Name: analysis of tubular membrane networks in cardiac myocytes from atria and ventricles
Uploaded: 2014-10-15T13:00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles at JoVE.com

This work received support through Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 1002 (subprojects A05 and B05 to S.E.L.) and KFO 155 (subproject 4 to S.E.L.), a Halbach Foundation award to S.E.L. supporting E.W.; a grant from the German Cardiac Society to S.B.; and a DAAD exchange program supporting T.K. as visitor at the University of Maryland. The research leading to these results has received funding from the European Community&#8217;s Seventh Framework Program FP7/2007-2013 under grant agreement No. HEALTH-F2-2009-241526, EUTrigTreat (to S.E.L.). S.E.L. is a principal investigator of the German Center of Cardiovascular Research (DZHK).

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The authors declare that no conflict of interest exists.

En las células del músculo estriado sanos, estructuras de membrana tubulares con orientaciones &quot;transversales&quot; (T-túbulos) perpendiculares al eje de células principales son abundantes. En consecuencia, los túbulos T se han caracterizado como extensiones continuas de la célula muscular principal &quot;lateral&quot; membrana de la superficie (sarcolema), que penetran profundamente el citosol hacia el centro de la celda. El papel fisiológico de los túbulos T continuo con la membrana de la superficie exterior es el acoplamiento eléctrico rápido de los compartimentos intracelulares remotas formadas por dominios de contacto de orgánulos SER en todo el volumen relativamente grande de células del músculo cardiaco por acoplamiento de proximidad nanométrica de voltaje activado de tipo L de Ca 2 + canales (Cav1.2) corriente de entrada (I Ca) activación de los receptores de rianodina adyacente (RyR2) SER Ca 2 + comunicados. En miocitos ventriculares (VM), los contactos de membrana no continuos (&quot;uniones&quot;) entre los dominios de unión de SER y T-tubules se cree que controlar miles de nanodominios liberación de Ca2 + intracelular individuales en cada celda 1. Para cualquier dominio contacto dado, las porciones de membrana yuxtapuestos cada uno de los T-túbulos y el periférico (unión) SER son aproximadamente 15 nm cerca uno del otro, por lo tanto, se define como nanodomain. De esta manera, muy pequeñas subespacios citoplasmáticos individuales son segregados que permiten comportamientos compartimiento células autónomas cuasi. Cuando un potencial de acción entrante activa los canales Cav1.2 en los túbulos T de máquinas virtuales, una parte relativamente pequeña de Ca2 + hacia adentro corriente aumentará rápidamente el subespacio concentración de Ca2 + [Ca 2 +] S en el attoliter nanodomain tamaño 1. A continuación, la [Ca 2 +] S aumento de Ca2 + activa los receptores de rianodina -gated (RyR2) dentro de la proximidad del nanómetro en la unión entre la membrana SER yuxtapuesta, y este proceso de acoplamiento se produce a lo largo de toda pareja eléctricamented miocitos nanodominios. RyR2s producen racimos de múltiples canales como densas con una estequiometría estimado de 1 canal Cav1.2 durante 5-10 RyR2 canales 2. Desde la SER-a citosol [Ca 2 +] gradiente es muy empinada (relación 10 4: 1) y RyR2s funcionan como alta conductancia Ca 2 + canales de liberación de los clústeres funcionalmente acoplados, RyR2 activación resulta en una gran cuantitativamente Ca 2 + versión actual de T-túbulos junto dominios SER unión crecientes subespacial local de [Ca 2 +] S 100 M o superior dentro de 1-2 ms 3,4. Este comportamiento amplificación de la señal cardiaca también se conoce como Ca 2 + inducida por Ca 2 + en libertad (CICR). Tomados en conjunto, los túbulos T son esenciales estructuras de membrana que activan rápidamente las señales de liberación de Ca 2 + a través de contactos SER nanodomain de unión y CICR ​​en toda la célula durante la excitación-contracción de acoplamiento (CE). Además de los túbulos T, túbulo axials (A-túbulos) con una orientación significativamente diferente paralela a las principales (longitudinal) del eje de células han sido documentados por microscopía electrónica (EM), y estudios de microscopía confocal de 2 fotones. Por ejemplo, una red continua de toda la célula de A-túbulos entre miofibrillas interconectados con T-túbulos cerca sarcómero Z-líneas se demostró por trazadores extracelulares y EM imágenes de conejillo de indias fijo VM 5. Uso de la tinción con fluoresceína dextrano ligado extracelular y vivir de imágenes 2-fotón de rata máquinas virtuales, una red de túbulos 3D reticular complejo se visualizó que consiste en ~ 60% túbulos T y ~ 40% A-túbulos 6. Este estudio no sólo llevó a la visualización en 3D de abundantes A-túbulos, sino también a la comprensión de que el corte para la visualización EM está inherentemente limitado para el análisis de redes complejas y dinámicas de membrana como el sistema túbulo-transversal axial (TATS). En consecuencia, confocal imágenes de células vivas de las membranas TATS directamente manchada con di-8-ANNEPS fue desarrollado. Si de células vivasRedes TATS se analizaron por transformación de Fourier, el aspecto habitual de componentes túbulo-T en el espacio cerca del sarcómero líneas z se refleja en el espectro de potencia de conjunto de una región de señales estriados 7. Esta estrategia de análisis indirecto se ha utilizado para detectar cambios regionales en todo el componente de células en la regularidad TATS en modelos de enfermedad 7. Por ejemplo, shRNA mediada junctophilin-2 derribo provocó insuficiencia cardíaca y la deficiencia de proteína específica isoforma resultaron en reorganización T-túbulos con nanodomain Ca 2 + disfunción versión 8. Recientemente hemos ampliado el análisis de las redes de membrana TATS a través de enfoques cuantitativos directos y aún más por microscopia de super-resolución de células vivas de los componentes individuales en TATS ratón máquinas virtuales utilizando el agotamiento de la emisión estimulada (STED) nanoscopía 9. Resolución de imagen nanométrica permitido para el análisis directo de los componentes TATS individuo más pequeños, que se aproximan una distribución 50:50 de transversalfrente a las orientaciones del túbulo axiales, confirmando cuantitativamente dos componentes TATS abundantes todavía orientados diferencialmente individuales en corazones sanos ratón 9. Estas estrategias se describen con más detalle en la sección del protocolo de abajo. Aunque el papel fisiológico de los abundantes componentes A-túbulos en el corazón adulto se ha mantenido enigmático, EM estudios han documentado estructuras de membrana SER asociados con A-túbulos que sugieren endógena Ca 2 + nanodominios liberación en cobaya y rata VMs 5,10. Confocal análisis de Cav1.2 y RyR2 encontró un alto grado de colocalización en las uniones A-túbulo 10. Desde ~ 20% de los espontáneos Ca 2 + chispas en rata VMs originó relativamente lejos de estrías Z-línea donde normalmente se producen túbulos T, un argumento ha sido que, efectivamente, pueden existir y funcionar nanodominios A-túbulo asociados como Ca 2 + sitios de liberación 11,12. Curiosamente, la formación de túbulos T-OC y la maduracióncurs sólo después del nacimiento y es paralelo al crecimiento de las células cardíacas, por ejemplo, a través de la brotación de invaginaciones del sarcolema precursor en P5 y inmadura ramificados asambleas red TATS en P10 en ratones 13. Parece que Junctophilin-2 es particularmente importante para la maduración postnatal red TATS desde shRNA knock-down impidió que el anclaje de las membranas de los túbulos T-SER a los cruces que conduce a un retraso en la liberación de Ca2 + y la organización TATS patológicas compatibles con arquitecturas inmaduros A-túbulo dominadas en VM 13. Estas observaciones pueden en última instancia conducir a una prueba de concepto de que los túbulos T se forman a través de procesos de invaginación de la membrana, mientras que A-túbulos pueden transformarse a través de mecanismos intracelulares adicionales o incluso alternativas 14. Caracterización de TATS cambios de membrana en las enfermedades del corazón se ha convertido en un área de investigación importante para cuestiones fisiopatológicas. Los informes iniciales en un modelo canino de estimulación inducida failu corazónre mostraron una pérdida de túbulos T y actual Cav1.2 (I Ca) 15. Un modelo de cerdo de miocardiopatía isquémica demostraron una reducción de la densidad de los túbulos-T y una sincronía reducido intracelular de Ca 2 + en libertad 16. Utilizando un modelo de ratas espontáneamente hipertensas (SHR) de la insuficiencia cardíaca, una pérdida de túbulos T se asoció con una reducción de acoplamiento nanodomain de Cav1.2 y RyR2 por el mecanismo propuesto de &quot;RyR2 orfandad&quot; 7. Una pérdida de túbulos T también se ha demostrado en las VM humana a partir de muestras de miocardiopatía isquémica, dilatadas, hipertróficas y 17. Además, se informó de un aumento de la A-túbulos en secciones de tejido de miocardiopatía dilatada humana 18. A raíz de un infarto de miocardio, mostramos un mecanismo diferencial de TATS reorganización en ratón VM con disminuciones significativas de los túbulos T, en contraste con los aumentos de los componentes A-túbulo 9. Es importante destacar que, la mejora de contraste local de lograrse a través de la membrana de células vivas superresolución STED microscopía de activar el análisis de componentes cuantitativa detallada a través de mediciones directas, que mostraron una proliferación significativa de la A-túbulos con aumentos globales de la longitud de la red TATS y complejidad de ramificación 9. Además, se demostró que el entrenamiento físico puede revertir la remodelación T-túbulo en ratas después de infarto de miocardio 19 y que la terapia de resincronización cardiaca puede conducir a revertir la remodelación de los túbulos T en perros con insuficiencia inducida tachypacing fibrilación corazón 20. En conjunto, los estudios tanto en las intervenciones terapéuticas potenciales humano enfermo y animal máquinas virtuales, así como posiblemente se beneficiarán de los procedimientos de aislamiento de células de alta calidad y estrategias de análisis cuantitativos detallados como se indica en el protocolo y los resultados de las secciones a continuación. Además, como se ha demostrado recientemente por superficie lateral frente TATS el tráfico de membrana de canal de KATP isoformas 21, es importante tener en cuenta m fibrilaciónyocytes (AMS) como biológicamente diferentes, así como comparativas modelo celular cardiaca frente a las máquinas virtuales. T-túbulos fueron recientemente documentados en ovejas y acompañamiento humano 22. La evidencia actual sugiere que existen pocos túbulos T en células de AM y normalmente en los mamíferos más grandes, como las ovejas y los seres humanos, pero no en los roedores pequeños 23. A diferencia de las máquinas virtuales, en los AM aparece intracelular de Ca 2 + liberación se produzca a partir de la propagación de la superficie celular por difusión hacia el centro de la celda que se traduce en marcado Ca espacial y temporal 2 + gradientes 23. Dentro de este marco parece importante dilucidar los mecanismos de Ca 2 + señalización intracelular inestabilidad de las formas de enfermedades comunes tales como la fibrilación auricular 24. En resumen, tanto el aislamiento de células AM y VM y cada uno de los corazones sanos y enfermos se emplean comúnmente protocolos. Sólo si el aislamiento de células se hace correctamente, a juzgar por la documentación microscópico de calidad suficiente de células, las muestras de AM y VM deben ser carried hacia adelante para el análisis cuantitativo TATS. Por consiguiente, las siguientes secciones de protocolo son críticamente dependientes de células de alta calidad aislados de ratón o de otras especies, seguido por microscopia de células vivas para analizar las membranas intactas TATS. Como se ha señalado anteriormente, la caracterización de membranas TATS es un área de investigación difícil, con una propensión a la fijación y preparación de artefactos 6, los cambios de la membrana debido a alteraciones osmóticos y limitaciones de la resolución de la microscopía de luz convencional 9. Tomamos nota de que los protocolos recientes del estado de la técnica para el aislamiento de los AM humanos de Ca 2 + de imágenes y patch-clamp y de rata máquinas virtuales para el cultivo celular se han publicado previamente en esta revista 25,26.

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		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Chemicals and enzymes</td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td style="width:759px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">2,3-Butanedione monoxime</td>
			<td style="width:376px;">Sigma-Aldrich, Munich, Germany</td>
			<td style="width:113px;">B0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Bovine calf serum</td>
			<td style="width:376px;">Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td>
			<td style="width:113px;">SH30073</td>
			<td>Triple 0.1 &#181;m sterile filtered.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">CaCl2</td>
			<td style="width:376px;">Sigma-Aldrich, Munich, Germany</td>
			<td style="width:113px;">21115</td>
			<td style="width:759px;">Diluted 1:10 in MQ water to obtain 100 mM CaCl2 stock concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Collagenase type II</td>
			<td style="width:376px;">Worthington via Cell Systems, Troisdorf, Germany</td>
			<td style="width:113px;">on request</td>
			<td>Enzymatic activity depends on individual collagenase batches. Collagenase II&#160; and other enzyme activities (Caseinase, Clostripain, Tryptic) can be assessed in the &#34;collagenase lot selection tool&#34;. Determine cell yield and quality individually for each new lot of collagenase.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Glucose</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">HN06.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Heparin</td>
			<td style="width:376px;">Rotexmedica, Trittau, Germany</td>
			<td style="width:113px;">PZN-03862340</td>
			<td>Diluted in 0,9 % NaCl and injected subcutaneuosly in abdominal skin.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">HEPES</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">9105.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Forene 100% (V/V)</td>
			<td style="width:376px;">Abbott, Libertyville, IL, USA</td>
			<td style="width:113px;">B506</td>
			<td>Active agent: isoflurane, 250 ml. Use approximately 2 Vol% in air/oxygen dispenser instrument.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">KCl</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">6781.3</td>
			<td style="width:759px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">3904.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Laminin (2 mg/ml)</td>
			<td style="width:376px;">BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:113px;">354232</td>
			<td>Lamination is described under step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">MgCl2 &#183; 6 H2O</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">2189.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">MgSO4 &#183; 7 H2O</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">8283.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Na2HPO4 &#183; 2 H2O</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">4984.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">HN01.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Taurin</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">4721.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;"></td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Dyes</td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Di-8-ANEPPS</td>
			<td>Molecular Probes, Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:113px;">D-3167</td>
			<td>Stock solution 2 mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:376px;">Sigma-Aldrich, Munich, Germany</td>
			<td style="width:113px;">T8154</td>
			<td>Trypan blue is gently mixed 1:1 via tip-cut 1 ml plastic pipette with cell suspension prior to cell counting in Neubauer cytometer.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;"></td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Langendorff perfusion setup</td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Circulation thermostat</td>
			<td style="width:376px;">Lauda, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>Please refer to Louch et al. (JMCC 2011). Heat up thermostat und buffers in perfusion tubing to 37 &#176;C 15 min prior to use.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Flexible silicone tubing Tygon for peristaltic pump</td>
			<td style="width:376px;">VWR, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:113px;">224-2252</td>
			<td rowspan="2">Tubing needs to be changed regularly.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Flexible silicone tubing Tygon for thermostat</td>
			<td style="width:376px;">VWR, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:113px;">228-4340</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:304px;">Heating coil surroundung perfusion tubing</td>
			<td style="width:376px;">Rettberg, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td style="width:113px;">custom-made</td>
			<td style="width:759px;">Heating coil and tubing needs to be cleaned thoroughly via MQ water after using. Do not use detergents. Glass components should be bathed regularly&#160; in 10 mM NaOH overnight.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:376px;">Ismatec, Wertheim, Germany</td>
			<td style="width:113px;">ISM830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Three way stop cock Discofix C Luer Lock 10 cm</td>
			<td style="width:376px;">Braun, Melsungen, Switzerland</td>
			<td style="width:113px;">16500C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Three way stop cock Discofix 3SC</td>
			<td style="width:376px;">Braun, Melsungen, Switzerland</td>
			<td style="width:113px;">4095146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;"></td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Instruments</td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">42 mm glass coverslips</td>
			<td style="width:376px;">Menzel Gl&#228;ser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td>
			<td style="width:113px;">on request</td>
			<td>0.13 - 0.16 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Cannula 21G</td>
			<td style="width:376px;">Becton, Dickinson and Company, Franklin Lake, NY, USA</td>
			<td style="width:113px;">304432</td>
			<td>Cut to a length of ~ 5 mm, roughened with sandpaper.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Coverslips for Neubauer cytometer 24 x 24 mm</td>
			<td style="width:376px;">Menzel Gl&#228;ser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td>
			<td style="width:113px;">on request</td>
			<td>0.38 - 0.42 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Graefe forceps, 0.5 mm tips, slight curve</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11151-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">LSM 710 NLO</td>
			<td style="width:376px;">Carl Zeiss, Jena, Germany</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>63x 1.4 NA oil objective</td>
		</tr>
		<tr height="124">
			<td height="124" style="height:124px;width:304px;">Neubauer improved cytometer</td>
			<td style="width:376px;">Labor Optik, Friedrichsdorf, Germany</td>
			<td style="width:113px;">1100000</td>
			<td style="width:759px;">Counting procedure: Wipe cytometer and coverslip provided with the counting chamber with 70 % ethanol. Press coverslip gently on the counting chamber so that the two glass surfaces are in contact and Newton&#39;s rings can be observed. Subsequently, 10 - 20 &#181;l cell suspension can be applied to the edge of the coverslip to be sucked into the void by capillary action. Count the intact vs. defect myocytes using the squares of the cytometer grid which reflects 100 nl. Repeat counting procedure on the second grid provided on the cytometer. Calculate the density of cells in your original cell suspension by taking account of any dlutions and counting shortcuts.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">POC-R2 Imaging Chamber</td>
			<td style="width:376px;">Pecon, Erbach, Germany</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>Cell suspension volume: 800 &#181;l; desired plating density: ~ 1000 AM and ~ 10,000 VM</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Spring scissors, 8 mm blades straight, blunt</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:113px;">15025-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Student dumont #7 forceps, inox</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>91197-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Student iris scissors, curved, 11.5 cm</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>91461-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Student iris scissors, straight, 11.5 cm</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Student surcigal scissors, straight, sharp, 12 cm</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>91402-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Tissue forceps, 1x2 teeth, slim, 10 cm</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11023-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of tubular membrane networks in cardiac myocytes from atria and ventricles

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. While the outer surface membrane and associated TATS membrane components appear to be continuous, there are substantial differences in lipid and protein content. In ventricular myocytes (VMs), certain TATS components are highly abundant contributing to rectilinear tubule networks and regular branching 3D architectures. It is thought that peripheral TATS components propagate action potentials from the cell surface to thousands of remote intracellular sarcoendoplasmic reticulum (SER) membrane contact domains, thereby activating intracellular Ca2+ release units (CRUs). In contrast to VMs, the organization and functional role of TATS membranes in atrial myocytes (AMs) is significantly different and much less understood. Taken together, quantitative structural characterization of TATS membrane networks in healthy and diseased myocytes is an essential prerequisite towards better understanding of functional plasticity and pathophysiological reorganization. Here, we present a strategic combination of protocols for direct quantitative analysis of TATS membrane networks in living VMs and AMs. For this, we accompany primary cell isolations of mouse VMs and/or AMs with critical quality control steps and direct membrane staining protocols for fluorescence imaging of TATS membranes. Using an optimized workflow for confocal or superresolution TATS image processing, binarized and skeletonized data are generated for quantitative analysis of the TATS network and its components. Unlike previously published indirect regional aggregate image analysis strategies, our protocols enable direct characterization of specific components and derive complex physiological properties of TATS membrane networks in living myocytes with high throughput and open access software tools. In summary, the combined protocol strategy can be readily applied for quantitative TATS network studies during physiological myocyte adaptation or disease changes, comparison of different cardiac or skeletal muscle cell types, phenotyping of transgenic models, and pharmacological or therapeutic interventions.

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Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

En los miocitos cardíacos, estructuras tubulares de membrana forman redes intracelulares. Se describen protocolos para i) el aislamiento de los miocitos de corazón de ratón, incluyendo el control de calidad, ii) la tinción de células vivas para la microscopía de fluorescencia estado-of-the-art optimizado, y iii) el análisis de imagen directa para cuantificar la complejidad de los componentes y la plasticidad de la membrana intracelular redes.

Análisis de Redes Tubular membrana en miocitos cardiacos de aurículas y los ventrículos

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

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