Name: analysis of tubular membrane networks in cardiac myocytes from atria and ventricles
Uploaded: 2014-10-15T13:00:00
Duration: 10 min 30 s
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This work received support through Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 1002 (subprojects A05 and B05 to S.E.L.) and KFO 155 (subproject 4 to S.E.L.), a Halbach Foundation award to S.E.L. supporting E.W.; a grant from the German Cardiac Society to S.B.; and a DAAD exchange program supporting T.K. as visitor at the University of Maryland. The research leading to these results has received funding from the European Community&#8217;s Seventh Framework Program FP7/2007-2013 under grant agreement No. HEALTH-F2-2009-241526, EUTrigTreat (to S.E.L.). S.E.L. is a principal investigator of the German Center of Cardiovascular Research (DZHK).

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The authors declare that no conflict of interest exists.

心筋細胞を単離し、何十年も32のために研究されてきたが、最近のレビューは、一貫した高品質の筋細胞単離が27厳しい状況と結論付けた。これは、プライマリ心筋細胞の単離のための比較的複雑なプロトコル向かい合っ共通の標準的なアプローチの欠如、共有メタデータ、および透明セルの品質のドキュメントを反映している。細胞単離プロトコルは、通常、個別のグループによってカスタマイズされて、細胞は分離株の、変数結果をもたらす個別のモデルの設定（ 例えば 、種、年齢、共存する心臓の状態）に依存し、通常、特定の実験条件に合わせて調整されています。ここで紹介する定量的タッツ膜研究やプロトコルの文脈の中で、品質評価およびドキュメントの基本的なレベルは、代謝および分離プロトコルに依存した変化を起こしやすい個別の細胞膜構造の共焦点または超解像顕微鏡に関するもので、両方AMまたはVM内。重要なことは、細胞の単離物の高収量が健康無傷の心筋細胞を提案しても、研究者は、文書化し、批判的に起因する、異なるタイプに固有の変更に対する単離法への非特異的な損傷に対する表面とタッツ膜の完全性の形態学的基準に照らして慎重にそれぞれの個別のセルを判断する必要があります対照条件と比較して介入。心臓細胞単離の間の重要な変数は、指定されたコラゲナーゼのロットの特定の活動である。コラゲナーゼの新しいロットを選択するには、いくつかのコラゲナーゼの試料の酵素活性は、心筋細胞の収量と品質を評価し、製造者の指示に従ってによってお互いにテストする必要があります。理想的には、コラゲナーゼの新しいロットが前の正常に使用ロットに似コラゲナーゼ活性と同一視されている（可能な酵素活性の拡張評価のための材料および方法表中の「コラゲナーゼロット選択ツール」を参照してください）​​。 T一緒aken、タッツ膜の可視化の定量的アプローチは、細胞単離の品質と、その逆の、単離手順の重要なレビューと修正をトリガーするタッツ顕微鏡によって文書化されているように非特異的膜損傷につながる心臓細胞単離に決定的に依存している。細胞単離の品質とタッツ膜の可視化と定量化は本質的にリンクされているので、この記事で説明したプロトコルは、継続的な戦略として、すべての主要な側面をカバーしています。 新たな課題と心臓の研究の共通の課題、細胞の損傷および/ ​​または細胞の損失心筋梗塞9以下、代謝などの介入を損なうことに起因し発生し、まだ細胞単離の間見過ごされて空気塞栓以下、潜在的な偶発的な損傷などに対して判断する必要がある。病気の心臓から心筋細胞の単離は、追加、有意な細胞の損失につながると細胞収量を減少させたことがあります。したがって、comparは細胞の単離とカウントを一貫して標準化されたプロトコルを介して印加された場合の制御と疾患の心の間で分離された完全な細胞の総数のISONは、意味のあることができます。したがって、可能な限り最高の筋細胞単離の品質を反映した適切な対照群を介して、細胞の完全性を判断することが重要である。重要なことは、誤って単離手順によって損傷を受けた筋細胞に対する罹患対個体の細胞質および健康の生細胞の顕微鏡検査は、有意にタッツ膜ネットワークの分析に影響を与え得る。したがって、ここで紹介するプロトコルは、細胞単離と無傷の膜の生細胞顕微鏡検査の際に生理的な膜成分の整合性と安定性を重視しています。ワークフロー全体は、これらは、membran破砕膜細管状分離依存性膜のアーティファクトを示すことになることから、達成し、損傷した細胞を排除しながら、無傷タッツ膜成分を維持するために継続的な戦略として設計されていますEブレブ、および変更されたタッツネットワーク誤って制御条件の下で、さらなる定量分析を損なう。その逆に、同じ戦略はタッツ膜の変化との真の疾患細胞に対する真の健康な間で意味のある比較対照に決定的に依存しタッツ膜を、破壊する可能性を秘めた介入研究のために重要である。 さらに、当社は、AM細胞の技術的にはるかに困難な分離を実現するための手順に対応しています。進歩と改良されたプロトコルにもかかわらず、それがVMとのAM用としても信頼性の低い高品質の細胞単離を再現するのは簡単ではないことを強調することが重要である。これは、VM細胞の損傷の軽度の度合いが比較的高い細胞に細胞懸濁液中のあまり明らかであるかもしれないのに対し、細胞単離の間に、小さなエラーや変動が午前細胞単離の完全な故障につながる可能性があり、AM細胞の全体的に低い収量に起因している番号がAMと比較。 AM細胞は、cになる場合がありますのでステップ4.3の下で概説したように単離した後urved、いくつかのROIを通じて分析が有利であり得る。細胞単離ステップの詳細な手順に従うが、私たちは直接、内在性膜染色および共焦点またはVMとのAM用の両方タッツネットワークのSTEDの超解像イメージングのためのプロトコルを提供する。これらのプロトコルは、以前に確立されたパラメーターによってタッツ膜の選択成分の定量分析と分化の両方を可能にする。仮想マシンと比較すると、3次元組織とのAM心房タッツ·ネットワークの機能的な振る舞いは、現在、あまり理解されている。 生きた細胞の画像タッツ膜への手続きは、（3.1〜3.7ステップ）、市販の共焦点（材料/機器の表）と、カスタムメイドのSTED蛍光顕微鏡9を用いて開発された。蛍光画像生成および定量タッツ分析のための顕微鏡の設定を最適化するために、以下の点は、一般的な重要なものである： <ul><li> 客観的な </strオング&gt; タッツ膜構造、細胞内の深いいくつかのマイクロメーターを中心に目的は、最高の画質を提供し、経験的にテストの細部を解決するために。特定の共焦点顕微鏡は、ここで使用される63X 1.4 NA油対物レンズとは対照的に、水またはグリセロール目的に良好に機能することができる。 100X倍率に目的ナノメートル分解能34小さな視野のトレードオフ、超解像STED顕微鏡に使用されます。 </li><li> 励起とゲイン 励起パワーと検出器利得の最適な設定は、顕微鏡の光路、レーザ性能、およびサンプルの性質に依存する。理想的には、レーザパワーと利得検出器の全範囲を利用する、まだ画像の飽和を回避するように調整される。商業用顕微鏡のソフトウェアパッケージは、通常、ダイナミックレンジの下限と上限を視覚化ルックアップテーブルを提供する。また、可能な限り低いLを採用する色素漂白を最小限にするためにまだ十分な構造タッツ膜の詳細を提供ASERパワー。また、励起パワーは、筋細胞拘縮や死に至る累積光損傷を避けるために十分に低くなければならない。 </li><li> 画素サイズ ナイキストサンプリング、与えられた設定を使用して達成され、約半分の解像度と互換性のピクセルサイズを使用してください。共焦点イメージングのためには100nm×100程度の画素サイズはまた、漂白が制限され、互換性がある。超解像顕微鏡観察のために有意に小さい画素サイズは、STED顕微鏡9のために、例えば 、20ナノメートル×20程度使用される。 </li><li> 休止時間 共焦点顕微鏡は、平均化機能を提供する。一般に、シグナル平均化例と組み合わせて漂白を避けるために、可能な限り最短の画素滞留時間を使用して、ライン平均≥8は、信号対雑音比を改善する。 </li><li> メタデータを介して適用顕微鏡の設定を文書化 にどのように設定したらタッツ膜構造の画像の詳細は、特定の焦点顕微鏡上で安全に最適化されたおよび/または設定（プロトコルメタデータ）を文書化した。同じ目的、励起パワー、ゲイン、画素サイズ、画素滞留時間、および平均化機能を有する細胞の（または間）基（複数）内のすべての画像を取得する。イコール撮影条件は、細胞の（または間）基（複数）内の直接比較および定量を可能にします。 </li><li>一般的なガイダンスおよび共焦点顕微鏡の原理及び用途についての詳細は生物共焦点顕微鏡（ポウリーJB、第3版 、2006年、シュプリンガー·サイエンス+ビジネスメディア、LLC）のハンドブックを参照してください。 </li></ul>ここで紹介する直接分析戦略、タッツ膜および疾患に関連する変化を記述する先の刊行物とは対照的に、フーリエTRANSFに基づく定量的な戦略16,17、または間接的な地域戦略としてT管密度の地域的集約読み出しを使用していたT管コンポーネント規則7を評価するために、横紋膜シグナルのormation分析。これとは対照的に、ここで説明する定量的なアプローチは、直接個別のタッツコンポーネントに関連して、膜ネットワークのプロパティと、細管の割合のような特定のコンポーネントを含む、多くの追加パラメータを提供します。さらに、タッツネットワーク密度は、ROI面積当たりの全体の抽出骨格の正規化された長さとして定量化することができる。 3個体の三重接合の数、連続的に接続された細管のコンポーネントはタッツ膜網の分岐の複雑さの尺度として用いることができる。当社は、最小のタッツのコンポーネントのいずれかの分析は染色手順に依存していることに注意してください。われわれの経験では、50μMのジ- 8 - ANEPPS液800μlの50,000 VMセル9を含む細胞ペレットに完全タッツ網を染色するのに十分である。しかし、細胞ペレットは心筋細胞のより低い番号が含まれている場合、強力な蛍光検出器が利用可能である場合、および最小の膜の詳細および量的変化に関心があるのではなく、全体のタッツのネットワーク配信の共焦点イメージング、低い染料濃度は、経験的なテストに基づいて使用してもよいかどう。最後に、記載の分析用に書かれたソフトウェアマクロは異なる治療群（ 例えば 、薬物）、細胞型間の比較のために特に有用である大きなデータセットの分析を容易にする画像処理工程を自動化するために使用することができる（ 例えば 、VMに対するAM ）、および病態生理学的介入（ 例えば 、心筋梗塞に対する偽）。 タッツネットワークの画像分析のために、原則として以下の一連のステップが適用される：1）ローリングボール背景減算（4.5.1）は、バックグラウンド強度の空間的変動を除去すること; 2）局所的コントラスト強調（4.5.2）。 3）画像の平滑化（4.5.3）; 4）統計的な地域のマージ（4.5.4）; 5）を定義する画像2値化のしきい値（4.5.6）;および6）スケルトンデータの計算（4.5.8）。蛍光タッツ画像のスケルトン化の間の重要なステップは、 図6に示す画像2値化ある。関連する閾値化ステップは、最終的に真の膜構造は、バックグラウンドノイズからのエラーによって識別潜在的に誤った構造に対して、基礎となるタッツコンポーネントを表すために検出されるかを定義する。バイナリ画像解析のための正確な閾値の同定は、共焦点と超解像顕微鏡法のアプローチのための十分に高い信号対雑音（SNR）比それぞれに依存する真タッツ膜構造と対応すべきである。そのため、十分な画質が最初に確立し、続いて概説したように、明視野画像によるドキュメントを含む個別のセルの品質の重要な判断と組み合わせる必要がある。代替所与顕微鏡データ出力のための画像分割プロトコルを適応させるオプションおよび/または物理ポートiologicalの質問は、画像デコンボリューションとImageJのプラグインとして利用可能な「大津」や「磯·データ」のような他のしきい値処理手順を含む。かかわらず、最終的なセグメンテーション手順は、イメージオーバーレイによって抽出された生データとの比較必須の品質制御ステップを考える。要約すると、個別の単離された筋細胞、細胞内タッツ膜の十分な染色、蛍光イメージングのためのパラメータの最適化、及び抽出されたスケルトンデータのオーバレイ制御の形態学的および膜完全性は、全ての蛍光タッツ画像と定量結果の品質に貢献する。 マウスよりも大きな種は細胞単離のために使用される場合、プロトコルは、容易に適切に適合させることができる。次に大きな種については、ラットの心臓は鈍い14 Gカニューレ（外径2.1ミリメートル）でカニューレすることができ、/分8ミリリットルで灌流。大幅に古いまたは病気の心はさらに大きなカニューレのサイズが必要な場合があります。遺伝子で梅毒、心臓灌流は、リザーバと大動脈の間、または蠕動ポンプを用いて一定流量を1メートルの高さの水柱を使用して、一定の圧力、例えばいずれかによって行うことができる。コラゲナーゼ消化が最終的に一定流量プロトコルによってある程度制御される血管床を漏れるの過度の灌流速度につながる冠動脈抵抗血管が中断されているので、マウスやラット一定の流れのような小さな齧歯類の心からの細胞単離のために有利な場合がある。流速、正しい挿管の監視が変化した血管抵抗挙動による介入モデルに対するならびに細胞単離手順の訓練のために有利である優先度である場合とは対照的に、定圧潅流が有利である。 上記で概説したように、十分な細胞質は、内在性膜系の定量的研究のために非常に重要である。しかし、心臓の灌流およびコラゲナーゼ消化中に非常に多くの要因が、CRができるiticallyプロトコルの最適化やトラブル27を撮影中に過小評価してはならない細胞単離の品質に影響を与えます。特に、与えられたコラゲナーゼロットの活性は、研究の残りを通じて維持されるべき関心例えば 、心房又は単離条件を確立するために実験的な善意の研究の実行前に、心室の特定の組織のために決定されるべきである。また、灌流セットアップの水質、pH、温度、最適化、および洗浄は、汚染物質および塞栓から不注意による損傷のリスクを最小限にし、潜在的に追加の因子は、細胞単離の間に最適な恒常性の条件を確立するために監視されなければならない。 BDM（2,3 - ブタンジオン-モノオキシム）ミオシンの可逆的阻害剤のクロスブリッジATPアーゼは、一般に、細胞単離物の収率を増加させる心筋の弛緩を維持するために、組織の切開、消化中に使用される。それにもかかわらず、研究者らは、Tが必要ですO BDMはオフターゲット効果など 、一定の条件の下で33のNa + / Ca比2 +交換電流の阻害をもたらす非特異的ホスファターゼ活性を発揮し得ることに注意してください。いくつかの実験のために、心筋保護液、しかし、毒性、比較的高価であり、その他のオフターゲット効果を有することができるマイクロモル濃度でのミオシンに対して高い親和性を有する阻害剤としてブレビスタチンによってBDMを交換することが有利かもしれない。一休み健全な心筋細胞を、さらなる分析から除外すべき電気刺激およびそのような細胞の非存在下でのあらゆる収縮を示さないようにしてください。一方、生理的な細胞外Ca 2 +濃度における電気刺激に応答した心筋細胞の収縮と弛緩に、健康な対照に対する心臓疾患における機能性細胞質および/ ​​または異常な挙動を評価するための追加対策として、通常の収縮挙動を確立するために使用することができ細胞。 9タッツ膜ネットワークの共焦点と超解像顕微鏡に適用し、AMれた細胞21だけでなく、微小管ネットワークの定量分析固定された心筋細胞（データは示さず）。プロトコルのこれらのおよび将来のアプリケーションは、ドメイン固有のシグナリングを、異なる発生段階のタッツ膜の特性評価や高度に局在化を発揮するタッツネットワークに連絡して、膜関連タンパク質または細胞小器官の構造の解析などの実験さまざまな質問のための道を開くことがありますAMおよびVM細胞内で機能します。

健康的な横紋筋細胞では、メインセル軸に垂直な「横」配向（T管）を有する管状の膜構造が豊富である。したがって、T-細管深くセルの中心に向かって細胞質ゾルに侵入筋細胞メイン「横方向」表面膜（筋細胞膜）の連続的な拡張、として特徴付けられている。外表面膜を有する連続T管の生理的役割は、電位活性化L型Caのナノメートルの近接結合による比較的大きな心筋細胞の体積全体のSERオルガネラコンタクトドメインによって形成された遠隔細胞内区画の急速な電気的結合2+チャンネル隣接するリアノジン受容体（RyR2の）SERのCa 2 +放出を活性化電流（I Ca）の内向き（Cav1.2）。心室筋細胞（VMS）、接合部のSERドメインとTとの間の非連続膜に接触する（「ジャンクショ​​ン」）では、-tubulesは、各セル1に個別の細胞内Ca 2 +放出のナノドメインの数千を制御すると考えられている。 任意の連絡先ドメインでは、並置された膜部分T管と周辺（接合部）SERのそれぞれが、それ故にナノドメインとして定義され、互いに近接15nm程度である。これにより、非常に小さな個別の細胞質の部分空間は、準細胞自律的コンパートメントの動作を可能にする分離される。着信活動電位が作動すると、現在の内向きのVM、比較的小さいのCa 2 +の T管におけるCav1.2チャンネルが急速にattoliterサイズのナノドメイン1での[Ca 2 +]、Sの部分空間のCa 2 +濃度が増加します。次に、の[Ca 2 +] Sの増加は、並置されたSER膜接合にナノメートル近傍内のCa 2 + -gatedリアノジン受容体（RyR2の）を活性化し、この結合プロセスは、すべての電気的に結合を通して起こるd個の筋細胞ナノドメイン。 RyR2sは5-10のRyR2チャネル2用の1 Cav1.2チャネルの推定化学量論と同様に、高密度のマルチチャンネルクラスターを発生する。 SER対細胞質ゾル以来の[Ca 2 +]勾配は（比率10 4：1）非常に急峻で定量的に大規模な内CaのRyR2活性化の結果、およびRyR2s機能機能的に結合されたクラスタ内の高コンダクタンスのCa 2 +の放出チャンネル2 + T管からの放出電流は1〜2ミリ秒3,4内は100μM以上にローカル部分空間の[Ca 2 +] Sを増やす接合SERドメインを結合されている。この心臓信号増幅動作は、のCa 2 +誘発性のCa 2 +放出（CICR）と呼ばれる。まとめると、T管は急速に興奮収縮（EC）カップリングの間接合ナノドメインのSERの接点を介してのCa 2 +の放出信号を活性化し、細胞全体のCICR ​​不可欠膜構造である。 T-細管に加えて、軸方向の尿細管メイン（縦）細胞軸に有意差が平行な配向での（A-細管）は、電子顕微鏡（EM）、共焦点及び2光子顕微鏡研究によって実証されている。例えば、サルコメアのZラインに近いT管と相互接続筋原線維間に、尿細管の細胞全体の継続的な格子は、細胞外トレーサーと固定モルモットのVM 5のEMイメージングによって示された。細胞外デキストラン連動フルオレセイン染色を使用し、ラットVMの2光子イメージングを生きる、複雑な網状3D細管ネットワークは〜60％のT管と約40％のA-細管6からなる可視化した。本研究では、豊富なA-細管の3D可視化するだけでなく、EMの可視化のために、切片は、本質的に横軸細管システム（タッツ）のような複雑で動的な膜ネットワークの解析のために制限されているという認識につながっただけでなく、。したがって、直接ジ8 ANNEPSで染色タッツ膜の共焦点生細胞イメージングを開発した。生細胞の場合タッツネットワークは、フーリエ変換によって分析され、サルコメアZ-ライン近傍の空間におけるT-細管成分の定期的な外観は、横紋信号7の領域からのアンサンブルパワースペクトルによって反射される。この間接的な分析戦略は、疾患モデル7におけるタッツコンポーネントの規則でセル全体の地域の変化を検出するために使用されている。例えば、shRNAを仲介junctophilin-2のノックダウンは、心不全やアイソフォーム特異的なタンパク質欠損はナノドメインのCa 2 +の放出機能障害8とT管の再編成をもたらしました。私たちは最近、直接、定量的なアプローチを通じて、さらに誘導放出枯渇（STED）ナノスコピー9を用いて、マウスのVM内の個別タッツ·コンポーネントの生細胞の超解像顕微鏡によってタッツ膜ネットワークの解析を高めています。横の50:50分布に近似より小さい個別のタッツ·コンポーネントの直接分析のために許可されたナノメートル画像の解像度、アキシャル細管の向きに対して、定量的に健康なマウス心臓9内の2つの豊富な、まだ差別的指向の個別のタッツ·コンポーネントを確認した。これらの戦略は、さらに以下のプロトコルのセクションで説明されます。 成体心臓に豊富A-細管部品の生理的役割は謎のままであったが、EM研究は、モルモットとラットのVM 5,10において内因性のCa 2 +の放出ナノドメインを示唆し、細管に関連したSER膜構造を報告している。 Cav1.2及びRyR2の共焦点分析は、A-細管ジャンクション10で共局在度の高い発見した。 VMがT管は一般的に発生するZ線の条線から比較的離れて発信したラットに自発のCa 2 +スパークの〜20％以来、1番目の引数は、細管に関連するナノドメインが実際に存在し、機能し得ることであったのCa 2 +の放出サイトなど11,12。興味深いことに、T-細管形成及び成熟OCP5での前駆筋細胞膜陥入の萌芽と未熟を通じてのみ生後CURSおよび心臓細胞の増殖に匹敵する、 例えば 、マウス13でP10でタッツネットワークアセンブリを分岐した。これは、遅れたのCa 2 +放出および未熟A-細管支配のアーキテクチャと一致して病的なタッツ組織につながるSER接合部にT管膜の固着を防止するshRNAノックダウンするのでJunctophilin-2は生後タッツ·ネットワーク·成熟のために特に重要であると思われる仮想マシン13。これらの観察結果は、最終的には、概念実証T管の追加やさえ代替細胞内のメカニズム14を通じてモーフィングも、細管のに対し、膜陥入過程を通じて形成につながる可能性があります。 心臓病でのタッツの膜の変化の特徴付け病態生理学的な質問のための重要な研究領域となっています。ペーシング誘発性の心臓の犬モデルにおける初期のレポートfailu再T-細管およびCav1.2電流（I Ca）の 15の損失を示した。虚血性心筋症のブタモデルは、T管の密度の低下を示した、細胞内のCa減少同期は16をリリース2+。心不全の自然発症高血圧ラット（SHR）モデルを用いて、T管の損失は「孤立のRyR2」の提案されたメカニズムによってCav1.2及びRyR2の減少したナノドメイン結合と関連していた7。 T-細管の損失はまた、虚血性拡張型心筋症、および肥大型心筋症試料17からのヒトのVMに示されている。さらに、細管の増加は、ヒト拡張型心筋18の組織切片で報告された。心筋梗塞の後、私たちは、細管部品9の増加するとは対照的に、T管の有意な低下とマウスのVMにおけるタッツ再編の差動機構を示した。重要なことは、改良されたローカルの膜コントラストは、生細胞superreを通じて達成ソリューションSTED顕微鏡タッツネットワーク長の全体的な増加にA-細管の有意な増殖を示したと複雑9分岐直接的な測定を通じて、詳細な定量的な成分分析を可能にした。また、心筋梗塞19の後および心臓再同期療法が心房tachypacing誘起心不全20の犬にT管のリモデリングを逆転させる可能性があることをラットでのT管リモデリングを逆転得るよう運動トレーニングを示された。プロトコールに概説され、以下のセクションで結果としてまとめると、病気のヒトおよび動物のVMだけでなく、潜在的な治療的介入の両方の研究は間違いなく高品質の細胞単離手順や詳細な定量分析戦略の恩​​恵を受ける。 KATPチャネルのタッツの膜輸送は21アイソフォームに対するさらに、側面が最近実証されるように、心房メートルを考慮することが重要であるyocytes生物学的に明確なだけでなく、仮想マシンに対する比較心臓細胞モデルとして（AMS）。 T管は、最近羊と人間のAM 22に記載されていた。現在の証拠は、いくつかのT管は23羊と人間のような大型哺乳動物におけるではなく、小型げっ歯類、典型的には、AM細胞に存在し、ことを示唆している。仮想マシンとは対照的に、AMは細胞内のCa 2 +放出は、マークの空間的および時間的のCa 2 +の勾配23を生じる細胞の中心に向かって拡散により細胞表面を伝搬するから生じるように見える。この枠組みの中で、このような心房細動24などの一般的な病気の形態のための細胞内Ca 2 +シグナル伝達の不安定性の機構を解明することが重要と思われる。要約すると、健康で病気の心のために両方のAMとVM細胞単離、それぞれが一般的なプロトコルを採用している。十分な細胞品質の顕微鏡の資料によって判断されるように細胞の単離が適切に行われている場合にのみ、AMおよびVMサンプルはCAであるべき定量的タッツ分析のために前進rried。従って、以下のプロトコルのセクションでは、マウスまたは無傷タッツ膜を分析するために、生細胞顕微鏡に続く他の種から分離された高品質のセルに決定的に依存している。以前に指摘したように、タッツ膜の特性評価は、固定と準備アーティファクト6、浸透圧の変更に起因する膜の変化、および従来の光学顕微鏡9の分解能の限界のための傾向と挑戦的な研究領域である。私たちは、Ca 2 +イメージングとパッチクランプ用の細胞培養のためのラットのVMの人間のAMの単離のための最近の最先端のプロトコルが以前にこのジャーナル25,26に掲載されていることに注意してください。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1552">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Chemicals and enzymes</td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td style="width:759px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">2,3-Butanedione monoxime</td>
			<td style="width:376px;">Sigma-Aldrich, Munich, Germany</td>
			<td style="width:113px;">B0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Bovine calf serum</td>
			<td style="width:376px;">Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td>
			<td style="width:113px;">SH30073</td>
			<td>Triple 0.1 &#181;m sterile filtered.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">CaCl2</td>
			<td style="width:376px;">Sigma-Aldrich, Munich, Germany</td>
			<td style="width:113px;">21115</td>
			<td style="width:759px;">Diluted 1:10 in MQ water to obtain 100 mM CaCl2 stock concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Collagenase type II</td>
			<td style="width:376px;">Worthington via Cell Systems, Troisdorf, Germany</td>
			<td style="width:113px;">on request</td>
			<td>Enzymatic activity depends on individual collagenase batches. Collagenase II&#160; and other enzyme activities (Caseinase, Clostripain, Tryptic) can be assessed in the &#34;collagenase lot selection tool&#34;. Determine cell yield and quality individually for each new lot of collagenase.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Glucose</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">HN06.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Heparin</td>
			<td style="width:376px;">Rotexmedica, Trittau, Germany</td>
			<td style="width:113px;">PZN-03862340</td>
			<td>Diluted in 0,9 % NaCl and injected subcutaneuosly in abdominal skin.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">HEPES</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">9105.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Forene 100% (V/V)</td>
			<td style="width:376px;">Abbott, Libertyville, IL, USA</td>
			<td style="width:113px;">B506</td>
			<td>Active agent: isoflurane, 250 ml. Use approximately 2 Vol% in air/oxygen dispenser instrument.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">KCl</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">6781.3</td>
			<td style="width:759px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">3904.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Laminin (2 mg/ml)</td>
			<td style="width:376px;">BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:113px;">354232</td>
			<td>Lamination is described under step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">MgCl2 &#183; 6 H2O</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">2189.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">MgSO4 &#183; 7 H2O</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">8283.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Na2HPO4 &#183; 2 H2O</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">4984.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">HN01.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Taurin</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">4721.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;"></td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Dyes</td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Di-8-ANEPPS</td>
			<td>Molecular Probes, Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:113px;">D-3167</td>
			<td>Stock solution 2 mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:376px;">Sigma-Aldrich, Munich, Germany</td>
			<td style="width:113px;">T8154</td>
			<td>Trypan blue is gently mixed 1:1 via tip-cut 1 ml plastic pipette with cell suspension prior to cell counting in Neubauer cytometer.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;"></td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Langendorff perfusion setup</td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Circulation thermostat</td>
			<td style="width:376px;">Lauda, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>Please refer to Louch et al. (JMCC 2011). Heat up thermostat und buffers in perfusion tubing to 37 &#176;C 15 min prior to use.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Flexible silicone tubing Tygon for peristaltic pump</td>
			<td style="width:376px;">VWR, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:113px;">224-2252</td>
			<td rowspan="2">Tubing needs to be changed regularly.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Flexible silicone tubing Tygon for thermostat</td>
			<td style="width:376px;">VWR, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:113px;">228-4340</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:304px;">Heating coil surroundung perfusion tubing</td>
			<td style="width:376px;">Rettberg, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td style="width:113px;">custom-made</td>
			<td style="width:759px;">Heating coil and tubing needs to be cleaned thoroughly via MQ water after using. Do not use detergents. Glass components should be bathed regularly&#160; in 10 mM NaOH overnight.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:376px;">Ismatec, Wertheim, Germany</td>
			<td style="width:113px;">ISM830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Three way stop cock Discofix C Luer Lock 10 cm</td>
			<td style="width:376px;">Braun, Melsungen, Switzerland</td>
			<td style="width:113px;">16500C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Three way stop cock Discofix 3SC</td>
			<td style="width:376px;">Braun, Melsungen, Switzerland</td>
			<td style="width:113px;">4095146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;"></td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Instruments</td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">42 mm glass coverslips</td>
			<td style="width:376px;">Menzel Gl&#228;ser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td>
			<td style="width:113px;">on request</td>
			<td>0.13 - 0.16 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Cannula 21G</td>
			<td style="width:376px;">Becton, Dickinson and Company, Franklin Lake, NY, USA</td>
			<td style="width:113px;">304432</td>
			<td>Cut to a length of ~ 5 mm, roughened with sandpaper.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Coverslips for Neubauer cytometer 24 x 24 mm</td>
			<td style="width:376px;">Menzel Gl&#228;ser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td>
			<td style="width:113px;">on request</td>
			<td>0.38 - 0.42 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Graefe forceps, 0.5 mm tips, slight curve</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11151-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">LSM 710 NLO</td>
			<td style="width:376px;">Carl Zeiss, Jena, Germany</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>63x 1.4 NA oil objective</td>
		</tr>
		<tr height="124">
			<td height="124" style="height:124px;width:304px;">Neubauer improved cytometer</td>
			<td style="width:376px;">Labor Optik, Friedrichsdorf, Germany</td>
			<td style="width:113px;">1100000</td>
			<td style="width:759px;">Counting procedure: Wipe cytometer and coverslip provided with the counting chamber with 70 % ethanol. Press coverslip gently on the counting chamber so that the two glass surfaces are in contact and Newton&#39;s rings can be observed. Subsequently, 10 - 20 &#181;l cell suspension can be applied to the edge of the coverslip to be sucked into the void by capillary action. Count the intact vs. defect myocytes using the squares of the cytometer grid which reflects 100 nl. Repeat counting procedure on the second grid provided on the cytometer. Calculate the density of cells in your original cell suspension by taking account of any dlutions and counting shortcuts.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">POC-R2 Imaging Chamber</td>
			<td style="width:376px;">Pecon, Erbach, Germany</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>Cell suspension volume: 800 &#181;l; desired plating density: ~ 1000 AM and ~ 10,000 VM</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Spring scissors, 8 mm blades straight, blunt</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:113px;">15025-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Student dumont #7 forceps, inox</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>91197-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Student iris scissors, curved, 11.5 cm</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>91461-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Student iris scissors, straight, 11.5 cm</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Student surcigal scissors, straight, sharp, 12 cm</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>91402-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Tissue forceps, 1x2 teeth, slim, 10 cm</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11023-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of tubular membrane networks in cardiac myocytes from atria and ventricles

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. While the outer surface membrane and associated TATS membrane components appear to be continuous, there are substantial differences in lipid and protein content. In ventricular myocytes (VMs), certain TATS components are highly abundant contributing to rectilinear tubule networks and regular branching 3D architectures. It is thought that peripheral TATS components propagate action potentials from the cell surface to thousands of remote intracellular sarcoendoplasmic reticulum (SER) membrane contact domains, thereby activating intracellular Ca2+ release units (CRUs). In contrast to VMs, the organization and functional role of TATS membranes in atrial myocytes (AMs) is significantly different and much less understood. Taken together, quantitative structural characterization of TATS membrane networks in healthy and diseased myocytes is an essential prerequisite towards better understanding of functional plasticity and pathophysiological reorganization. Here, we present a strategic combination of protocols for direct quantitative analysis of TATS membrane networks in living VMs and AMs. For this, we accompany primary cell isolations of mouse VMs and/or AMs with critical quality control steps and direct membrane staining protocols for fluorescence imaging of TATS membranes. Using an optimized workflow for confocal or superresolution TATS image processing, binarized and skeletonized data are generated for quantitative analysis of the TATS network and its components. Unlike previously published indirect regional aggregate image analysis strategies, our protocols enable direct characterization of specific components and derive complex physiological properties of TATS membrane networks in living myocytes with high throughput and open access software tools. In summary, the combined protocol strategy can be readily applied for quantitative TATS network studies during physiological myocyte adaptation or disease changes, comparison of different cardiac or skeletal muscle cell types, phenotyping of transgenic models, and pharmacological or therapeutic interventions.

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Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

心筋細胞では、管状の膜構造は、細胞内のネットワークを形成している。私たちは、品質管理、最先端の蛍光顕微鏡用ii）の生細胞染色を含むマウスの心臓から心筋細胞のi）の単離のためのプロトコルを最適化について説明し、およびiii）直接画像解析は、コンポーネントの複雑さおよび細胞内膜の可塑性を定量化するネットワーク。

心房と心室から心筋細胞における管状膜ネットワークの解析

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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