Name: enhanced northern blot detection of small rna species in drosophila melanogaster
Uploaded: 2014-08-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Institut National de la Santé et de la Recherche MEDICALE, den Centre National de la Recherche Scientifique, Université de Strasbourg, den Hôpital de Strasbourg, Association pour la Recherche sur le Cancer, Institut National du Cancer, Agence Nationale de la Recherche og regionen Alsace. Pietro Laneve har vært støttet av Fondation pour la Recherche MEDICALE. For tiden er han en mottaker av en Istituto Italiano Tecnologia (IIT) fellesskap. Publiseringskostnadene støttes av Neurex nettverk (TriNeuron - Program Interreg IV Øvre Rhinen)

1. Prøvetaking <ol><li> Løsne semi-tilhenger Schneiders to celler, (1-5 x 10 6 celler i gjennomsnitt), ved pipettering og høste dem ved sentrifugering (100 xg i 1 min). I tilfelle av in vitro dyrkede adherente celler, trypsinize dem i standardforhold eller direkte samle dem fra platene i en passende mengde av RNA-ekstraksjon reagens, ved hjelp av en celleskrape. </li><li> For embryo samling, vokse Drosophila stammer i flue bur og la embryoer samle på egg legging plater. Tørk embryoer ...

Selv om vår forståelse av sofistikert sammenflettingen der RNA regulerer neurogenesis er stadig økende, mekanistiske implikasjonene av RNA-baserte kretser påvirker nevrale stamcellebiologi, neuronal differensiering / funksjonell integrasjon, utvikling av nevrale sykdommer og kreft forbli uutforsket. Vedlikehold av slike nettverk gjennom riker gjør potensialet av genetiske systemer som Drosophila melanogaster instrumental å rakne uutforskede cellulære trasé, der kort ikke-kodende RNA og transkripsjonsfak...

RNA biokjemi har opplevd spektakulære utvikler de siste årene en. Vår forståelse av RNA potensial i kontroll av genekspresjon er sprengt ved identifisering av effektive ikke-kodende ribo-regulatorer 2, av oppdagelsen av nye RNA-baserte regulatoriske mekanismer 3,4 og ved en dypere karakterisering av allerede kjente post-transkripsjonelle arrangementer 5. Alle sammen disse studiene har tillatt RNA biologi å dramatisk gjøre scenen, blir et stort forsknings emne i dagens vitenskapelige landskapet. Spesielt de siste årene får vi en følelse av gjennomgripende påvirkning av &quot;RNA verden&quot; på molekylær nevrobiologi 6, en av de mest dynamiske forsknings domener i moderne life science. I det siste tiåret av forrige århundre, har den samlede vitenskapelige scenario blitt revolusjonert av oppdagelsen av RNA-interferens 7,8 og av de små regulatoriske RNA 9,10med særlig hensyn til micrornas 11, endogent uttrykt små ikke-kodende RNA er implisert i kontrollen av nesten alle cellulære funksjoner som mitogen og kombinatoriske regulatorer av genekspresjon. Nesten 10 år etter at miRNA første oppdagelsen i Caenorhabditis elegans med Ambros og Ruvkun laboratorier, ble fornyet oppmerksomhet slått til feltet når høyt antall mirnas ble identifisert i Drosophila og i humane celler samt 12-15. Siden da, takket være allsidige transgene nærmer seg, har Drosophila melanogaster sto ut som et verdifullt biologisk kontekst for hulene i miRNA biosyntese og aktivitet. Drosophila mirnas har avdekket distinkte funksjoner i insekt-spesifikke eller evolusjonært konserverte prosesser, som spenner fra aldring til metabolisme, signalveier , oppførsel og, selvfølgelig, nevrogenesen. Langs denne retningen, vi nylig avduket en roman kobling 16 i den spennende correlation oppstår mellom master genet GCM / gli og RNA sti. Flua transkripsjonsfaktor GCM / Glide 17-19 utgjør et unikt eksempel på celle skjebne determinant, som dikterer glial vs nevronale skjebne valg i multipotent fly nevrale forløpere 20. Tjue år lang forskning på dette temaet har tydelig understreket forekomsten av flere og overlappende tilførsler av genuttrykk regulering konvergerende løpet GCM / glir 21-28 å etablere terskelnivå for å balansere den delikate forholdet mellom nevronale og glial kolleger under nevral utvikling. Vi oppdaget at regulering via DMEL-miR279 målretting representerer en ytterligere kontrollnivå bidrar til post-transcriptional finjustering av GCM / glir uttrykk 16. Globalt har disse forsknings linjer som kreves konkrete metodiske forbedringer: langs år, flere teknologier opprinnelig utviklet for å analysere traditional RNA har blitt konvertert for å kvantifisere små ikkekodende RNA, som som RNase beskyttelse analyser, cDNA arrays 29-31, real-time PCR-metoder 32-35 og sekvenser 36,37. På den andre siden, har kalibrering av tekniske tilnærminger fostret kontinuerlige utvikler i felten. Northern blot-analyse (NB, eller RNA gel blot-analyse) utgjør et representativt eksempel: det er i stor grad anvendt for å profilere RNA-akkumulering, siden den sikrer både uttrykket nivået kvantifisering samt størrelsen bestemmelse. Imidlertid er den iboende dårlig sensitivitet for metoden begrensende når det skal anvendes til lav-rike genekspresjon fin-mottakere, slik som korte RNA. En ugunstig konsekvens er kravet om store mengder av total-RNA, som gjør vanskelig dens anvendelse til spesifikke biologiske prøver. Av slike grunner, spesifikke NB varianter for små RNA deteksjon er utviklet 38-40: vi tok fordel av en forbedret NB procedure 41 (ENB, Enhanced Northern Blot), mens belyse ovennevnte samspillet mellom DMEL-miR279 og GCM / glid. Denne fremgangsmåte er avhengig av en kjemisk kryssbindingstrinn basert på aktiviteten av et karbodiimid-derivat [1-etyl-3 (3-dimetylaminopropyl) karbodiimid, EDC] for å feste nukleinsyren til faste bærere. Karbodiimid er et allsidig kryssbindings kjent for å katalysere dannelsen av amidbindinger mellom aktiverte karboksyl-eller fosfat-grupper og amingrupper 42. Denne egenskapen kan utnyttes for å kovalent par små RNAer via deres mono-fosforylert 5&#39;-hydroksylgruppen til aminogrupper på overflaten av nylonmembraner. Det resulterende feste konfigurasjon øker tilgjengeligheten av den immobiliserte nukleinsyre og, i sin tur, effektiviteten av probe-target-hybridisering, som resulterer i påvisning bemerkelsesverdig forbedring 43. Teknikken foruts bestemt relevance i Drosophila molekylære studier, der forekomsten av nye og særegne klasser av små ikke-kodende RNA fremstår 44. Blant disse rasirnas 45,46 utgjør en bestemt subtype av piwi-samspill RNA (piRNAs 47), som er involvert i sekvens-spesifikke genet demping. Operative detaljer ved denne metoden er fullstendig beskrevet i det følgende og visualisert, i forhold til analysen av micrornas DMEL-miR279 og DMEL-miR286 og, for første gang, på en rasiRNA, rasi4. Vi satt på spissen denne metoden, som tillot oss å avsløre dårlig uttrykt mål fra minimale mengder RNA (mindre enn 1 mikrogram).

enhanced northern blot detection of small rna species in drosophila melanogaster

De siste tiårene har vært vitne til eksplosjonen av vitenskapelig interesse rundt genuttrykk kontrollmekanismer på RNA-nivå. Denne grenen av molekylærbiologi har vært sterkt drevet av oppdagelsen av ikke-kodende RNA som store aktører i post-transcriptional regulering. Slik revolusjonerende perspektiv har vært ledsaget og utløst av utviklingen av kraftige teknologier for profilering kort RNA uttrykk, både på high-throughput nivå (genom-wide identifikasjon) eller som enkelt kandidat analyse (steady state akkumulering av spesifikke arter). Selv om flere state-of-art strategier er for tiden tilgjengelig for dosering eller visualisere slike flyktet molekyler, forblir Northern Blot analysen den kvalifiserte tilnærming i molekylærbiologi for umiddelbar og nøyaktig vurdering av RNA uttrykk. Det representerer et første skritt mot bruk av mer avanserte, kostbare teknologier og, i mange tilfeller, forblir en fortrinnsrett metode for enkelt å få innsikti RNA biologi. Her oversikten vi en effektiv protokoll (Enhanced Northern Blot) for å påvise svakt uttrykt micrornas (eller andre små regulatoriske RNA arter) fra Drosophila melanogaster hele embryoer, manuelt dissekert larver / voksen vev eller in vitro dyrkede celler. En meget begrenset mengde av RNA er nødvendig, og bruken av materiale fra flowcytometri-isolerte celler kan også tenkes.

Ved å følge den generelle fremgangsmåte som er beskrevet i teksten, og er skjematisk representert på figur 1, vurderte vi små RNA ekspresjon fra komplekse RNA prøver av forskjellig opprinnelse. I forsøket vist i figur 1, ble RNA isolert fra Drosophila Schneider 2 celler etter Proteinase K ekstraksjon, sjekkes for integritet (valgfritt trinn: denaturerende agarosegel-fraksjonering), og som er lagt i dobbelt. Halvparten av gelen ble blottet på en nøytral membran og kjemi...

Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster at JoVE.com

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Forbedret Northern Blot Påvisning av små RNA Arter i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Målet med denne publikasjonen er å visualisere og diskutere de operative trinnene i en Enhanced Northern Blot protokollen på RNA hentet fra Drosophila melanogaster embryoer, celler og vev. Denne protokollen er spesielt nyttig for effektiv detektering av små RNA-arter.

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

Research

JoVE Journal

Biology

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

Substrat Generation for endonukleaser av CRISPR / Cas Systems

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Måling av levetid i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

Imaging Gjennom pupal Case of<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Vedlikehold av en<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Befolkning Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...