Name: enhanced northern blot detection of small rna species in drosophila melanogaster
Uploaded: 2014-08-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster at JoVE.com

Diese Arbeit wurde vom Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale unterstützt, das Centre National de la Recherche Scientifique, die Université de Strasbourg, das Hôpital de Strasbourg, der Verband pour la Recherche sur le Cancer, dem Institut National du Cancer, der Agence Nationale de la Recherche und dem Elsass. Pietro Laneve wurde von der Fondation la Recherche Médicale unterstützt gießen. Derzeit ist er ein Empfänger einer Istituto Italiano Tecnologia (IIT) Gemeinschaft. Publikationskosten werden von der Neurex Netzwerk unterstützt (TriNeuron - Programm Interreg IV Oberrhein)

1. Probenentnahme <ol><li> Lösen halbhaft Schneider 2-Zellen (1-5 × 10 6 Zellen im Durchschnitt), und durch Pipettieren geerntet sie durch Zentrifugation (100 × g für 1 min). Im Falle von in vitro kultivierten adhärenten Zellen, trypsinize sie unter Standardbedingungen oder direkt sammeln sie von den Platten in eine geeignete Menge an RNA-Extraktionsreagenz, mit Hilfe eines Zellschabers. </li><li> Für Embryo-Entnahme, wachsen Drosophila-Stämmen in Flugkäfigen und lassen Embryonen s...

Obwohl unsere Wertschätzung der Feingeist, durch die Verflechtung RNA reguliert die Neurogenese steigt kontinuierlich, die mechanistische Auswirkungen der RNA-basierten Schaltungen beeinflussen neuronalen Stammzellbiologie, die neuronale Differenzierung / Funktionsintegration, Entwicklung von neuronalen Erkrankungen und Krebserkrankungen bleiben unerforscht. Die Pflege solcher Netzwerke durch Reiche macht das Potenzial der genetischen Systemen wie Drosophila melanogaster Instrumental in unerforschte zelluläre...

RNA Biochemie hat spektakuläre Fortschritte in den vergangenen Jahren erlebt 1. Unser Verständnis von RNA-Potenzial in der Steuerung der Genexpression durch die Identifizierung von nicht-kodierenden leistungsstarke Ribo-Regulatoren 2 gesprengt, durch die Entdeckung von neuartigen RNA-basierte Regulationsmechanismen 3,4 und durch eine tiefere Charakterisierung der bereits bekannten posttranskriptionale Veranstaltungen 5. Alle zusammen haben diese Studien erlaubt RNA Biologie drastisch machen die Szene, zu einem wichtigen Forschungsthema in der aktuellen Wissenschaftslandschaft. Insbesondere in den letzten Jahren sind wir immer ein Gefühl von der allgegenwärtigen Auswirkungen der &quot;RNA-Welt&quot; auf der molekularen Neurobiologie 6, eines der dynamischsten Forschungsbereiche in der modernen Lebenswissenschaften. Im letzten Jahrzehnt des vergangenen Jahrhunderts hat sich die wissenschaftliche Gesamtszenario durch die Entdeckung der RNA-Interferenz 7,8 und der kleine regulatorische RNAs 9,10 revolutioniertinsbesondere im Bereich der Mikro-RNAs 11, endogen exprimiert kleinen nicht-kodierenden RNAs in der Kontrolle fast aller zellulären Funktionen als pleiotrope und kombiRegulaToren der Genexpression beteiligt ist. Fast 10 Jahre nach miRNA ersten Entdeckung in Caenorhabditis elegans durch Ambros und Ruvkun-Labors, wurde die Aufmerksamkeit erneut auf das Feld eingeschaltet, wenn eine hohe Zahl von miRNAs wurden in Drosophila und in menschlichen Zellen als auch 12-15 identifiziert. Seitdem dank vielseitiger transgene Ansätze, Drosophila melanogaster hat sich als wertvolle biologische Kontext für das Eintauchen in miRNA Biosynthese und Aktivität stand. Drosophila miRNAs haben unterschiedliche Funktionen in Insektenspezifische oder evolutionär konservierten Prozesse aufgedeckt, die sich vom Altern, den Stoffwechsel, Signalwege , Verhalten und, natürlich, die Neurogenese. Entlang dieser Richtung, die wir vor kurzem eine neuartige Verbindung 16 in die faszinierende Zusammenarbeitrrelation zwischen dem Master-Gen gcm / Gleiten und der RNA-Weg stattfindet. Die Fliege Transkriptionsfaktor Gcm / Glide 17-19 stellt ein einzigartiges Beispiel für das Schicksal der Zelle Determinante, die diktiert die Glia gegen neuronale Schicksal Wahl in multi fliegen neuronalen Vorläufer 20. Zwanzig Jahre lang Forschung zu diesem Thema hat deutlich unterstrichen, das Auftreten von mehreren überlappenden und Eingänge der Genregulation konvergierenden über GCM / gleiten 21-28, die zum Ausgleich der zarte Verhältnis zwischen neuronalen und Gliazellen während der Entwicklung des Nervensystems Kollegen erforderlich Schwellenwerte festzulegen. Wir entdeckten, dass die Verordnung über DMEL-miR279 Targeting stellt eine weitere Steuerungsebene einen Beitrag zur posttranskriptionale Feinabstimmung der GCM / 16 gleiten Ausdruck. Weltweit haben diese Forschungslinien erforderliche spezifische methodische Verbesserungen: entlang Jahren mehrere Technologien, die ursprünglich entwickelt, um zu analysieren traditional RNAs wurden zur Quantifizierung der kleine nicht kodierende RNAs wurden wie umgewandelt, wie RNAse-Schutzassays, cDNA-Arrays 29-31, Echtzeit-PCR-Verfahren 32-35 und Sequenzierung 36,37. Auf der anderen Seite hat Rekalibrierung technische Ansätze kontinuierlichen Fortschritte auf dem Gebiet gefördert. Northern Blot-Assay (NB, oder RNA-Gel-Blot-Test) stellt eine repräsentative Beispiel: Es wird weitgehend eingesetzt, um RNA-Akkumulation Profil, da sie gewährleistet, sowohl quantitative Expressionsniveau sowie Größenbestimmung. Allerdings ist die Eigen geringe Empfindlichkeit der Methode begrenzen, wenn es um den Nieder reichlich Genexpression Feinstimmer wie kurze RNAs angewendet werden kann, ist. Eine nachteilige Folge ist das Erfordernis großer Mengen an Gesamt-RNA, die nur schwer ihre Anwendung auf bestimmte biologische Proben ermöglicht. Aus solchen Gründen bestimmte NB Varianten für kleine RNAs Erkennung entwickelt worden 38-40: wir nutzten eine verbesserte NB procEDURE 41 (ENB, Enhanced Northern Blot), während die Aufklärung der oben genannten Wechselspiel zwischen DMEL-miR279 und GCM / gleiten. Dieses Verfahren beruht auf einer chemischen Vernetzungsschritt auf der Basis der Aktivität eines Carbodiimid-Derivats [1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid, EDC] die Nucleinsäure auf festen Trägern zu fixieren. Carbodiimid ist ein vielseitiges Vernetzer bekannt, die Bildung von Amidbindungen zwischen den aktivierten Carboxy oder Phosphat-und Amingruppen 42 katalysieren. Diese Eigenschaft kann durch die Mono-phosphorylierten 5&#39;-Hydroxylgruppe kovalent paar kleine RNAs ausgenutzt werden, um Gruppen an der Oberfläche der Nylonmembranen Amino ist. Die resultierende Befestigung Konfiguration erhöht die Zugänglichkeit des immobilisierten Nukleinsäure und wiederum die Effizienz der Sonden-Target-Hybridisierung, die in bemerkenswerter Detektionsverstärkung 43 führt. Die Technik übernimmt insbesondere relevance in Drosophila molekulare Studien, mit denen das Auftreten von neuen und unverwechselbaren Klassen von kleinen nicht-kodierenden RNAs 44 entsteht. Unter diesen rasiRNAs 45,46 bilden einen bestimmten Subtyp von Piwi-interacting RNAs (piRNAs 47), in sequenzspezifische Gen-Silencing beteiligt. Operative Details dieses Verfahrens werden im Folgenden vollständig beschrieben und visualisiert, bezogen auf die Analyse der miRNAs DMEL--miR279 und DMEL--miR286 und zum ersten Mal von einem rasiRNA, rasi4. Wir schoben, diese Methode, die es uns erlaubt enthüllt schlecht ausgedrückt Ziele von minimalen Mengen von RNA (weniger als 1 ug) Extreme.

enhanced northern blot detection of small rna species in drosophila melanogaster

Die letzten Jahrzehnte haben die Explosion der wissenschaftlichen Interesse rund um die Genexpression Kontrollmechanismen auf RNA-Ebene erlebt. Dieser Zweig der Molekularbiologie wurde stark durch die Entdeckung von nicht-kodierenden RNAs als Hauptakteure im post-Transkriptionsregulation angeheizt. Solch eine revolutionäre Perspektive wurde begleitet und durch die Entwicklung von leistungsfähigen Technologien für die Profilierung von kurzen RNAs Ausdruck ausgelöst, sowohl auf der Hochdurchsatz-Ebene (genomweiten Identifikation) oder als Single-Kandidat Analyse (steady state Anreicherung von spezifischen Arten). Obwohl mehrere state-of-art-Strategien derzeit zur Dosierung oder zu visualisieren, wie Flucht-Moleküle vorhanden sind, bleibt Northern Blot-Test die zuschussfähigen Ansatz in der Molekularbiologie für die sofortige und genaue Auswertung der RNA-Expression. Es ist ein erster Schritt in Richtung der Anwendung von anspruchsvoller, kostenintensive Technologien und in vielen Fällen bleibt eine bevorzugte Methode, um einfach Einblickein RNA Biologie. Hier Übersicht wir ein effizientes Protokoll (erweitert Northern Blot) zum Erfassen schwach exprimierte microRNAs (oder andere kleine regulatorische RNA-Spezies) von Drosophila melanogaster ganze Embryonen, manuell zerlegt Larven / adulten Geweben oder in vitro kultivierten Zellen. Eine sehr begrenzte Menge an RNA erforderlich ist, und die Verwendung von Material aus der Durchflusszytometrie isoliert Zellen können auch in Betracht gezogen.

Durch Befolgen der im Text beschrieben und schematisch in Abbildung 1 dargestellt Gesamtverfahren, untersuchten wir die Expression von RNAs kleine RNA-Komplex Proben unterschiedlicher Herkunft. In dem Experiment in Abbildung 1 dargestellt, wurde RNA aus Drosophila Schneider 2-Zellen durch Proteinase K-Extraktion, Integrität überprüft isoliert (optionaler Schritt: Denaturierung Agarose-Gel-Fraktionierung) und im Doppel geladen. Eine Hälfte des Gels wurde auf eine neutrale Me...

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Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Verbesserte Northern Blot Detektion von kleinen RNA-Spezies in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Das Ziel dieser Publikation ist es, sichtbar zu machen und zu diskutieren, die operativen Schritte einer Enhanced Northern Blot-Protokoll auf RNA aus Drosophila melanogaster Embryonen entnommen, Zellen und Geweben. Dieses Protokoll ist besonders nützlich für eine effiziente Erkennung von kleinen RNA-Spezies.

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

Research

JoVE Journal

Biology

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

Dissection der Larven ZNS von Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Forschung

Biologie

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

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Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

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Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

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Präparation Oenocytes von Adult Drosophila melanogaster</em

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Isolation of Drosophila melanogaster Testes

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Isolierung von Drosophila melanogaster Testes

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Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

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Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

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Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

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