل 21-28 لتأسيس مستويات الحد الأدنى المطلوب لتحقيق التوازن بين نسبة الحساسة بين نظرائهم العصبية والدبقية خلال التطور العصبي. اكتشفنا أن التنظيم عبر استهداف Dmel-miR279 يمثل مستوى الرقابة مزيد من المساهمة في مرحلة ما بعد النسخي صقل من صناع التغيير العالمي / أنسل التعبير 16. تحسينات منهجية محددة على الصعيد العالمي، ويتطلب هذه الخطوط البحثية: طول سنوات، عدة تقنيات وضعت أصلا لتحليل التقليديةتم تحويل الرنا itional لقياس الرنا صغيرة غير الترميز، مثل ما المقايسات حماية ريبونوكلياز، المصفوفات [كدنا] 29-31، في الوقت الحقيقي PCR أساليب 32-35 وتسلسل 36،37. على الجانب الآخر، إعادة تقويم المناهج الفنية عزز تقدمات مستمرة في هذا المجال. شمال لطخة فحص (NB، أو هلام RNA فحص لطخة) يشكل المثال التمثيلي: يعمل إلى حد كبير على البيانات الشخصية تراكم RNA، لأنه يضمن كل من مستوى التعبير الكميات وكذلك تحديد الحجم. ومع ذلك، فإن حساسية الفقيرة الجوهرية للطريقة يحد عندما يكون ليتم تطبيقها على التعبير الجيني المستقبلون غرامة المنخفضة وفيرة، مثل الرنا قصيرة. والنتيجة الضارة هي شرط كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي مجموع، مما يجعل من الصعب تطبيقه على عينات بيولوجية محددة. لهذه الأسباب، NB المتغيرات المحددة للكشف الرنا صغيرة تم وضعها 38-40: نحن استغل لتحسين بروك NBedure 41 (ENB، وتعزيز الشمالية البقعة)، في حين توضيح التفاعل المذكور بين Dmel-miR279 وصناع التغيير العالمي / أنسل. ويعتمد هذا الأسلوب على خطوة الكيميائية يشابك على أساس النشاط لمشتقات Carbodiimide [1 إيثيل-3- (3 dimethylaminopropyl) carbodiimide، EDC] لإصلاح الحمض النووي على دعامات صلبة. Carbodiimide هو رابط عبر تنوعا معروفة لتحفيز تشكيل السندات أميد بين الكربوكسيل أو مجموعات الفوسفات تنشيط والجماعات أمين 42. يمكن استغلال هذه الخاصية لالرنا صغيرة زوجين تساهميا عبر مجموعة أحادية فسفرته من 5&#39;-الهيدروكسيل إلى الأمينية مجموعات على سطح الأغشية النايلون. التكوين مرفق الناتجة يزيد من سهولة الوصول للحمض النووي يجمد وبدوره، كفاءة التهجين التحقيق المستهدفة، مما يؤدي إلى تعزيز الكشف ملحوظا 43. هذه التقنية تفترض relevanc معينةالإلكترونية في الدراسات الجزيئية ذبابة الفاكهة، التي وقوع فصول جديدة ومميزة من الرنا غير مكود صغيرة في الظهور 44. من بين هؤلاء، rasiRNAs 45،46 تشكل سلالة محددة من الرنا-التفاعل piwi (piRNAs 47)، والمشاركة في تسلسل محدد إسكات الجينات. تفاصيل منطوق هذه الطريقة يتم وصف كامل وتصور فيما بعد، نسبة إلى تحليل الرنا الميكروية Dmel-miR279 وDmel-miR286، وللمرة الأولى، من rasiRNA واحد، rasi4. نحن دفعت إلى التطرف هذه الطريقة، الأمر الذي سمح لنا الكشف عن أهداف أعرب سيئة من كميات ضئيلة من الحمض النووي الريبي (أقل من 1 ميكروغرام).

enhanced northern blot detection of small rna species in drosophila melanogaster

وقد شهدت العقود الأخيرة انفجار الفائدة العلمية حول آليات الرقابة التعبير الجيني على مستوى الحمض النووي الريبي. هذا الفرع من علم الأحياء الجزيئي واشتعل كثيرا اكتشاف الرنا غير المكودة باعتبارها من اللاعبين الرئيسيين في التنظيم بعد النسخي. وقد رافق هذا المنظور الثوري والناجمة عن تطوير تكنولوجيات قوية لالتنميط قصيرة الرنا التعبير، سواء على مستوى الإنتاجية العالية (التعرف على نطاق الجينوم) أو تحليل مرشح واحد (الدولة تراكم مستمر من أنواع محددة). وعلى الرغم من عدة دولة من بين الفن الاستراتيجيات المتاحة حاليا لجرعات أو تصور مثل هذه الجزيئات الفارين، يبقى لطخة الشمالية فحص النهج المؤهلين في مجال البيولوجيا الجزيئية لتقييم فوري ودقيق التعبير RNA. أنها تمثل خطوة أولى نحو تطبيق أكثر تطورا والتكنولوجيات مكلفة، وفي كثير من الحالات، يبقى وسيلة تفضيلية للحصول على أفكار بسهولةفي علم الأحياء الحمض النووي الريبي. نحن هنا نظرة عامة على بروتوكول كفاءة (المحسن الشمالية البقعة) للكشف عن الرنا الميكروية أعرب ضعيف (RNA التنظيمية أو الأنواع الصغيرة الأخرى) من الدروسوفيلاميلانوجاستر الأجنة كلها، تشريح أنسجة اليرقات / الكبار يدويا أو المختبر في الخلايا المستزرعة. مطلوب كمية محدودة جدا من الحمض النووي الريبي واستخدام مواد من تدفق خلايا معزولة الخلوي يمكن أن يكون التفكير أيضا.

<html> باتباع الإجراء الشامل وصفها في نص وتمثيل تخطيطي في الشكل 1، قمنا بتقييم التعبير الرنا صغيرة من عينات الحمض النووي الريبي معقدة من أصول مختلفة. في التجربة المعروضة في الشكل 1، تم عزل الحمض النووي الريبي من 2 خلايا ذبابة الفاكهة شنايدر عن طريق ...

Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster at JoVE.com

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

تعزيز الشمالية كشف طخة الأنواع RNA الصغيرة في<em&gt; الدروسوفيلاميلانوجاستر</em

والهدف من هذا المنشور هو تصور ومناقشة الخطوات المنطوق لتعزيز بروتوكول الشمالية صمة عار على الحمض النووي الريبي المستخرج من الدروسوفيلاميلانوجاستر الأجنة والخلايا والأنسجة. هذا البروتوكول هو مفيدة بشكل خاص للكشف عن كفاءة الأنواع RNA الصغيرة.

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

Research

JoVE Journal

Biology

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

تشريح الجهاز العصبي المركزي اليرقات في Melanogaster ذبابة الفاكهة

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

عالية الدقة تعقب الفيديو للتنقل في الكبار ذبابة الفاكهة السوداء البطن

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

يعيش تصوير ذبابة الفاكهة السوداء البطن هجرات كرية دموية الجنينية

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

تشريح Oenocytes من الكبار ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

عزلة ذبابة الفاكهة السوداء البطن الخصيات

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

عينات الشعر نونينفاسيفي تقنيات الحمض النووي للحصول على ارتفاع الجودة من الثدييات الصغيرة المراوغ

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

الجيل الركيزة لEndonucleases من CRISPR / كاس أنظمة

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

قياس عمر في<em&gt; ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

التصوير من خلال حالة العذراء من<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

صيانة<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; عدد السكان قفص

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...