Name: enhanced northern blot detection of small rna species in drosophila melanogaster
Uploaded: 2014-08-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster at JoVE.com

Эта работа была поддержана Национальным институтом де ла Здоровье и де ла Recherche MEDICALE, Национальный центр де ла Recherche Scientifique, Университет Страсбурга, Hôpital де Страсбург, Ассоциация по ла Recherche сюр ле Рак, Национальный институт дю Рак, Agence Nationale-де-ла Recherche и региона Эльзас. Пьетро LaNeve была поддержана Fondation Pour La Recherche MEDICALE. В настоящее время он является получателем Istituto Italiano Tecnologia (ИИТ) общения. Расходы на публикации поддерживаются сети Neurex (TriNeuron - Программа Interreg IV Рейн Верхний)

1 Сбор образцов <ol><li> Снять 2 клетки полу-приверженцем Шнайдера, (1-5 х 10 6 клеток в среднем), с помощью пипетки и собирать их с помощью центрифугирования (100 мкг в течение 1 мин). В случае, культивированных в пробирке адгезивных клеток, Trypsinize их в стандартных условиях или непосредс?...

Хотя наша оценка из усложняем сплетающего через который РНК регулирует нейрогенез постоянно растет, механистические последствия РНК на основе электрических схем, затрагивающих нервную биологию стволовых клеток, дифференцировку нейронов / функциональной интеграции, развитие нервны?...

РНК биохимия пережил захватывающие прогрессирует в последние годы 1. Наша осмысление РНК потенциала в контроле экспрессии генов был лопнуть от идентификации мощных некодирующих рибо- регуляторов 2, в связи с открытием новых РНК на основе регуляторных механизмов 3,4 и более глубоким характеристик уже известных посттранскрипционных событий 5. Все вместе эти исследования позволили РНК биологии резко сделать сцену, став основным предметом исследования в современной научной ландшафта. В частности, за последние годы мы получаем ощущение всепроникающей влияния &quot;мира РНК&quot; на молекулярном нейробиологии 6, один из наиболее динамично развивающихся областей исследований в современной науке о жизни. В последнее десятилетие прошлого века, научная сценарий был революцию в связи с открытием в РНК-интерференция 7,8 и малых регуляторных РНК 9,10обращая особое внимание на микроРНК 11, эндогенно выразил небольшие некодирующих РНК участвует в контроле практически всех клеточных функций, как плейотропных и комбинаторных регуляторов экспрессии генов. Почти через 10 лет после микроРНК первоначального открытия в Caenorhabditis Элеганс по Ambros и лабораторий Ruvkun в, повышенное внимание было обращено к области, когда большое число микроРНК были выявлены у дрозофилы и в клетках человека, а 12-15. С тех пор, благодаря универсальным трансгенных подходов, Дрозофилы выдалась как ценный биологическом контексте для углубляясь в микроРНК биосинтеза и деятельности. Drosophila микроРНК выявили различные функции в насекомых-специфических или эволюционно консервативных процессов, охватывающих от старения для метаболизма, сигнальных путей , поведение и, конечно, нейрогенез. Наряду этом направлении, мы недавно представила новый ссылку 16 в интригующей сотрудничестваrrelation происходит между мастер гена г см / скольжения и РНК пути. Коэффициент муха транскрипции GCM / Glide 17-19 представляет собой уникальный пример клеточной судьбы определителя, который диктует глиальных против нейронов выбор судьбы в мультипотентных летать нейронных предшественников 20. Двадцать год исследования по этой теме явно подчеркнул возникновение многочисленных и дублирующих друг друга входам регуляции экспрессии генов сходящийся над ГКМ / скользить 21-28 установить пороговые уровни, необходимые для балансировки нежную соотношение между нейронными и глиальных коллегами во время развития нервной системы. Мы обнаружили, что регулирование с помощью DMEL-miR279 таргетинга представляет собой иной уровень управления, способствующий посттранскрипционных тонкой настройки гсм / скользить выражение 16. Во всем мире, эти направления исследований требуют от конкретные методологические усовершенствования: наряду лет, несколько технологий, первоначально разработанный для анализа традицitional РНК были преобразованы для количественного небольшие удобства РНК, кодирующие, вроде как анализов на защиту от РНКазы, кДНК массивов 29-31, ПЦР в реальном времени методов 32-35 и секвенирования 36,37. С другой стороны, калибровка технических подходов способствовала непрерывные прогрессирует в области. Нозерн-блот анализ (NB, или РНК гель-блот-анализ) представляет репрезентативную экземпляр: она в значительной степени используется для профилирования накопление РНК, так как он обеспечивает как уровень экспрессии количественного а также определение размера. Тем не менее, внутренняя бедных чувствительность метода ограничивает, когда он должен быть применен к низкой обильных экспрессии генов тонких тюнеров, как коротких РНК. Вредным следствием является требование больших количеств суммарной РНК, которая затрудняет его применение в конкретных биологических образцах. По этим причинам, конкретных вариантов NB для малого обнаружения РНК были разработаны 38-40: мы воспользовались улучшенным NB прокedure 41 (ENB, Enhanced Северная Клякса), в то время как выяснения вышеуказанное взаимодействие между DMEL-miR279 и г см / скольжения. Этот метод основан на шаге химической сшивки на основе активности производного карбодиимида [1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимид, EDC], чтобы зафиксировать нуклеиновой кислоты на твердых подложках. Карбодиимида является универсальным сшивани, как известно, катализируют образование амидных связей между активированными карбоксильными или фосфатных групп и аминогрупп 42. Это свойство может быть использовано для ковалентно пару малых РНК с помощью их моно-фосфорилируются 5&#39;-гидроксильной группы до аминогрупп на поверхности нейлоновые мембраны. Полученную конфигурации крепления повышает доступность иммобилизованным нуклеиновой кислоты и, в свою очередь, эффективность гибридизации зонд-мишень, что приводит к повышению замечательной обнаружения 43. Методика предполагает особое relevancе в Drosophila молекулярных исследований, с помощью которых возникновение новых и отличительных классов малых РНК некодирующих становится 44. Среди них, rasiRNAs 45,46 составляют особую подтип Piwi взаимодействующих РНК (пиРНК 47), участвующих в последовательности конкретных молчания генов. Оперативные Детали этого метода полностью описаны и визуализировали далее, по отношению к анализу микроРНК DMEL-miR279 и DMEL-miR286 и, в первый раз, одного rasiRNA, rasi4. Мы толкнул до крайности этот метод, который позволил нам выявить плохо выраженные цели с минимальным количеством РНК (менее 1 мкг).

enhanced northern blot detection of small rna species in drosophila melanogaster

В последние десятилетия мы стали свидетелями взрыва научного интереса вокруг механизмов контроля экспрессии генов на уровне РНК. Эта отрасль молекулярной биологии была значительно подпитывается открытием некодирующих РНК в качестве основных игроков в пост-транскрипционной регуляции. Такая революционная перспектива сопровождается и вызвано развитием мощных технологий для профилирования короткий выражение РНК, как на уровне высокой пропускной (генома идентификации) или как одного кандидата анализа (стационарного накопления конкретных видов). Хотя несколько состояние дел в области стратегии в настоящее время доступны для дозирования или визуализации таких бегущих молекулы, Северная Клякса анализ остается право подход в молекулярной биологии для немедленного и точного вычисления выражения РНК. Она представляет первый шаг к применению более сложных, дорогостоящих технологий и, во многих случаях, остается льготный способ легко получить представлениев РНК биологии. Здесь мы обзору эффективный протокол (Enhanced Северная Клякса) для обнаружения слабо выраженные микроРНК (или других мелких нормативные вид РНК) из Дрозофилы целые эмбрионы, вручную расчлененный личинок / взрослых тканей или в пробирке культивируемых клетках. Очень ограниченное количество РНК не требуется, и использование материала, из проточной цитометрии-изолированные клетки могут быть также предусмотрены.

Следуя общую процедуру, описанную в тексте, а схематически представлено на рисунке 1, мы оценивали экспрессию малых РНК из сложных образцов РНК различного происхождения. В эксперименте, представленной на рисунке 1, РНК выделяли из 2 клеток дрозофилы Шнайдера по до...

Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster at JoVE.com

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Улучшенная Северная Клякса обнаружения малых РНК видов в<em&gt; Дрозофилы</em

Целью данной публикации является визуализация и обсудить оперативные шаги для улучшенного протокола Северная пятно на РНК, выделенной из Дрозофилы эмбрионов, клетки и ткани. Этот протокол является особенно полезным для эффективного обнаружения мелких видов РНК.

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

Research

JoVE Journal

Biology

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

Препарирование личинок ЦНС у дрозофилы

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Видео высокого разрешения отслеживания передвижения у взрослых дрозофилы

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Живая съемка Дрозофилы Эмбриональные миграции гемоцитов

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

Препарирование Oenocytes от взрослых Дрозофилы</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Изоляция Дрозофилы Семенники

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Неинвазивный метод отбора проб волос для получения высоких ДНК Качество от Неуловимый мелких млекопитающих

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

Субстрат поколения для эндонуклеаз CRISPR / Cas системы

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Измерение продолжительности жизни в<em&gt; Дрозофилы</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

Изображений Через куколки случае<em&gt; Дрозофилы</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Поддержание<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Население Кейдж

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...