Name: analysis of tubular membrane networks in cardiac myocytes from atria and ventricles
Uploaded: 2014-10-15T13:00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles at JoVE.com

This work received support through Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 1002 (subprojects A05 and B05 to S.E.L.) and KFO 155 (subproject 4 to S.E.L.), a Halbach Foundation award to S.E.L. supporting E.W.; a grant from the German Cardiac Society to S.B.; and a DAAD exchange program supporting T.K. as visitor at the University of Maryland. The research leading to these results has received funding from the European Community&#8217;s Seventh Framework Program FP7/2007-2013 under grant agreement No. HEALTH-F2-2009-241526, EUTrigTreat (to S.E.L.). S.E.L. is a principal investigator of the German Center of Cardiovascular Research (DZHK).

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	<li>Prosser, B. L., Ward, C. W., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+Ca2++signaling+in+the+heart+the+role+of+ryanodine+receptor+sensitivity.">Subcellular Ca2+ signaling in the heart the role of ryanodine receptor sensitivity.</a> J Gen Physiol. 136 (2), 135-142 (2010).</li><li>Wehrens, X. H., Lehnart, S. E., Marks, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+release+and+cardiac+disease.">Intracellular calcium release and cardiac disease.</a> Annu Rev Physiol. 67, 69-98 (2005).</li><li>Cheng, H., Cannell, M. B., Lederer, W. 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The authors declare that no conflict of interest exists.

심장 근세포 절연 및 32 년간 연구되어 왔지만, 최근의 리뷰가 일관된 고품질 근세포 절연 부 (27)가 도전 남아 있다고 결론 지었다. 이것은 힘? 힘 공통 표준 접근의 부족, 공유 메타 데이터 및 투명 세포 품질의 문서 기본 심장 근육 세포의 분리를위한 상대적으로 복잡한 프로토콜을 반영한다. 세포 격리 프로토콜은 일반적으로 개별 그룹에 의해 정의되고, 세포 분리의 변수 결과를 생산 개별 모델 설정 (예를 들어, 종, 연령, 공존 심장 조건)에 따라, 일반적으로 특정 실험 조건에 대한 조정됩니다. 멤브레인 연구 및 프로토콜이 여기에 제시된 정량적 TATS, 품질 평가 및 문서의 필수 레벨의 컨텍스트 내에서 대사 및 분리 프로토콜에 따라 변화하는 경향이 개별 세포막 구조 또는 공 초점 현미경에 관한 수퍼 해상도 모두AM 또는 VM에서. 중요한 것은, 세포 분리의 높은 수익률이 건강한 그대로 근육 세포를 제안하더라도, 연구자들은 문서화하고 비판적으로 인한 다른 유형에 특정 변경 대 격리 절차의 비 특정 손상에 비해 표면과 TATS 막 무결성의 형태 학적 기준에 따라 신중하게 각각의 셀을 판단 할 필요가 중재의 같은 조건을 제어하는​​ 비교. 심장 세포 격리 중 중요한 변수는 소정의 콜라게나 많은 특정 활동이다. 콜라겐의 새로운 많이 선택하려면 몇 가지 콜라겐 시료의 효소 활성은 심장 근육 세포 수율과 품질을 평가하고, 제조사의 지시에 따라 서로에 대해 테스트해야합니다. 이상적으로, 콜라겐의 새로운 많은이 이전 성공적으로 사용을 많이 유사한 콜라게나 제 활성을 식별된다 (가능한 효소 활동의 확장 된 평가 대상 및 방법 테이블에서 &quot;콜라게나 많은 선택 도구&quot;참조). T함께 AKEN, TATS 막 시각화의 정량적 접근 방법은 세포 격리 품질과, 그 반대의 분리 절차의 중요한 검토 및 수정을 트리거해야 TATS 현미경으로 설명 된대로 불특정 막 손상으로 이어지는 심장 세포 절연 부에 결정적으로 의존한다. 세포 격리 품질과 TATS 막 시각화 및 정량화가 본질적으로 연결되어 있기 때문에,이 문서에서 설명하는 프로토콜은 연속적인 전략으로 모든 주요 측면을 커버합니다. 추가 과제 및 심장 연구, 세포 손상 및 / 또는 세포 손실 일반적인 문제는 심근 경색 9 다음 대사 저해 개입 등으로 인하여 발생할 아직 세포 격리 중 주목 공기 색전증 다음, 전위 부주의 한 파손 등 대해 판단 할 필요가있다. 병든 마음에서 심장 근육 세포의 분리는 추가로 상당한 세포 손실로 이어질 세포 수율을 감소 할 수 있습니다. 따라서, 비교 예세포 격리 및 카운팅 일관 표준화 된 프로토콜을 통해인가되는 경우 제어 및 심장 질병 간의 절연 손상 세포의 총수의 ISON은 의미가있을 수있다. 결과적으로, 최상의 심근 세포 격리 품질을 반영 적절한 대조군을 통해 셀의 무결성을 판단하는 것이 중요하다. 중요한 것은 각각의 셀의 품질과 비교 근세포 또는 질병 건강의 생균 현미경 부주의 크게 TATS 막 네트워크의 분석에 영향을 미칠 수있는 분리 절차에 의해 손상. 여기에 제시된 프로토콜에 따라서 세포 격리 및 양막의 생균 생리 현미경 중에 막 요소의 무결성과 안정성을 강조한다. 전체 흐름은 이러한, membran 파쇄 막 세뇨관 같은 분리 멤브레인 종속 아티팩트를 나타낼 것이기 때문에, 달성하고 손상된 세포를 제외한 상태 그대로 TATS 세포막 성분을 보존하기 위해 연속적으로 설계 전략전자 기흉 및 변경된 TATS 네트워크 잘못 양적 분석 제어 조건에서 타협. 부사장은 반대, 같은 전략은 TATS 막 변경 사실 병에 걸린 세포에 비해 진정한 건강 사이의 의미있는 비교 컨트롤에 결정적으로 의존 TATS 멤브레인을 방해 할 가능성이있는 중재 연구에 중요하다. 또, AM 세포의 기술적 훨씬 더 도전 격리를 달성하는 절차를 다룬다. 진보 및 개선 된 프로토콜에도 불구하고, 그것의 VM 고품질 셀 아이솔레이션을 재현 사소한 심지어 덜 신뢰할 AMS 대없는 것을 강조하는 것이 중요하다. 이것은 VM 세포 손상의 순한 정도 인해 상대적으로 높은 세포에 세포 현탁액 덜 명백 할 수도있는 반면, 세포 격리 중에도 작은 오차 또는 변형이 AM 세포 분리의 완전한 고장으로 이어질 수 AM 세포의 전반적인 낮은 수율로 인해 숫자는 오전에 비해. AM 셀 C가 될 수 있으므로단계 4.3에서 설명 된대로 분리 한 후 urved 여러 ROI를 통해 분석이 유용 할 수 있습니다. 세포 격리 단계의 세부 절차에 따라, 우리는 직접 세포막 염색 및 공 초점 또는 VM 및 AMS 모두 TATS 네트워크의 STED 수퍼 해상도의 영상을위한 프로토콜을 제공합니다. 이러한 프로토콜은 이전에 설정된 매개 변수를 통해 양적 분석과 TATS 세포막의 구성 요소 선택의 차별화를 할 수 있습니다. VM에 비해, 3 차원 조직 및 AMS의 심방 TATS 네트워크의 기능적 동작은 현재 덜 이해된다. 살아있는 세포에서 이미지 TATS 막에 대한 절차는 (3.7 3.1 단계) 상업 공 초점 (자재 / 장비의 표)와 맞춤 STED 형광 현미경 9로 개발되었다. 형광 화상 생성 TATS 및 정량 분석​​을위한 현미경 설정을 최적화하기 위해, 다음과 같은 점은 일반적으로 중요하다 : <ul><li> 목표 </str옹&gt; 경험적으로, TATS 막 구조의 세부 사항을 해결 작은 셀 깊은 몇 마이크로 미터를 포커싱하는 동안 높은 이미지 품질을 제공하는 객관적인 테스트하기 위해. 특정 공 초점 현미경 여기에 사용 63X 1.4 NA 오일 목적 대조적으로, 물이나 글리세롤 목표에 더 잘 수행 할 수있다. 100X 배율의 목표는 나노 미터 해상도 34에 작은 시야각을 거래, 수퍼 해상도 STED 현미경에 사용됩니다. </li><li> 여기 및 이득 여기 전력 검출기 이득의 최적 설정은 현미경 광로 레이저 성능 및 샘플 특성에 의존한다. 이상적으로는, 레이저 출력과 이득은 검출기의 전체 범위를 활용하면서도 화상 포화를 피하기 위해 조정된다. 현미경 상용 소프트웨어 패키지는 일반적으로 동적 범위의 하한 및 상한을 시각화 룩업 테이블을 제공한다. 또한, 염료 표백 최저 리터를 사용 최소화아직 충분한 구조 TATS 막 세부 사항을 제공 aser 전원. 또한, 구동 전력은 심근 경축 및 죽음에 이르는 누적 사진 손상을 방지하도록 충분히 낮아야한다. </li><li> 픽셀 크기 나이 퀴 스트 (Nyquist) 샘플링과 호환되는 픽셀 크기, 주어진 설정으로 달성 절반 정도의 해상도를 사용합니다. 촛점 촬상 100 nm의 X 100nm의 픽셀 크기는 표백 제한되는, 호환된다. 수퍼 해상도 현미경은 상당히 작은 픽셀 크기는 STED 현미경 9 예를 들어, 20 나노 미터 × 20 nm의 사용됩니다. </li><li> 전환 시간 공 초점 현미경 평균화 기능을 제공한다. 일반적으로, 신호 평균화 예와 조합 표백 않도록 최단 화소 체류 시간을 사용하여, 라인 평균 ≥ 8은 신호 - 대 - 잡음 비율을 향상시키기 위해. </li><li> 메타 데이터를 통해 응용 현미경 설정을 문서화 에 어떻게 설정되면TATS 막 구조의 이미지 세부 사항은 특정 공 초점 현미경에 안전 최적화 및 / 또는 설정 (프로토콜 메타 데이터)를 문서화 하였다. 같은 목적, 여기 전력, 이득, 픽셀 크기, 픽셀 체류 시간, 평균 기능 세포의 (또는 사이) 그룹 (들) 내의 모든 이미지를 획득. 평등 이미징 조건은 세포의 (또는과) 그룹 (들) 내에서 직접 비교하고 정량 할 수 있습니다. </li><li> 일반적인 지침과 원칙 및 공 초점 현미경의 응용 프로그램에 대한 자세한 사항은 생물 공 초점 현미경 (Pawley JB, 제 3 판, 2006, 스프링 과학 + 비즈니스 미디어, LLC)의 핸드북을 참조하십시오. </li></ul> 여기에 제시된 직접 분석 전략, TATS 막과 질병 관련 변경 사항을 설명하는 이전의 출판물과는 달리 푸리에 TRANSF에 따라 양적 전략 16, 17, 또는 간접적으로 지역 전략으로 T-세관 밀도의 지역 집계 판독을 사용했다T-세뇨관 성분 7 규칙 성을 평가하기 위해, 선 형상의 막 신호 ormation 분석. 대조적으로, 여기에서 설명하는 양적 접근 방식은 직접 개별 TATS의 구성 요소와 관련된 멤브레인 네트워크 특성과​​ A-세관의 비율과 같은 특정 구성 요소를 포함하여 추가 매개 변수를 제공한다. 또한, TATS 네트워크 밀도는 ROI 면적당 전체 추출 골격의 길이로 정규화 정량화 될 수있다. 세 개인의 삼중 접합의 개수는 연속적으로 연결된 세뇨관 성분은 TATS 막 네트워크 분파 복잡도의 측정치로서 사용될 수있다. 우리는 작은 TATS 구성 요소의 분석은 염색 절차에 따라 있습니다. 우리의 경험에 의하면, 50 μM 디 - 8 - ANEPPS 용액 800 μL은 50,000 VM 세포 구를 포함하는 세포 펠렛에 완료 TATS 네트워크를 염색하기에 충분하다. 그러나, 세포 펠렛은 심장 근육 세포의 낮은 숫자가 포함 된 경우강력한 형광 검출기를 사용할 수 있으며, 경우에 작은 막 자세한 내용 및 양적 변화가 관심있는 것이 아니라 전체 TATS 네트워크 분포의 공 초점 이미징, 낮은 염료 농도는 실제 테스트를 기반으로 사용할 수있다합니다. 마지막으로, 설명 된 분석 용으로 작성된 소프트웨어 매크로 다른 처리 군 (예를 들면, 약물), 세포 유형 간의 비교를 위해 특히 유용하다 더 큰 데이터 세트의 분석을 용이하게하는 화상 처리 단계를 자동화하는데 사용될 수있다 (예를 들면, VM 대 AM ) 및 병태 생리 학적 개입 (예를 들어, 심근 경색 대 가짜). TATS 네트워크의 화상 분석을 위해, 원칙적으로 다음과 같은 일련의 단계가 적용된다 : 1) 압연 공 배경 차감 (4.5.1)이 배경 강도의 공간적 변화를 제거하는 단계; 2) 지역 대비 향상 (4.5.2).; 3) 이미지 다듬기 (4.5.3); 4) 통계 영역 병합 (4.5.4); 5) 정의이미지 이진화의 임계 값 (4.5.6); 골격 데이터 및 6) 계산 (4.5.8). 형광 TATS 화상의 골격 화 동안 중요한 단계는도 6에 도시 된 이미지 이진화이다. 연관된 임계 단계 궁극적 진정한 막 구조가 배경 잡음에서 에러로 식별 잠재적으로 잘못된 구조 대 기초 TATS 성분을 나타내는 검출 된 정의한다. 바이너리 이미지 분석을위한 정확한 임계 값의 식별은 공 초점 현미경 및 수퍼 해상도 접근법위한 충분히 높은 신호 - 대 - 잡음 (SNR)에 따라 각 비율에 해당 TATS 막 구조와 일치한다. 따라서, 충분한 화상 품질이 제 명시된이어서 시야 화상에 의해 문서를 포함 개별 셀의 품질 판단의 임계 결합이 확립되어야한다. 다른 옵션은 주어진 현미경 데이터 출력 및 / 또는 PHY들에 대한 이미지 분할 프로토콜 적응학적 질문 이미지 디컨 볼 루션과 ImageJ에 플러그인으로 사용할 수 &quot;오츠&quot;또는 &quot;이소 데이터&quot;와 같은 다른 임계 절차를 포함한다. 관계없이 최종 분할 절차, 우리는 이미지 오버레이 의해 추출 된 원시 데이터 간의 비교 필수 품질 관리 단계를 고려한다. 요약하면, 각각의 절연 근세포, 세포 TATS 막의 충분한 염색, 형광 촬상 용 파라미터 최적화, 추출 골격 데이터의 오버레이 제어의 형태와 막 무결성 모두 형광 TATS 이미지 및 정량 결과의 품질에 기여한다. 마우스보다 큰 종 세포 분리에 사용하는 경우, 프로토콜은 용이하게 적절히 적용될 수있다. 다음으로 큰 종이를 들어, 쥐의 마음이 무딘 14 G 정맥 (외경 2.1 mm)와 유관 할 수 / 분 8 ML에서 관류. 크게 세 또는 질병 마음 더 큰 정맥의 크기를 필요로 할 수있다. 유전자에RAL 심장 관류는 저장조 및 대동맥 사이 또는 연동 펌프를 사용함으로써 일정한 흐름 1m 높은 물 컬럼을 사용하여, 일정한 압력에 의해, 예를 들면 어느 수행 될 수있다. 콜라게나 소화는 결국 일정한 흐름 프로토콜에 의해 어느 정도 제어됩니다 누출 용기 침대에서 과도한 관류 속도로 최고의 관상 동맥 저항 혈관을 방해하기 때문에 쥐와 쥐 같은 작은 설치류 마음에서 세포 격리를 들어 일정한 흐름이 유리할 수있다. 유량 및 정확한 삽관의 모니터링이 변경된 혈관상 저항 행동 중재 모델뿐만 아니라 세포 격리 절차 훈련 유리하다 우선,하면 반대로 정압 관류 유리하다. 위에서 설명한 바와 같이, 충분한 셀 품질이 내생 멤브레인 시스템의 정량적 연구에 매우 중요합니다. 그러나, 심장 관류 및 콜라게나 소화하는 동안 수많은 요인 CR 수 있습니다itically는 프로토콜 최적화 또는 문제 27 촬영 중 과소 평가해서는 안 세포 격리의 품질에 영향을 미칩니다. 특히, 주어진 콜라게나 로트의 활성 연구의 나머지 부분에 걸쳐 유지 될 관심 예 : 심방 또는 분리 조건을 설정하는 실험 선의 연구의 실행에 앞서 심실의 특정 조직에 대해 결정되어야한다. 또한, 관류 설정의 수질, 산도, 온도, 최적화 및 청소 오염물 및 색전에서 부주의 한 손상의 위험을 최소화하고, 잠재적으로 추가적인 요인은 세포 격리 중에 최적의 항상성의 조건을 확립하기 위해 모니터링되어야한다. BDM (2,3 - 부탄 - monoxime) 마이 오신 ATPase의 크로스 다리의 가역적 억제제는 일반적으로 세포 아이솔레이션의 수율을 증가 심장 근육 이완을 유지하기 위해 조직의 절개 및 소화 중에 사용됩니다. 그럼에도 불구하고, 연구자들은 t 필요오 BDM 오프 대상 효과 예를 들어, 특정 조건 33에서 나 + / 칼슘 교류 전류의 억제로 이어지는 비 특정 포스 파타 아제의 활동을 행사할 수도 있다는 점을 유의해야합니다. 일부의 실험은 독성이 비교적 고가 심정지 솔루션, 그러나,이다 마이크로 몰 농도의 마이 오신에 대한 높은 선호도 억제제로 blebbistatin에 의해 BDM을 대체하는 것이 유리할 수 있습니다 및 기타 오프 대상 영향을 미칠 수 있습니다. 휴식 건강한 심근 추가 분석에서 제외해야 전기 자극하고 세포의 부재에있는 수축을 보여주지해야한다. 한편, 생체 외 칼슘 농도에서 전기 자극에 응답하여 심장 근육 세포의 수축과 이완에 건강 관리 대 심장병 기능성 셀의 품질 및 / 또는 비정상적인 행동을 평가하기 위해 추가적인 수단으로 정상적인 수축 거동을 확립하는데 사용될 수있다 세포. (21)뿐만 아니라 용의 미세 소관 네트워크의 정량 분석을 VM 9 TATS 막 네트워크의 촛점 및 수퍼 해상도 현미경 적용 및 AM되었습니다 고정 심장 근세포 (데이터 미도시). 이러한 서로 다른 발달 단계에서 TATS 멤브레인의 특성 또는 TATS 네트워크를 문의 막 관련 단백질 또는 세포 내 소기관 구조의 분석과 같은 실험 다양한 질문에 대한 길을 열 수있는 프로토콜이와 미래의 응용 프로그램은 매우, 도메인 특정 신호 지역화 발휘 AM 및 VM 세포의 기능을한다.

건강한 횡문근 세포에서 세포 주 축에 수직 &quot;횡&quot;방향 (T-세뇨관)와 관형 막 구조는 풍부하다. 결과적으로, T-세뇨관 깊게 셀 중심쪽으로 세포질 침투 근육 세포 주 &quot;측&quot;표면 막 (sarcolemma)의 지속적인 확장으로 특성화되었다. 외면 막 연속 T-세뇨관의 생리 학적 역할은 전압 - 활성화 된 L-타입 칼슘의 나노 근접 결합에 의해 비교적 큰 심장 근육 세포 부피에 걸쳐 SER 소기관 접촉 영역에 의해 형성 원격 세포 내 구획의 급속한 전기적 결합이다 2+ 채널 인접 ryanodine 수용체 (RyR2) SER 칼슘 릴리스를 활성화 전류 (I CA) 안쪽 (Cav1.2). 접합부의 SER 도메인과 T 사이의 심실 근세포 (VM에), 비 연속 막 친구 ( &quot;접합&quot;)에-tubules는 각 셀에 하나의 개별 세포 내 칼슘 릴리스 nanodomains의 수천을 제어 할 것으로 생각된다. 주어진 도메인에 대해 접촉, 병치 막 부 T-세관과 주연 (접합부) SER 각각은 서로 가까이 15 nm의 nanodomain 그러므로 정의는 대략이다. 따라서, 아주 작은 개인의 세포질 부분 공간은 준 세포 자율 구획 동작을 가능하게하는 분리된다. 들어오는 활동 전위가 VM을, 상대적으로 작은 칼슘의 T-세관에서 Cav1.2 채널을 활성화하면 2 + 안쪽으로 전류가 빠르게 attoliter 크기 nanodomain 하나의 부분 공간 칼슘 농도 [칼슘] S 증가합니다. 다음에, [칼슘] 2 + S 증가 -gated ryanodine 수용체 (RyR2) 병치 SER 막 접합에 나노 미터 근방에서 칼슘을 활성화하고,이 결합 프로세스는 모두 전기적으로 연결 걸쳐 발생D의 심근 nanodomains. RyR2s 5-10 RyR2 채널이 1 Cav1.2 채널 추정 화학량 론과 같은 고밀도 멀티 채널 클러스터를 발생한다. SER 대 세포질 때문에 [CA는 2 +] 구배는 매우 가파른 (비율 10 4 : 1)이고 RyR2s 기능적으로 결합 된 클러스터에서 높은 컨덕턴스 칼슘 방출 채널 기능, 정량적 큰 칼슘에 RyR2 활성화 결과 2+ 1-2 밀리 3,4에서 100 μM 이상으로 [칼슘 2 +] S 지역 부분 공간을 증가 T-세관 결합 접합부의 SER 도메인의 현재 놓습니다. 이 심장 신호 증폭 동작은 또한 칼슘 릴리스 (CICR) 유도 칼슘 2라고합니다. 이와 함께, T-세관 빠르게 여기 수축 (EC) 커플 링 중 접합부 nanodomain의 SER 연락처와 세포 전체 CICR을 통해 칼슘 방출 신호를 활성화 필수적인 막 구조이다. T-세뇨관에 더하여, 축 세뇨관메인 (종 방향) 셀 축에 상당히 상이한 방향에 평행으로 S (A-세뇨관)는 전자 현미경 (EM) 및 공 초점이 광자 현미경 연구에 의해 설명되었다. 예를 들어, 근절의 Z-라인 근처에 T-세관과 상호 근원 섬유 사이의 A-세관의 셀 전체의 연속 격자 세포 추적자 고정 기니 돼지의 VM (5)의 EM 영상으로 표시했다. 세포 외 덱스 트란 연결된 형광 염색법을 사용하여 쥐의 VM의 2 광자 이미징을 살고, 복잡한 망상 3D 세관 네트워크는 ~ 60 % T-세관 및 ~ 40 % A-세관 6 이루어진 시각화했다. 이 연구는 또한 EM 시각화 단면하는 것은 본질적으로 가로 축 세관 시스템 (TATS)와 같은 복잡하고 역동적 막 네트워크의 분석을 위해 제한되어 있음을 실현, 풍부한 A-세관의 3D 시각화에지도하지. 따라서, TATS 세포막의 공 초점 라이브 세포 이미징 직접 염색 디 - 8 - ANNEPS이 개발되었다. 만약 라이브 셀TATS 네트워크는 푸리에 변환에 의해 분석되고, 근절의 Z-선 근처의 공간에서 T-세뇨관 성분의 정규 외관 줄이있는 신호들 (7)의 영역에서 앙상블 파워 스펙트럼에 의해 반사된다. 이 간접 분석 전략은 질병 모델 7 TATS 컴포넌트 규칙에서 셀 전체의 지역 변경을 검출하기 위해 사용되어왔다. 예를 들어, shRNA를 매개 junctophilin-2 노크 다운 심부전 및 이소 특정 단백질 결핍 nanodomain 칼슘 방출 장애 8 T-세관 개편 결과가 발생했습니다. 우리는 최근 직접 정량 방법을 통해 더욱 유도 방출 고갈 (STED) nanoscopy 9를 사용하여 마우스의 VM에서 TATS 개별 성분의 생균 수퍼 해상도 현미경 TATS 막 네트워크 분석을 확장 하였다. 횡 방향의 분포를 대략 50:50 작은 TATS 개별 성분의 직접 분석에 허용 나노 이미지 해상도축 세관 방향 대, 정량적으로 건강한 마우스 마음 9이 풍부한 아직 차동 중심의 개별 TATS 구성 요소를 확인. 이러한 전략은 아래에 더 프로토콜 절에서 설명 될 것이다. 성인 심장의 풍부한 A-세관 구성 요소의 생리 학적 역할은 수수께끼 남아있다하지만, EM 연구는 2 + 내인성 칼슘 기니 돼지와 쥐 VM을 5, 10에서 릴리스 nanodomains을 제안 A-세관과 관련된 SER 막 구조를 설명했다. Cav1.2 RyR2 및 공 촛점 분석은 A-10에 접합 세뇨관 colocalization을 높은 수준을 발견 하였다. VM이 T-세관은 일반적으로 발생하는 Z-라인 줄무늬에서 비교적 멀리 떨어져 유래 쥐에 자연 칼슘 스파크 ~ 20 % 때문에, 하나의 인수는 A-세관 관련 nanodomains이 실제로 존재하고 기능 수있다 칼슘 릴리스 사이트 등 11, 12. 흥미롭게도, T-세관 형성과 성숙 OC단 생후 CURS 및 P5에 전구체 sarcolemmal의 함입의 발아 내지 예 심근 세포의 성장을, 평행 및 미성숙 쥐 13 P10에서 TATS 네트워크 어셈블리 분지. 그것은 Junctophilin-2 shRNA를 노크 다운 이후 출생 TATS 네트워크의 성숙에 중요합니다 지연 칼슘 릴리스와의 미성숙 A-가느 다란 관 지배 구조와 일치 병리학 TATS 조직에 선도적 인 SER 접합에 T-세관 세포막의 고정을 방지 나타납니다 VM을 13. 이러한 관찰은 궁극적으로 개념 증명 T-세관 추가 또는 대체 세포 내 메커니즘 (14)를 통해 변신 할 수 있습니다 A-세관 반면 막 함입의 과정을 통해 형성 될 수 있습니다. 심장 질환의 TATS 막 변화의 특성은 병태 생리 학적 질문에 대한 중요한 연구 분야가되고있다. 페이싱에 의한 심장 failu의 개 모델의 초기 보고서다시 T-세뇨관 Cav1.2 및 전류 (I CA) (15)의 손실을 보였다. 허혈성 심근 병증의 돼지 모델은 T-세관 밀도를 감소 보였다 세포 내 칼슘의 감소 된 동시성 (16)를 해제 2 +. 심부전 자발적으로 고혈압 래트 (SHR) 모델을 이용하여, T-세뇨관의 손실 &quot;orphaning RyR2&quot;의기구에 의해 제안 된 Cav1.2 RyR2과의 커플 링을 감소 nanodomain 연관되었다 (7). T-세관의 손실 또한, 허혈성 확장 성 및 비후성 심근 병증 샘플 17에서 인간의 VM에 표시되어 있습니다. 또한, A-세뇨관의 증가는 인간 동공 심근증 (18)의 조직 섹션에보고 하였다. 심근 경색에 따라, 우리는 A-세뇨관 요소 (9)의 증가에 대비 T-세뇨관의 상당한 감소와 마우스의 VM에서 TATS 재구성 차동기구를 보였다. 중요한 것은, 개선 지역의 막 대비 생균 superre을 통해 달성용액 STED 현미경 전반적인 TATS 네트워크 길이의 증가 및 복잡성 9 분파와 A-세뇨관 상당한 증식을 보였다 직접적인 측정을 통하여 정량 상세한 성분 분석 할 수 있었다. 또한, 심근 경색 19 후 심장 재 동기화 치료는 심방 tachypacing에 의한 심장 마비 (20) 개에 T-세관의 리모델링을 반전으로 이어질 수 있다는 것을 쥐의 T-세관 리모델링을 반전 할 수 있습니다 그 운동 훈련으로 넘어졌습니다. 프로토콜에 설명 아래 부분 결과로 함께 촬영, 병에 걸린 사람과 동물의 VM을뿐만 아니라 잠재적 인 치료 개입의 두 연구는 틀림없이 높은 품질의 세포 격리 절차 및 세부 정량 분석​​ 전략에서 도움이 될 것입니다. KATP 채널의 TATS 막 인신 매매 21 이소 폼 대 측면에 의해 최근에 입증 더욱이, 그것은 심방 m를 고려하는 것이 중요하다yocytes 생물학적으로 구별뿐만 아니라 VM을 대 비교 심장 세포 모델로 (AMS). T-세관은 최근 양, 인간의 AMS (22)에 설명 하였다. 현재 증거는 몇 T-세관이 작은 설치류 (23) 양, 인간,하지만 같은 큰 포유 동물에서 일반적으로 AM 세포에 존재하는 것이 좋습니다. VM을 달리 AMS에서 세포 내 칼슘 방출 2+ 표시 시공간 칼슘 결과 23 그라디언트 셀 중심을 향해 확산에 의해 세포 표면에서 발생하는 전파 나타난다. 이 프레임 워크 내에서 그와 같은 심방 세동 (24)로 세포 내 칼슘 일반적인 질병 형태의 불안정성 신호의 메커니즘을 규명하는 것이 중요 보인다. 요약하면, 건강하고 병에 걸린 마음 모두 AM 및 VM 세포 분리 및 각 일반적으로 프로토콜을 사용된다. 충분한 셀 품질의 미세한 문서에 의해 판단으로 세포 격리가 제대로 수행되는 경우에만, AM 및 VM 샘플은 캘리포니아해야양적 TATS 분석을 위해 앞으로 rried. 따라서, 다음과 같은 프로토콜 섹션은 마우스 또는 그대로 TATS 세포막을 분석하는 라이브 셀 현미경으로 다음에 다른 종에서 분리 된 높은 품질의 세포에 매우 의존한다. 이전에 지적한 바와 같이, TATS 멤브레인의 특성은 고정 및 준비 유물 6, 삼투압 변화로 인해 막 변경 및 기존의 광학 현미경 9의 해상도 제한에 대한 성향을 가진 도전적인 연구 영역이다. 우리는 칼슘 이미징 및 패치 클램프 및 세포 배양에 대한 쥐의 VM 인간의 AMS의 분리를위한 최근의 최첨단 프로토콜 이전에이 일기 (25), (26)에 발표되었다 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1552">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Chemicals and enzymes</td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td style="width:759px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">2,3-Butanedione monoxime</td>
			<td style="width:376px;">Sigma-Aldrich, Munich, Germany</td>
			<td style="width:113px;">B0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Bovine calf serum</td>
			<td style="width:376px;">Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td>
			<td style="width:113px;">SH30073</td>
			<td>Triple 0.1 &#181;m sterile filtered.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">CaCl2</td>
			<td style="width:376px;">Sigma-Aldrich, Munich, Germany</td>
			<td style="width:113px;">21115</td>
			<td style="width:759px;">Diluted 1:10 in MQ water to obtain 100 mM CaCl2 stock concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Collagenase type II</td>
			<td style="width:376px;">Worthington via Cell Systems, Troisdorf, Germany</td>
			<td style="width:113px;">on request</td>
			<td>Enzymatic activity depends on individual collagenase batches. Collagenase II&#160; and other enzyme activities (Caseinase, Clostripain, Tryptic) can be assessed in the &#34;collagenase lot selection tool&#34;. Determine cell yield and quality individually for each new lot of collagenase.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Glucose</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">HN06.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Heparin</td>
			<td style="width:376px;">Rotexmedica, Trittau, Germany</td>
			<td style="width:113px;">PZN-03862340</td>
			<td>Diluted in 0,9 % NaCl and injected subcutaneuosly in abdominal skin.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">HEPES</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">9105.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Forene 100% (V/V)</td>
			<td style="width:376px;">Abbott, Libertyville, IL, USA</td>
			<td style="width:113px;">B506</td>
			<td>Active agent: isoflurane, 250 ml. Use approximately 2 Vol% in air/oxygen dispenser instrument.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">KCl</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">6781.3</td>
			<td style="width:759px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">3904.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Laminin (2 mg/ml)</td>
			<td style="width:376px;">BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:113px;">354232</td>
			<td>Lamination is described under step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">MgCl2 &#183; 6 H2O</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">2189.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">MgSO4 &#183; 7 H2O</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">8283.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Na2HPO4 &#183; 2 H2O</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">4984.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">HN01.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Taurin</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">4721.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;"></td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Dyes</td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Di-8-ANEPPS</td>
			<td>Molecular Probes, Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:113px;">D-3167</td>
			<td>Stock solution 2 mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:376px;">Sigma-Aldrich, Munich, Germany</td>
			<td style="width:113px;">T8154</td>
			<td>Trypan blue is gently mixed 1:1 via tip-cut 1 ml plastic pipette with cell suspension prior to cell counting in Neubauer cytometer.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;"></td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Langendorff perfusion setup</td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Circulation thermostat</td>
			<td style="width:376px;">Lauda, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>Please refer to Louch et al. (JMCC 2011). Heat up thermostat und buffers in perfusion tubing to 37 &#176;C 15 min prior to use.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Flexible silicone tubing Tygon for peristaltic pump</td>
			<td style="width:376px;">VWR, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:113px;">224-2252</td>
			<td rowspan="2">Tubing needs to be changed regularly.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Flexible silicone tubing Tygon for thermostat</td>
			<td style="width:376px;">VWR, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:113px;">228-4340</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:304px;">Heating coil surroundung perfusion tubing</td>
			<td style="width:376px;">Rettberg, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td style="width:113px;">custom-made</td>
			<td style="width:759px;">Heating coil and tubing needs to be cleaned thoroughly via MQ water after using. Do not use detergents. Glass components should be bathed regularly&#160; in 10 mM NaOH overnight.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:376px;">Ismatec, Wertheim, Germany</td>
			<td style="width:113px;">ISM830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Three way stop cock Discofix C Luer Lock 10 cm</td>
			<td style="width:376px;">Braun, Melsungen, Switzerland</td>
			<td style="width:113px;">16500C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Three way stop cock Discofix 3SC</td>
			<td style="width:376px;">Braun, Melsungen, Switzerland</td>
			<td style="width:113px;">4095146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;"></td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Instruments</td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">42 mm glass coverslips</td>
			<td style="width:376px;">Menzel Gl&#228;ser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td>
			<td style="width:113px;">on request</td>
			<td>0.13 - 0.16 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Cannula 21G</td>
			<td style="width:376px;">Becton, Dickinson and Company, Franklin Lake, NY, USA</td>
			<td style="width:113px;">304432</td>
			<td>Cut to a length of ~ 5 mm, roughened with sandpaper.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Coverslips for Neubauer cytometer 24 x 24 mm</td>
			<td style="width:376px;">Menzel Gl&#228;ser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td>
			<td style="width:113px;">on request</td>
			<td>0.38 - 0.42 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Graefe forceps, 0.5 mm tips, slight curve</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11151-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">LSM 710 NLO</td>
			<td style="width:376px;">Carl Zeiss, Jena, Germany</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>63x 1.4 NA oil objective</td>
		</tr>
		<tr height="124">
			<td height="124" style="height:124px;width:304px;">Neubauer improved cytometer</td>
			<td style="width:376px;">Labor Optik, Friedrichsdorf, Germany</td>
			<td style="width:113px;">1100000</td>
			<td style="width:759px;">Counting procedure: Wipe cytometer and coverslip provided with the counting chamber with 70 % ethanol. Press coverslip gently on the counting chamber so that the two glass surfaces are in contact and Newton&#39;s rings can be observed. Subsequently, 10 - 20 &#181;l cell suspension can be applied to the edge of the coverslip to be sucked into the void by capillary action. Count the intact vs. defect myocytes using the squares of the cytometer grid which reflects 100 nl. Repeat counting procedure on the second grid provided on the cytometer. Calculate the density of cells in your original cell suspension by taking account of any dlutions and counting shortcuts.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">POC-R2 Imaging Chamber</td>
			<td style="width:376px;">Pecon, Erbach, Germany</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>Cell suspension volume: 800 &#181;l; desired plating density: ~ 1000 AM and ~ 10,000 VM</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Spring scissors, 8 mm blades straight, blunt</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:113px;">15025-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Student dumont #7 forceps, inox</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>91197-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Student iris scissors, curved, 11.5 cm</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>91461-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Student iris scissors, straight, 11.5 cm</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Student surcigal scissors, straight, sharp, 12 cm</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>91402-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Tissue forceps, 1x2 teeth, slim, 10 cm</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11023-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of tubular membrane networks in cardiac myocytes from atria and ventricles

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. While the outer surface membrane and associated TATS membrane components appear to be continuous, there are substantial differences in lipid and protein content. In ventricular myocytes (VMs), certain TATS components are highly abundant contributing to rectilinear tubule networks and regular branching 3D architectures. It is thought that peripheral TATS components propagate action potentials from the cell surface to thousands of remote intracellular sarcoendoplasmic reticulum (SER) membrane contact domains, thereby activating intracellular Ca2+ release units (CRUs). In contrast to VMs, the organization and functional role of TATS membranes in atrial myocytes (AMs) is significantly different and much less understood. Taken together, quantitative structural characterization of TATS membrane networks in healthy and diseased myocytes is an essential prerequisite towards better understanding of functional plasticity and pathophysiological reorganization. Here, we present a strategic combination of protocols for direct quantitative analysis of TATS membrane networks in living VMs and AMs. For this, we accompany primary cell isolations of mouse VMs and/or AMs with critical quality control steps and direct membrane staining protocols for fluorescence imaging of TATS membranes. Using an optimized workflow for confocal or superresolution TATS image processing, binarized and skeletonized data are generated for quantitative analysis of the TATS network and its components. Unlike previously published indirect regional aggregate image analysis strategies, our protocols enable direct characterization of specific components and derive complex physiological properties of TATS membrane networks in living myocytes with high throughput and open access software tools. In summary, the combined protocol strategy can be readily applied for quantitative TATS network studies during physiological myocyte adaptation or disease changes, comparison of different cardiac or skeletal muscle cell types, phenotyping of transgenic models, and pharmacological or therapeutic interventions.

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Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

심장 근육 세포에서 관형 막 구조가 세포 내 네트워크를 형성한다. 우리는 품질 관리, 최첨단 형광 현미경 II) 살아있는 세포 염색을 포함하여 마우스의 심장에서 심근 세포의 난) 절연을위한 프로토콜을 최적화 대해 설명하고, ⅲ) 직접 이미지 분석은 구성 요소의 복잡성과 세포 멤브레인의 가소성을 정량화하기 네트워크.

심방과 심실에서 심장 근육 세포에 관형 막 네트워크 분석

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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연구

생체공학

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매개 변수화 이완기 충전 형식주의를 통해 Transmitral 흐름의 운동 학적 모델링 기반의 분석에 의하여 세계적인 이완기 기능의 정량화

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